Summary
Bu protokolün amacı, düşük seviyeli toksik maruziyetin, karaciğer hasarına neden olmayan, daha çok önceden var olan karaciğer hasarını şiddetlendiren bir murine modeli geliştirmekti. Bu paradigma daha iyi insan maruziyeti ve güvenli olarak kabul edilir toksik konsantrasyonlara maruz kalma üzerine meydana gelen ince değişiklikleri özetler.
Abstract
Vinil klorür (VC), bol bir çevresel kirletici, yüksek seviyelerde steatohepatit neden olur, ancak düşük seviyelerde güvenli olarak kabul edilir. Çeşitli çalışmalar doğrudan hepatotoksik olarak VC rolünü araştırdı rağmen, VC diğer faktörlere karaciğer duyarlılığını değiştirir kavramı, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi (NAFLD) yüksek yağlı diyet neden (HFD) yenidir. Bu protokol, vc kronik, düşük seviyeli maruz ilerleme etkilerini değerlendirmek için bir pozlama paradigması açıklar. Fareler inhalasyon maruz kalma başlamadan bir hafta önce düşük yağlı veya yüksek yağlı diyet alışılmış ve deney boyunca bu diyetler üzerinde kalır. Fareler VC'ye (sub-OSHA seviyesi: <1 ppm) veya soluma odalarında ki oda havasına 6 saat/gün, 5 gün/hafta boyunca 12 haftaya kadar maruz kalırlar. Hayvanlar vücut ağırlığı alımı ve gıda tüketimi için haftalık olarak izlenir. VC maruz kalma Bu model tek başına VC inhalasyonu ile hiçbir net karaciğer hasarına neden olur. Ancak, VC ve HFD kombinasyonu önemli ölçüde karaciğer hastalığı artırır. Bu co-pozlama modelinin teknik bir avantajı tüm vücut maruz kalma, kısıtlama olmadan. Ayrıca, koşullar daha yakından altta yatan alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı ile VC kombine maruz kalma çok yaygın bir insan durumuna benzer ve bu nedenle VC obezite nin bir komplikasyonu olarak karaciğer hasarı gelişimi için bir çevresel risk faktörü olduğu yeni hipotezi destek (yani, NAFLD). Bu çalışma, VC'nin (mesleki ve çevresel) mevcut maruz kalma sınırlarının güvenli olduğu paradigmasını zorlar. Bu modelin kullanımı VC maruz kalma riskleri yeni ışık ve endişe tutabilir. Toksik kaynaklı karaciğer hasarı Bu model diğer uçucu organik bileşikler için kullanılabilir ve karaciğer ve diğer organ sistemlerini etkileyebilecek diğer etkileşimleri incelemek için.
Introduction
Soluduğumuz havada çok düşük seviyelerde çok sayıda toksikmadde bulunur. Vinil klorür (VC) polivinil klorür (PVC) plastik ürünler1oluşturmak için sanayi tarafından kullanılan monomerik gazdır. Yaygın bir çevresel hepatotoksik, bilinen karsinojen, ve ATSDR Tehlikeli Madde Öncelik Listesi #4 sırada yer alıyor2. Daha iyi insan sağlığı ve mevcut co-morbiditeler ile etkileşimleri üzerindeki toksik etkileri anlamak için, insan maruziyeti taklit maruz kalma modelleri kurulması çok önemlidir. Bu grubun birincil ilgi düşük konsantrasyonlarda kronik VC maruziyetinin hepatik etkilerini incelemektir. VC karaciğer üzerinde ana etkileri uygular , nerede gösterilmiştir (yüksek konsantrasyonlarda) steatoz neden olduğu, ve toksik ilişkili steatohepatit (TASH) nekroz ile, fibrozis, siroz3,4, yanı sıra hepatosellüler karsinom (HCC) ve aksi takdirde son derece nadir hepatik hemanjiyosarkom5. TASH muhtemelen on yıllardır nüfus var ama tanımsız kaldı ve müfettişler tarafından az takdir4,6. VC maruziyeti için doğrudan toksisite endişeleri gösteren araştırma sonucunda, İş Güvenliği ve Sağlık İdaresi (OSHA) bir 8 saat iş günü7üzerinde 1 ppm kabul edilebilir maruz kalma eşiği indirdi . Maruz kalma eşiği düşürülmesine rağmen, insan sağlığı vc bu konsantrasyonun etkisi belirsizdir7. Ayrıca, karaciğer hastalığı gibi mevcut komorbiditeler üzerinde VC maruziyetinin etkisi büyük ölçüde bilinmemektedir8. Bu bilgi boşluğu özellikle alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NALFD)4,6,7,9,10,11,12artan küresel yaygınlığı nedeniyle bugün önemlidir. Önemli olarak, VC son zamanlarda diğer nedenlerden karaciğer hastalığı için bağımsız bir risk faktörü olduğu gösterilmiştir13. Bu protokolün amacı bu nedenle uçucu çevresel toksik maruzkalma için ilgili bir inhalasyon modeli geliştirmek oldu, altta yatan karaciğer hasarı bağlamında VC, insan maruziyeti taklit etmek ve potansiyel belirlemek için, VC kaynaklı veya VC-gelişmiş karaciğer hasarı yeni mekanizmaları.
Birçok çevresel toksik ve kirleticiler için maruz kalma ana yolu teneffüs yoluyla. Bir kez solunan, bileşik akciğerler yoluyla sistemik dolaşıma girebilir, karaciğere seyahat, ve metabolik karaciğer enzimleri tarafından aktive hale önceatılır 14,15,16. Genellikle vücutta toksisite ve hasara neden olan bu aktif metabolitleridir. Bu grup ve diğerleri tarafından önceki çalışmalarVC gaz maruz kalma için vekilleri olarak VC metabolitleri kullandık17,18. Diğer gruplar VC inhalasyon modelleri kullandık; ancak akut toksisite, şiddetli hepatik yaralanma ve tümörgelişimineneden olmak için son derece yüksek maruziyet düzeyleri (>50 ppm) uygulanmıştır. Bu çalışmalar VC kaynaklı karsinojenite önemli bilgi ve mekanizmaları sağlamış olsa da, diğer katkıda bulunan faktörler ile ince etkileri ve karmaşık etkileşimleri özetlemek yok ve bu nedenle daha az insan maruz kalma ile ilgilidir.
VC-inhalasyon artı yüksek yağlı diyet (HFD) modeli burada açıklanan (zaman çizelgesi için Şekil 1 bakınız), kronik ilk modelidir, düşük doz VC maruz kalma (yani, alt-OSHA konsantrasyonu), hangi fareler çok daha yakından insan pozlama taklit koşulları altında toksik maruz kalmaktadır. Nitekim, Bu modelden elde edilen veriler vc maruz insanlarda gözlenen sonuçlar recapitulated, metabolik yollar üzerindeki etkisi gibi20, oksidatif stres ve mitokondriyal disfonksiyon4. Sadece kafa ve buruna özel modeller21gibi diğer fare teneffüs modelleri, hayvanın dizginlenedilmesini ve hayvana stres edirilmesini gerektirir. Burada, bu tüm vücut maruz kalma yöntemi enjeksiyon veya hayvanlara gereksiz stres gerektirmez. Hayvanlar yiyecek ve suya reklam libitum erişimi var ve günlük ve haftada gün başına saat belirlenen bir sayı için büyük inhalasyon odası içinde yerleştirilir. Ayrıca, VC başka bir hepatotoksik duyarlılık değiştirir kavramı yeni bir bulgu, ilk bu grup tarafından gösterilmiştir12 ve doğrudan hepatotoksisite için gerekli olanların çok altında konsantrasyonlarda VC maruz kalma için etkileri vardır.
Bu teneffüs emziği yöntemi, çevremizde bulunan diğer uçucu organik bileşikler de dahil olmak üzere çeşitli gaz kirleticilere maruz kalma mığada kullanılabilir. Nitekim, uçucu organik bileşikler çevresel toksik maddelerin büyük bir grup ve daha sanayileşmiş alanlarda yaygın, bazı popülasyonlar kronik maruz kalma için daha yüksek risk altında sonuçlanan22. Bu protokol farklı deneysel sorulara uyacak şekilde değiştirilebilir. Uygulanan bileşiğin uzunluğu ve konsantrasyonu çeşitli olabilir. Başlangıçta karaciğer hasarının belirlenmesi için geliştirilmiş olmasına rağmen, diğer organ sistemleri ve bu model23ile incelenmiştir . Hayvanlarla kronik maruziyetleri incelemeyi amaçlayan ancak hayvan stresini en aza indirmek isteyen araştırmacılar bu modeli kullanmayı düşünmelidir.
Protocol
Tüm hayvan/VC deneyleri Çevre Sağlığı Bakanlığı, Laboratuvar Hayvan Bakımı Nın Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Için Güvenlik Birliği tarafından onaylanmıştır ve prosedürler yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Arınmış, deneysel diyetlere deneysel kurulum ve iklimlendirme
- Toplam C56Bl/6J fare sayısını belirleyin (grup başına en az 6−8 fare).
NOT: Her diyet grubundaki hayvanlar maruziyet gruplarına daha fazla bölünecektir. Çalışmayı planlarken ihtiyaç duyulan toplam hayvan sayısını hesaba kattığından emin olun. - Hayvanları tanıyın ve tartın. Bu verileri kaydedin.
- Diyetleri normal yemekten saflaştırılmış düşük yağlı (LFD) veya yüksek yağlı diyete (HFD) geçiş yapmak, fareleri yeni diyetlere alıştırmak için teneffüs denemelerinin başlamasından bir hafta önce (zaman çizelgesi için Şekil 1'e bakın).
- Yiyecek ve su reklamı libitum sağlayın. Kafes başına verilecek yiyecekleri tartarak ve kaydederek ve her beslenme gününde yiyeceğin geri kalanını tartarak ve kaydederek gıda tüketimini izleyin. Kafes başına 4 fare barındırAn varsa, haftada iki kez ~50 g yiyecek sağlayın. Kafes başına 5 fare barındırAn varsa, haftada iki kez ~60 g yiyecek sağlayın.
NOT: Saflaştırılmış diyetlerin beslenmesi sırasında farelerin yeterli pelete sahip olması için her gün gıda miktarı kontrol edilmelidir. Eğer yetersiz pelet varsa fareler gıda 'istiflemek' eğilimindedir ve alımını artırmak. Ayrıca, özellikle HFD benzer bir etkiye neden, LFD çok daha fazla çökmeeğilimindedir. - Hayvan sağlığının korunmasını sağlamak için deney boyunca hayvanları izleyin.
NOT: Haftalık kilo alımı ve gıda tüketiminin yanı sıra metabolik izleme genel hayvan sağlığı nın bir indeksini sağlamak için yapılabilir.
2. Vinil klorür inhalasyon maruziyet sistemi
NOT: Ticari olarak 'yalnızca burun' dan 'tüm vücut' maruziyetine ve manuelden otomatik sistemlere kadar birçok inhalasyon maruziyet sistemi mevcuttur. Daha önce bu grup tarafından yayınlanan veriler tüm vücut manuel sistem12,23,24türetilmiştir. Otomatik inhalasyon maruziyet sistemini açıklayan bir diyagram Şekil 2'degösterilmiştir.
- Hem deney hem de kontrol odalarındaki dilüent havanın yüksek verimli partikül hava (HEPA) ve aktif karbon filtreli, kurutulmuş ve basınçlı olduğundan emin olun, ilgili akış ölçüm cihazlarına (kütle akış denetleyicisi [MFC ]-deneysel oda, rotametre-kontrol odası).
NOT: Kontrol odasında, rotametre farelere hava akışını düzenler. Hava odanın üst girer, fareler tarafından geçer, sonra fareler altında yorgun ve kimyasal kaput girmeden önce bir HEPA filtre geçer. Sıcaklık ve bağıl nem (RH) oda içinde ölçülür. Deney odasında, dilüent hava bir VC tankıhava ile karıştırılır. Her iki akış da MFC'lerle düzenlenir. İki karışımın oranı deneysel haznedeki VC konsantrasyonunu belirler. VC farklı yönlere işaret yedi jetleri ile bir dağıtıcı ile pozlama odasının üst girer. VC fareler tarafından geçer ve daha sonra kafes raf altında konumlandırılmış 12 ayrı bağlantı noktası ile tüketilir. Bu oda tasarımı daha önce homojen toksik konsantrasyonları sağlamak için gösterilmiştir25. - Basınç, sıcaklık ve RH'nin deneysel ve kontrol odaları içinden izlenmesini sağlayın.
- Hazne deki egzozun, kimyasal kaputun egzoz alanına girmeden önce BIR HEPA filtre, co2 probu ve aktif karbon filtresinden geçirildiğini ve farelerin kabul edilebilir havalandırmayı aldığından emin olmak için CO2 seviyesinin izlendiğini doğrulayın.
- Teneffüs pozlamaları sırasında çevresel değişkenleri değiştirmek, izlemek ve kaydetmek için özel yazılımı kullanın.
NOT: Manuel sistem kullanılırsa, 2.1−2.4 adımlarında açıklanan değişkenler, pozlama süresi boyunca gerektiğinde düzenli olarak izlenmeli ve kalibre edilmelidir.
3. Ön pozlama kurulumu
- Teknisyen güvenliği için deney ve kontrol odalarındaki tüm hava akışlarını kapatın.
- Her oda için, oda kapağını açın ve ekinli yatak malzemesini (emici tarafı yukarı) boşaltın tavasının üstüne yerleştirin. Pozlama süresi boyunca rahat bir nem seviyesi (%40−60 RH) sağlamak için emici malzemeyi ısla.
- Vc'nin istenilen pozlama düzeyini haznede ayarlayın. Alt OSHA limit konsantrasyonları için 0,85 ppm VC kullanın. VC'nin hazneye tesliminin yazılım tarafından yönetilen, dedektör tabanlı geri bildirim denetimini veya sisteme manuel ayarlamalar kullanın.
NOT: İkinci yaklaşım, stok kaynağından VC gazının oda hacmi, oda yenileme hızı, hava akımı ve teslimat oranı hakkında bilgi gerektirir; bu hesaplamalar daha sonra doğrulanmalı ve sabit durumda12,24haznedeki VC konsantrasyonlarının ölçümleri ile kalibre edilmelidir. Haznede VC ölçmek için en yaygın teknik örnek hava gaz kromatografik analizi yoluyla12,24. VC teslimatının doğruluğu ve hassasiyeti ile ilgili yazılım odaklı yaklaşımın avantajları açıktır. Ancak, manuel yaklaşım da doğru ve tutarlı olduğu gösterilmiştir12,24.
DİkKAT: VC yüksek seviyelerde bilinen bir toksik ve karsinojendir. Odaları açıp kapatırken uygun kişisel koruyucu ekipmanı ve gazın taşınmasını egzersiz yapın.
4. Maruz kalma kafesi ve hayvan hazırlığı
- Fareleri barınma odalarından çıkarın ve teneffüs odası kafes rafının bireysel kafeslerine yerleştirin (kontrol fareleri için bir kafes rafı, maruz kalan fareler için bir kafes raf). Her farenin pozlama odası içinde homojen bir şekilde maruz kaldığından emin olmak için her farenin kafes rafına yerleştirilmesini günlük olarak rastgele belirleyin. Laboratuvar defterine her hayvanın numarasını ve kafes yerleştirme pozisyonunu işaretleyin.
- Her kafes rafını kendi odasına yerleştirin ve oda kapılarını kapatın.
5. Pozlama nın yapılması
- VC gaz tankı için vananın açık konumda olduğundan emin olun. Deney odası için dilüent akışının 25 L/dk olarak ayarlandığından emin olun.
- Deney odasındaki dilüent akışını başlatın. Kontrol odasındaki rotametrenin 25 L/dk olarak ayarlandığından emin olun.
- Tüm sensörlerin (akışlar, sıcaklık, nem, oda basıncı, CO2 seviyesi) doğru çalıştığından ve hem deney hem de kontrol odalarında beklenen sonuçları görüntülediğinden emin olun.
NOT: VC akışı, dilüent akışı na ve istenilen VC konsantrasyonuna göre hesaplanır ve ayarlanır. - Pozlama boyunca, deneysel haznede, pozlama süresi, dilüent akışı, VC akışı, sıcaklık, nem, oda basıncı, CO2 seviyesi ve teorik VC konsantrasyonu görüntülendiğinden, grafiklendiğinden ve kaydedildiğından emin olun. Kontrol odasının sıcaklığının ve neminin de görüntülendiğini, grafiklendiğini ve kaydedildiğini doğrulayın.
NOT: Manuel sistem kullanılıyorsa, vc akışı kontrol edilmeli ve gerektiğinde pozlama süresi boyunca ayarlanmalıdır. - Pozlama sırasında herhangi bir sorun oluşursa, VC akışını sıfıra ayarlayın ve kurutkan akışını hızlı bir şekilde temizlemek için maksimum değerine yükseltin.
- Pozlama süresine (yani 6 saat/gün) ulaşıldıktan sonra, yazılım vc akışını otomatik olarak kapatır. 15 dk güvenlik zamanlayıcısı daha sonra vc temizlemek için deneysel oda için süre sonra süre başlar. Hayvanları kaldırmak güvenli olduğunda, iletişim kutusundaki Tamam düğmesine tıklayın. Sistem, ölçümleri dosyaya kaydetmeyi durdurur ve pozlama sona erecektir.
NOT: Manuel sistem kullanılıyorsa, kullanıcı pozlama süresinin sonundaVC akışını manuel olarak kapatmalı ve pozlama sonunda VC temizliği için zaman hesaplanmalıdır.
6. Maruz kalma sonrası
- VC gaz tankı için vanadaki stopcock'u kapalı konuma getirin ve pozlama odasındaki tüm hava akışlarını kapatın. Kontrol odasından hava akımı akmadan rotametreyi çevirin.
- Farelere havalandırma sağlamak için her odadan kapıları çıkarın. Kafes raflarını odalardan çıkarın. Bir başlık altında, onların pozlama kafesleri fareler kaldırmak ve kendi konut kafesleri içine geri yerleştirin. Normal kafeslerde geceleme için tüm fareleri barınma odalarına geri götürün.
- Atık pandan kaynaklanan atıkları Çevre Sağlığı ve Güvenliği (DEHS) onaylı biyolojik tehlike konteyneri bölümüne atın, çünkü bunlar kurumsal çevre sağlığı hizmetleri tarafından kimyasal tehlike olarak kabul edilebilir. Deneysel ve kontrol sistemleri için oda kapılarını, boşaltıcı tavayı, pozlama kafesrafını ve pozlama odasını temizleyin.
7. Maruz kalma sırasında odacıklar içinde VC konsantrasyonunun doğrulanması
- Her pozlamanın yarısında (3 saat) deneysel oda içindeki VC konsantrasyonunun bir ölçümini gerçekleştirin.
- Vc dedektör tüpü ve bir pretreat tüp cam ipuçlarını kırın. VC dedektör tüpünün akış ucunu dedektör tüp pompasına takın. VC dedektör tüpünün akış ucunu kısa bir boru parçasıyla pretreat tüpünün akış ucuna takın. Pretreat borunun akış ucuna kısa bir boru parçası takın.
- Farelerin solunum bölgesine yakın örnekleme bağlantı noktalarından birinden bir fişi çıkarın. Tüpü, saplama borunun inakış ucundan örnekleme portuna takın.
- Tam konumdan, dedektör tüp pompasının piston üzerindeki sapını tam çıkış pozisyonuna kadar uzatın. Bu 90 s bir süre içinde VC dedektör tüpü içine odasından örneklenmiş gaz 100 mL çekecektir. 90'ları bekledikten sonra, tutamacı tekrar içeri itin.
- Vc dedektör tüpüne toplam 400 mL çekilmesi için 7.4 adımını üç kez daha tekrarlayın.
- Tüpü haznenin örnekleme portundan çıkarın ve fişi bağlantı noktasına yeniden yerleştirin. Vc dedektör tüpünün renk değişimini kontrol edin ve oda içindeki VC konsantrasyonu tespit edin.
- VC dedektör tüp okumasını laboratuvar not defterine kaydedin ve teorik değeri karşılaştırın. VC dedektör tüpünü ve pretreat tüpünü uygun bir kapta atın.
8. Teneffüse maruz kalma deneyinin sona erdirilmesi
NOT: İstenilen maruz kalma zaman çizelgesinden sonra, örneğin, 6, 8 ve/veya teneffüse maruz kalma nın başlamasından 12 hafta sonra, deneyler sonlandırılır ve hayvanlar ötenazi yegörehale edilir (zaman çizelgesi için Şekil 1'e bakınız).
- Ötanazi zamanından önce fareleri 4 saat hızlı.
NOT: Bu işlem metabolik analiz için açlık kan şekeri ve insülin düzeylerinin belirlenmesini sağlar. - Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) yönergeleriile uyumlu bir ötenazi yaklaşımı kullanın, anestezi gibi exsanguination takip.
- Ketamin/ksilazin (100/15 mg/kg) anestezi yi ğerlemek için her fareye intraperitoneal enjeksiyon ile uygulayın.
NOT: Vinil klorür maruziyeti etkinliğini engelleyebilir gibi bir ön-ötenazi anestezik olarak sodyum pentobarbital kaçının. - Sodyum sitrat çözeltisi içine inferior vena kava kan toplamak (son, 0.38%), kan pıhtılaşmasını önlemek ve örnek korunması için.
- Karaciğeri ve/veya istenilen herhangi bir organı çıkarın. Karaciğer ve ani dondurucu kısımları sıvı nitrojende inceleyin, dondurulmuş numune ortamına yerleştirin ve histoloji için %10 tamponlu formalini düzeltin.
- Santrifüj yoluyla plazmayı kandan ayırın ve sitritalınan plazmayı uygun bir tüpe aktarın ve analiz için gerekli olana kadar -80 °C'de saklayın.
- Karaciğer hasarının histolojik indekslerini değerlendirmek için hematoksin ve eozin (H&E) 5 μM formalin sabit parafin gömülü karaciğer kesitleri ile boyama yapın ve brightfield mikroskobu ile görüntüler elde edin.
- Plazma transaminaz düzeylerini elde etmek için, hem alanin aminotransferaz (ALT) hem de aspartat aminotransferaz (AST) kinetik tahlillerini ticari olarak mevcut kitleri kullanarak sital plazma üzerinde gerçekleştirin.
NOT: Kalite kontrol için C57Bl/6J fareleriçin plazma transaminazları LFD+VC grubu için normal aralıkta (35−45 IU/L) olmalıdır, HFD+VC grubu için değerler (~150 IU/L) yükseltilmelidir(Şekil 3C).
Representative Results
Deney boyunca, hayvan sağlığını sağlamak ve in vivo metabolizmasını değerlendirmek için hayvan vücut ağırlığı ve gıda tüketimi haftalık olarak izlendi. Şekil 3A, 12 haftalık bir deney için vücut ağırlığını ve gıda tüketimini betimlemaktadır. Vücut ağırlığı haftada bir kez ölçüldü ve tüm gruplar için haftada iki kez gıda tüketimi ölçüldü. Tüm fareler çalışma boyunca kilo aldı. Beklendiği gibi HFD gruplarındaki fareler LFD gruplarındaki fareler olarak daha fazla kilo alırken, VC'ye maruz kalan fareler ilgili kontrol grubundaki farelerden daha fazla kilo almadılar. Gıda tüketimi tüm gruplar arasında farklı değildi12,24.
Şekil 3B, genel morfolojianalizi için H&E ile boyanmış karaciğer kesitlerinin temsili fotomikrograflarını betimlemelidir. LFD grubunda VC açık patolojik değişikliklere neden olmadı. HFD besleme önemli ölçüde artmış steatoz (yağ birikimi) ve VC maruzkalma bu etkiyi artırdı. Ayrıca, HFD grubunda VC maruziyetbazı inflamatuar focisonuçlandı 12,24.
Plazma transaminaz (ALT ve AST) düzeyleri karaciğer hasarının göstergesi olarak ölçüldü ve transaminaz düzeyi nin yükselmesi karaciğer hasarının bir göstergesidir. LFD grubunda VC transaminaz düzeylerini artırmadı. HFD tek başına biraz transaminaz düzeyleri arttı ve önemli vc önemli ölçüde bu etkiyi geliştirilmiş (Şekil 3C)12,24.
Her grup için karaciğer ağırlığı ile vücut ağırlığı oranları hesaplandı. HFD önemli ölçüde vücut ağırlığı oranları karaciğer arttı. Ancak, VC bu etkiyi önemli ölçüde artırmadı (Şekil 3D)12.
Şekil 1: Teneffüs modeli prosedürüne genel bakış. Fareler saflaştırılmış diyet onları iklimlendirmek için 1 hafta boyunca ilgili düşük yağ (%13 doymuş yağ) veya yüksek yağlı (%42 doymuş yağ) diyetler reklam libitum beslenir. Bir hafta sonra, fareler inhalasyon rejimi tanıtıldı. Bunun için fareler, 12 hafta boyunca 6 saat/gün/gün, 5 gün/hafta boyunca ,1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) veya oda havasına (kontrol) maruz kalmak için son teknoloji tüm vücut teneffüs odalarına yerleştirilir. Teneffüs işlemi sırasında farelerin yiyecek ve suya ücretsiz olarak erişmesine izin verilir. 12 haftalıkken, fareler sabah ötenazi yedirilir. Bu model kronik maruz kalma uzun süre uzatılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Teneffüs odası tasarımı. Homojen toksik konsantrasyonlar sağlayan otomatik bir inhalasyon maruziyet sisteminin diyagramı gösterilmiştir. Özel yazılım, kullanıcının teneffüs pozlamaları sırasında çevresel değişkenleri değiştirmesine, izlemesine ve kaydetmesine olanak tanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Vinil klorür tek başına açık karaciğer hasarına neden olmaz ama diyet kaynaklı karaciğer hastalığı geliştirir. (A) Vücut ağırlığı ve gıda tüketimi haftalık olarak izlendi. (B) Genel karaciğer morfolojisinin H&E boyama ile temsili fotomikrografları gösterilmiştir (büyütme = 200x). (C) Sitrated plazma maruz iolayi sonunda toplanmış ve karaciğer hasarı indeksi olarak transaminaz enzimatik aktivitesi için analiz edilmiştir. (D) Karaciğer ağırlığı farklı deneysel zaman noktalarında ve tüm vücut ağırlığına göre belirlendi. Sonuçlar ortalama ± SEM.a, p < 0.05 olarak sunulur; b, p < 0.05 VC yokluğu ile karşılaştırıldığında. Grup başına örnek boyutu n = 8−10. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
VC gelişmiş NAFLD Bu model bir bütün vücut inhalasyon paradigması sub-OSHA limit VC pozlama etkisini değerlendirmek için yeni bir yöntemdir. Bu model, araştırmacıların sadece VC düşük seviyelerde alt hepatotoksik ve duyarlı etkileri çalışma sağlar. Nitekim, Bu co-pozlama modeli gelişmiş karaciğer hasarı elde, plazma ALT ve AST ve orta inflamasyon yüksekliği, büyük ölçüde diğer organ sistemlerini etkilemeziken, kalp gibi, Bukonsantrasyonda 23. Bu kronik model tüm vücut teneffüs odaları gerektirir ama stres ve maruz kalma konsantrasyonları en aza indirir. Burada sunulan protokol yazılım odaklı bir yaklaşım olmasına rağmen, bizim deneyim manuel yaklaşım da pozlama12,24doğru ve tutarlı bir yöntem olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kolayca diğer organ hasarı23 uçucu organik bileşik maruz kalma22neden dahil olmak üzere birden fazla araştırma alanları için uygulanabilir. Özellikle, bu model daha yakından çevresel kimyasallar ve altta yatan hastalık5insan co-maruz kalma patogenezi benzer olabilir.
Benzer sonuçlar elde etmek için protokol optimizasyonunun bazı kritik adımlarının atılabilmesi gerekir. Örneğin, araştırmacılar VC veya diğer toksik maddelerin oda içindeki konsantrasyonunun istenilen maruziyet aralığında (yani düşük seviyeli, alt OSHA veya akut seviyeler) içinde olduğunu saptamalıdırlar. Teneffüs odasının bu adımının optimize edilmesi, ilginin insana maruz kalmasının başarılı bir modeli için çok önemlidir. İkinci olarak, gün başına maruz kalma süresi ve deneme süresi ayarlama da değiştirilebilir. Bu grubun çıkarları doğrultusunda, bir mesleki maruziyet ayarı elde edildi ve diyet ek bir parametre de çalışıldı. Ancak, çevresel ve akut maruziyetler de bu protokol ile modellenebilir.
Bu çalışma, VC'nin (mesleki ve çevresel) mevcut maruz kalma sınırlarının güvenli olduğu paradigmasını zorlar. Nitekim, VC için mevcut OSHA maruz kalma sınırı olmasına rağmen 1 ppm, Bu model bu sınırın altında VC konsantrasyonları farelerde HFD neden karaciğer hasarı geliştirmek için yeterli olduğunu kanıtlamıştır. Bu protokol, araştırmacıların yeni bir toksik maruziyet paradigmasını incelemelerine ve karakterize etmelerine ve TASH'i modellemelerine olanak tanır.
Bu kronik ilk modeli, düşük doz VC maruzkalma. Önceki çalışmada VC maruziyeti için vekil olarak çok yüksek bolus konsantrasyonları, akut maruziyet veya aktif metabolitler kullanılmıştır. Tüm bu yaklaşımlar bulguların insan maruziyetine olan önemini azaltır. Bu nedenle, TASH-NAFLD etkileşiminin bu yeni modeli, araştırmacıların düşük seviyeli VC pozlamasının karmaşık etkileşimlerini incelemeleri için gerekli platformu sağlar.
Toksik kaynaklı karaciğer hasarı Bu model diğer uçucu organik bileşikler için kullanılabilir ve aynı zamanda karaciğer ve diğerorgan sistemleri 8 etkileyebilecek diğer etkileşimleri incelemek için,22,23. Ayrıca, bu model olmuştur, ve daha da olabilir, müdahale terapileri ve bu yaygın toksik için eylem modu derinlemesine mekanistik çalışmaları araştırmak için kullanılan24. VC bilinen bir kanserojen olduğu gibi26,27,28, Bu pozlama paradigması da VC kaynaklı kanser çalışması için değiştirilebilir. Alkolik karaciğer hastalığı gibi diğer co-morbiditeler de VC co-pozlama ile geliştirilmiş olabilir. Ayrıca, çoklu doymamış yağ18,29,30,ya da karbonhidrat31 ve bu modelde VC ile birlikte maruz kalma farklı türleri gibi yağ, farklı çalışma ilgi olacaktır. Gerçekten de, tüm bu faktörlerin karaciğer hasarı gelişimi üzerinde diferansiyel etkileri olduğu bilinmektedir ve VC kaynaklı hepatik hastalık bir rol oynayabilir.
Sonuç olarak, bu çevresel toksik kaynaklı karaciğer hasarı yeni bir teneffüs modeli ve kronik, düşük seviyeli VC maruziyeti için bir pozlama paradigması kurar. Bu modelde kullanılan VC konsantrasyonu kendisi tarafından sub-hepatotoksik, farelerde başka bir faktör (HFD) neden olduğu karaciğer hasarı artırır iken. Bu model, araştırmacıların kronik VC toksisitesi için mekanizmalar ve müdahaleler iincelemesine olanak sağlayacak ve maruz kalan insan deneklere ve maruz kalma riski en yüksek olan alanoslara bakarak çeviri çalışmaları için yararlı olabilir.
Disclosures
WT Goldsmith IEStechno, açıklanan sistem için şablon mali ilgi vardır. Geri kalan yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Juliane Beier'e Ulusal Sağlık Enstitüleri (K01 DK096042 ve R03 DK107912) tarafından finanse edilmiştir. Araştırma ayrıca P20GM113226 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (IDeA) ve Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. P50AA024337 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
