Summary
组织切片培养是研究神经发育或退行/再生过程的有力工具。在这里，我们描述了一个协议，模型在小鼠小脑切片培养中的Purkinje细胞的神经发育死亡。该方法有利于神经保护药物发现的研究。
Abstract
组织切片培养是一种强大的体外模型，它比分离的原细胞培养更密切地模拟体内条件。在产后早期发育中，已知小脑Purkinje细胞会经历一个脆弱的时期，在此期间，它们经历程序性细胞死亡。在这里，我们提供了一个详细的协议，以执行小鼠器官小脑切片培养在此关键时间。进一步标记切片，以评估Purkinje细胞存活率和神经保护治疗的有效性。这种方法对于筛选新的神经活性分子非常有价值。
Introduction
体外建模是生物医学研究的重要工具。它允许调查人员研究和严格控制受限制细胞类型或隔离系统/器官中的特定机制。组织切片培养是一种广泛应用的体外技术，特别是在神经科学领域。该方法最初由Göhwiler建立，他使用辊管技术2培养脑切片，后来由山本等人修改，他介绍了使用微孔膜进行皮质切片培养3。与原发细胞培养相比，有机切片培养具有保存组织细胞结构以及组织部分平面中的原生细胞-细胞连接的优势。
有机切片是从中枢神经系统的许多部位培养的，如海马体4，皮层5，纹状体6，小脑4，7，脊髓8，9等。它们已被证明是药物发现研究中的有力工具。神经活性分子的影响可以通过多种方式进行评估：使用免疫染色和生物化学分析的生存和神经退化，神经元回路形成，或使用电生理学和活成像中断。
这项工作的目的是描述一种简单的方法来执行器官小脑切片培养，这是已知的一个相关的模型，以模拟在体外小脑发育。特别是，我们专注于Purkinje细胞发育死亡的研究。在体内，Purkinje细胞在第一个产后周发生凋亡，在产后第3天（P3）11达到峰值。在小脑切片培养中也观察到同样的模式，当从P1和P8之间的动物身上取走脑细胞后，Purkinje神经元死于凋亡，峰值为P34，12。使用器官小脑切片培养物已经允许识别几个神经保护分子7，13，以及了解参与这个程序细胞死亡14，15，16的一部分机制。在这里，我们描述了一个基于在海马区Stoppini等人17号的研究，并适应小脑的Dusart等人的协议4它包括快速解剖和切除了产后脑切除术;将培养物切片到含有微孔膜的细胞培养插件上，无论是否进行神经保护治疗;和免疫荧光染色，以评估神经元存活率。
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Protocol
所有涉及动物的实验都是根据西北大学动物研究委员会进行的。
1. 在器官小脑切片培养之前的准备
- 在事先喷洒 70% 乙醇的细胞培养罩中，在连接到无菌瓶接收器的 250 mL 瓶顶真空过滤器中制备 200 mL 培养基。加入100 mL的底中鹰（BME），50 mL的汉克斯平衡盐溶液（HBSS），50 mL的热灭活马血清，1 mL的200 mM L-谷氨酰胺（最终浓度1 mM），和5 mL的200克/升葡萄糖（最终浓度5毫克/升）。真空过滤培养基，并将其保持在+4°C长达一个月。
- 在消毒的生物安全柜中，从包装中拿出一个6孔培养板。用 1 mL 的培养基填充每个井。如果对治疗进行了测试，将药理剂添加到治疗良好的中，并将相同体积的车辆溶液用于控制井。在本研究中，我们在处理井（30 mM 最终）中添加了1 μL的无菌3M KCl溶液，在控制井中加入1μL无菌水。
- 将所需数量的单独包裹的细胞培养插件引入亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（孔径 = 0.4 μm）。小心地解开它们，用无菌钳子中取出细胞培养物。将它们一个接一个地滴到6孔板的井中，避免在插入膜和细胞培养基之间的界面处出现气泡。在培养前，让插入物在37°C、5%CO2培养箱中平衡至少2小时。
注：组织切碎器永久驻留在细胞培养罩中。 - 准备两个 200 mL 烧杯，一个装满 150 mL 无菌水，另一个装满 150 mL 70% 乙醇。将手术工具浸入70%乙醇浴中，然后在使用前浸入水中。
注：在接触乙醇后立即不要使用手术工具。 - 在 70% 乙醇烧杯中消毒双刃刀片。使用无菌钳将其放在刀片支架上，并使用刀片夹扳手将其固定到位。让它干燥，直到使用。
- 在 70% 乙醇烧杯中消毒随组织切碎器提供的塑料圆盘。在将光盘放在切割台上之前，先用 70% 乙醇喷洒切割台。干到使用。
2. 解剖和细胞组织切片培养
- 将小鼠小狗带入细胞培养罩以执行解剖。
- 使用直操作剪刀快速斩首小狗（图1A）。
- 当用直敷服钳子用鼻子握住小狗的头时，用直眼剪刀切开头皮，从后端开始，到中线。
- 对头骨进行相同的操作。
注：确保将剪刀尖端指向外，以避免在解剖过程中损坏小脑。 - 拿出大脑，并将其转移到一个60毫米的菜，充满了冷HBSS = 5毫克/mL葡萄糖。
- 使用无菌直细钳仔细解剖小脑（图1B）。使用无菌弯曲细钳将其转移到纸巾切割台上的塑料盘上。
- 通过旋转切割台来定位组织以执行寄生部分。
- 通过向右拉桌子释放旋钮移动切割台，使刀片位于组织边缘。
- 将切片厚度调整到 350 μm，将刀片速度调整到介质。
- 启动切碎器。一旦整个小脑被切片（图1C），关闭切碎器。
- 用无菌钳子取出塑料盘。
- 小心地将塑料盘靠近含有 HBSS = 5 mg/mL 葡萄糖的 60 毫米盘。移液器冷HBSS = 5mg/mL葡萄糖到组织使用无菌转移移液器，允许在填充缓冲的盘中收获小脑片。
- 使用微探针将小脑切片彼此分离。使用转移移液器中取出质量良好的部分（建议使用靠近害虫的组织部分），并将其放在预平衡的细胞培养插入件中（图1D）。
- 使用微探针将小脑切片放在细胞培养插入件上，然后用转移移液器小心地去除多余的 HBSS = 5 mg/mL 葡萄糖溶液。
注：在这个阶段，组织非常嫩，容易受到物理损伤。每个细胞培养插入的最大小脑切片数量取决于供体动物的年龄。6~8片可培养P0-P4老动物，4~6片为P5以上的动物。 - 将培养皿放入培养箱中，每 2~3 天完全更换一次。
- 为了评估Purkinje细胞的存活率，切片可以早在5天在体外收集。出于其他目的，它们可以在培养中保存数周（图1F）。
注：在Purkinje细胞生存实验中，在改变细胞培养基时无需更新药理治疗（图1F）。
3. 免疫荧光
- 从培养箱中拿出 6 孔板。去除细胞培养基，用1x PBS清洗细胞培养插件，用冷4%的甲醛溶液固定切片1小时，细胞培养插件下1mL，细胞培养插件顶部500μL。
- 在轨道摇床上用 1x PBS 洗涤刀片 4x 10 分钟，刀片下方为 1 mL，刀片顶部为 500 μL。
- 用刷子将小脑片从1个细胞培养物插入到24孔预填充的1孔，预填充1xPBS，0.25%Triton X-100和3%BSA（PBS-TB），500μL/孔。
- 在室温下在PBS-TB中孵育1小时，渗透和阻断切片。
- 在PBS-TB溶液中稀释原抗体孵育，在+4°C下过夜，在轨道摇床，200μL/井上孵育。
- 第二天，在轨道振动器上，用1x PBS进行4次10分钟的10分钟的处理，500μL/well。
- 在PBS-TB溶液中孵育二级抗体，在室温下两小时，在轨道摇床上孵育，并防止光线照射，200 μL/井。
- 在轨道振动器上执行 4 次 10 分钟的 10 分钟，在轨道摇床上，500 μL/well。
- 使用 Hoechst 33342 对切片进行反污，在 1x PBS （2 μg/mL） 中稀释，在室温下 10 分钟，防止光线照射，500 μL/井。
- 使用移液器将小脑切片安装在显微镜幻灯片上。让他们完全风干，防止光线照射。用 1x PBS 重新加湿它们，并应用覆盖在安装介质（±80 μL）的盖玻片。避免制造任何气泡。
- 安装介质固化后，小脑部分即可成像。
4. 细胞生存的成像和定量
- 根据制造商和/或成像核心设施的说明打开显微镜和激光器。
- 启动采集软件。
- 使用 10 倍物镜，定位存在 9-10 球位（通常靠近害虫的小球部分）的未改变小球片。
- 激活 z 堆栈采集。定义 z 堆栈的范围，以包括小脑切片中存在的所有 Purkinje 细胞。设置 2 μm 步长大小并开始采集。以采集软件制造商的格式保存获取的图片，以保留关联的元数据。
- 使用生物格式插件18打开ImageJ中获取的文件。
- 转到图像>堆栈> Z 项目... （图 2A）。
- 在"投影类型"下拉菜单中选择最大强度，然后单击"确定"（图 2B）。
- 将生成拼合的二维图像。双击多点工具，让"点工具"窗口显示。取消选中"标签点"选项可简化计数单元格的可视化。然后，直接点击Purkinje细胞的索马开始计数（图1E）。计数单元格的总数将指示在点工具窗口的底部 （图 3）。
注：通常，至少3个非损坏部分，每个细胞培养插件包含9-10个球芯，可以量化。为了评估药理剂的神经保护作用，至少应进行3个独立的实验。
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Representative Results
如图4所示，该协议产生有机细胞小脑切片培养物，其中Purkinje细胞存活率可按照免疫荧光和图像采集步骤进行评估。Purkinje细胞被标记为抗卡宾丁D-28K（稀释1/200）和Alexa594抗小鼠（稀释1/300）抗体的组合。通过显微镜采集软件（NIS-元素）自动进行图像拼接，以获得整个小脑切片的图片。在棱镜8软件中输入了每个切片的Purkinje细胞数，以生成图表并执行统计分析。在P6，Purkinje细胞在控制中存活率较低，与已知的漏洞窗口4（图4A，E）一致。随着捐赠动物年龄的增长和退出这个关键时期（图4C，E），存活率增加。对脑切片进行高KCl浓度处理，成功诱导其去极化和存活14（图4B，D，E）。
图1：从解剖到Purkinje细胞生存定量的协议的插图。
老鼠小狗被迅速斩首 （A. . .脑解剖后，小脑被分离（B），然后切成 350 μm 宽度的切片 （C）。小脑部分被放置在对照细胞或治疗细胞培养插件 （D） 上，并在培养中在体外保存至少 5 天。然后，将组织固定在4%的甲醛中，进行免疫染色，然后用共聚焦显微镜获取图像。最后，使用 ImageJ（E） 中的多点工具在每个切片中量化 Purkinje 细胞编号。（F） 在培养过程中 KCl 治疗的时间过程的原理图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：用于在量化之前拼合 3D 堆栈的 ImageJ 设置。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：使用 ImageJ 中的多点工具计算 Purkinje 像元号的设置，其中举例说有小脑切片。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：高KCl治疗后，在器官小脑切片培养中，Purkinje细胞存活。
在产后第6天（A、B）或8（C、C、D、D'）拍摄的小脑切片的代表性图像，要么未经治疗（A、C、C'）或用30 mM KCl（B、D、D'）进行治疗。 （C'和D'）C和D中白色盒装区域的更高放大倍率视图。切片在固定前在体外保存5天。Purkinje细胞标有卡宾丁D-28K红色标签。刻度条 = 500 μm （A=D） 和 100 μm （C'和D'）。（E） P6和P8培养物的Purkinje细胞存活率的定量化，在30 mM KCl的控制或治疗下，通过治疗显示更高的存活率（Mann-Whitney测试，n = 3至5片）。数据表示为均值 = SEM。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
切贝拉尔切片培养是研究产后发育过程中程序化的Purkinje细胞死亡的有力工具。该技术可用于快速筛选候选分子的神经保护电位。主要优点是设置简单且经济高效，只需对设备进行适度投资（振动器的成本是纸巾切碎器的 3 倍）。此外，从一只小鼠小狗可以生成10到15个健康的切片，允许使用一种动物并行进行不同的检测。
为了获得一致且可重复的结果，尽可能高效地执行文化并选择要培养的健康小脑部分至关重要。此方法也适用于长期培养（长达数月）。因此，在解剖和切碎过程中使用良好的无菌技术，以避免污染和需要用抗生素补充培养物，这一点至关重要。
小脑切片培养模型在组织部分的平面和培养的区域中保留现有的细胞-细胞相互作用。这伴随着一个警告：与区域性区域外的目标的连接可能会被切断。神经营养因子的供应可能也停止，并损害神经元的生存。这可以通过执行有机切片共培养部分规避。已经表明，攀爬纤维可以穿透产后小脑切片文化，当与劣质橄榄片培养14，19。更有趣的是，通过攀爬纤维接触的Purkinje细胞存活了14年。
在这里，我们专注于使用有机切片培养物来寻找发育中的小脑的神经保护分子。然而，这种方法同样适用于其他条件，如神经退化20，斧子再生21，和监测神经元回路活动22，23。培养后的应用超出了免疫荧光的范围。切片可用于生化或基因表达研究，以研究特定化合物的神经保护作用所涉及的生物机制。总之，该模型可以为在体内测试之前发现新的神经活性分子奠定基础，是体内力学研究的有效和可靠的补充。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
成像工作在西北大学高级显微镜中心进行，由NCI CCSG P30 CA060553慷慨支持，授予罗伯特·赫·卢里综合癌症中心。我们感谢肖恩·麦克德莫特的技术援助和支持，感谢玛雅·爱泼斯坦的手工绘制的插图，如图1所示。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
