Summary
Les cultures de tranches organotypiques sont un outil puissant pour étudier les processus neurodéveloppementaux ou dégénératifs/régénérateurs. Ici, nous décrivons un protocole qui modélise la mort neurodéveloppementale des cellules de Purkinje dans les cultures de tranche de cévedrillon de souris. Cette méthode peut bénéficier à la recherche dans la découverte de médicaments neuroprotecteurs.
Abstract
La culture de tranches organotypiques est un modèle in vitro puissant qui mimicks in vivo conditions plus étroitement que les cultures cellulaires primaires dissociées. Au début du développement postnatal, les cellules cérévelaires de Purkinje sont connues pour passer par une période vulnérable, au cours de laquelle elles subissent la mort cellulaire programmée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer la culture de tranche de cervelateur organotypic de souris pendant ce temps critique. Les tranches sont également étiquetées pour évaluer la survie des cellules de Purkinje et l'efficacité des traitements neuroprotecteurs. Cette méthode peut être extrêmement utile pour dépister de nouvelles molécules neuroactives.
Introduction
La modélisation in vitro est un outil essentiel de la recherche biomédicale. Il permet aux chercheurs d'étudier et de contrôler étroitement des mécanismes spécifiques dans les types de cellules restreintes, ou dans des systèmes/organes isolés. La culture de tranches organotypiques est une technique in vitro largement utilisée, en particulier dans le domaine des neurosciences1. La méthode a d'abord été mise en place par le président Dehwiler, qui a cultivé des tranches de cerveau en utilisant la technique du tube à rouleaux2, puis modifiée par Yamamoto et coll., qui ont introduit l'utilisation d'une membrane microporeuse pour effectuer des cultures de tranches corticales3. Comparéaux aux cultures cellulaires primaires, les cultures de tranches organotypiques présentent l'avantage de préserver la cytoarchitecture du tissu, ainsi que les connexions cellulaires-cellules indigènes dans le plan de la section tissulaire.
Les tranches organotypiques ont été cultivées à partir de nombreuses parties du système nerveux central, comme l'hippocampe4, cortex5, striatum6, cervelet4,7, et la moelle épinière8,9, entre autres. Ils se sont avérés être un outil puissant dans les études de découverte de médicaments10. Les effets des molécules neuroactives peuvent être évalués de plusieurs façons : survie et neurodégénérescence à l'aide d'analyses d'immunostaining et de biochimie, formation de circuits neuronaux ou perturbation à l'aide de l'électrophysiologie et de l'imagerie vivante.
Le but de ce travail est de décrire une méthode simple pour effectuer la culture de tranche de cervelateur organotypic, qui est connu pour être un modèle pertinent pour imiter le développement cérécolal in vitro. En particulier, nous nous sommes concentrés sur l'étude de la mort développementale de cellules de Purkinje. In vivo, les cellules de Purkinje subissent l'apoptose au cours de la première semaine postnatale, avec un pic au jour postnatal 3 (P3)11. Le même modèle est observé dans la culture de tranche de céveineux, avec des neurones purkinje mourir par apoptose quand les cerveleux sont pris des animaux entre P1 et P8, avec un pic à P34,12. L'utilisation des cultures de tranches de cervelage organotypiques a permis d'identifier plusieurs molécules neuroprotectrices7,13, ainsi que de comprendre une partie des mécanismes impliqués dans cette mort cellulaire programmée14,15,16. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l'étude de Stoppini et autres17 dans l'hippocampe, et adapté au cervelet par Dusart et autres4 Il inclut la dissection rapide et le hachage du cerebella postnatal ; trancher la culture sur un insert de culture cellulaire contenant une membrane microporeuse, avec ou sans traitement neuroprotecteur; et la coloration d'immunofluorescence pour évaluer la survie neuronale.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées conformément au comité d'études animales de l'Université Northwestern.
1. Préparation avant les cultures de tranches de cervelateur organotypiques
- Dans une hotte de culture cellulaire pulvérisée avec 70% d'éthanol à l'avance, préparer 200 ml de milieu de culture dans un filtre à vide de 250 ml fixé à un récepteur de bouteille stérile. Ajouter 100 ml d'aigle moyen basal (BME), 50 ml de solution de sel équilibré (HBSS) de Hanks, 50 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 1 ml de 200 mL de L-Glutamine (concentration finale 1 mM) et 5 ml de glucose de 200 g/L (concentration finale de 5 mg/ml). Filtrer sous vide le milieu de culture et le maintenir à 4 oC pendant un mois.
- Dans l'armoire de biosécurité stérilisée, retirez une plaque de culture de 6 puits de son emballage. Remplissez chaque puits avec 1 ml de milieu de culture. Si un traitement est testé, ajouter l'agent pharmacologique au puits traité, et le même volume de solution de véhicule pour le bien de contrôle. Dans la présente étude, nous avons ajouté une solution stérile de 3 M KCl au puits traité (30 mM final) et 1 l d'eau stérile aux puits de contrôle.
- Apportez à l'intérieur du capuchon de culture cellulaire le nombre nécessaire d'inserts de culture cellulaire emballés individuellement avec membrane hydrophile de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (taille des pores de 0,4 m). Déballez-les soigneusement et sortez les inserts de culture cellulaire avec des forceps stériles. Déposez-les un par un dans un puits d'une plaque de 6 puits, en évitant les bulles à l'interface entre la membrane d'insertion et le milieu de culture cellulaire. Laisser les inserts équilibrer dans le milieu dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % pendant au moins 2 h avant la culture.
REMARQUE: L'hélico de tissu réside en permanence dans le capot de culture cellulaire. - Préparer deux béchers de 200 ml, l'un rempli d'eau stérile de 150 ml, et l'autre rempli de 150 ml d'éthanol à 70 %. Trempez les outils chirurgicaux dans le bain d'éthanol à 70 %, puis dans l'eau avant de les utiliser.
REMARQUE: N'utilisez pas d'outils chirurgicaux immédiatement après le contact avec l'éthanol. - Désinfecter la lame à double tranchant dans le bécher à l'éthanol à 70 %. Placez-le sur le support de la lame à l'aide de forceps stériles et maintenez-le en place à l'aide de la clé de pince à lame. Laisser sécher jusqu'à utilisation.
- Désinfecter le disque de plastique fourni avec l'hélico de tissu dans le bécher d'éthanol de 70%. Vaporiser la table de coupe avec 70% d'éthanol avant de placer le disque dessus. Laisser sécher jusqu'à utilisation.
2. Dissection et cultures de tranches organotypic de cervelateur
- Apportez le chiot de souris à l'intérieur du capot de culture cellulaire pour effectuer la dissection.
- Décapiter le chiot rapidement à l'aide de ciseaux de fonctionnement droit (Figure 1A).
- Tout en tenant la tête du chiot par le nez avec des forceps de pansement droit, couper le cuir chevelu à l'aide de ciseaux pour les yeux droits, à partir de l'extrémité postérieure, et aller latérale à la ligne médiane.
- Procédez à l'identique pour le crâne.
REMARQUE: Assurez-vous de pointer les pointes de ciseaux vers l'extérieur pour éviter d'endommager le cervelet pendant la dissection. - Sortez le cerveau et transférez-le dans un plat de 60 mm rempli de HBSS froid de 5 mg/mL de glucose.
- Disséquez soigneusement le cervelet à l'aide de forceps fins droits stériles (figure 1B). Transférez-le sur le disque en plastique placé sur la table de coupe de l'hélico tissulaire à l'aide de forceps fins incurvés stériles.
- Orientez le tissu en tournant la table de coupe pour effectuer des sections parasagittales.
- Déplacez la table de coupe en tirant le bouton de dégagement de table vers la droite, ainsi la lame est placée au bord du tissu.
- Ajuster l'épaisseur de la tranche à 350 m et la vitesse de la lame à moyen.
- Démarrez l'hélico. Une fois que le cervelet entier a été tranché (Figure 1C), éteignez l'hélico.
- Retirer le disque en plastique avec des forceps stériles.
- Apportez soigneusement le disque en plastique près d'un plat de 60 mm contenant hbSS 5 mg/mL de glucose. Pipette HBSS froid 5 mg/mL de glucose sur le tissu à l'aide d'une pipette de transfert stérile pour permettre la récolte des tranches de cérévelateur dans le plat rempli de tampons.
- Séparez les tranches de cervelateur les unes des autres à l'aide d'une microsonde. Sortez les sections de bonne qualité avec la pipette de transfert (il est recommandé d'utiliser des sections de tissus qui sont proches du vermis) et déposez-les dans un insert pré-équilibriste de culture cellulaire (Figure 1D).
- Placez les tranches de cervelateur sur l'insert de culture cellulaire à l'aide de la microsonde, puis retirez soigneusement l'excès de HBSS - 5 mg/mL de glucose avec la pipette de transfert.
REMARQUE: À ce stade, le tissu est extrêmement tendre et sujette à des dommages physiques. Le nombre maximal de tranches de cervelage par insertion de culture cellulaire dépend de l'âge de l'animal donneur. Les tranches de 6 à 8 peuvent être cultivées pour un animal vieux p0-P4, et de 4 à 6 tranches pour les animaux de plus de 5 ans. - Placer le plat de culture dans l'incubateur, en changeant complètement le milieu tous les 2 à 3 jours.
- Pour évaluer la survie des cellules de Purkinje, des tranches peuvent être prélevées dès 5 jours in vitro. À d'autres fins, ils peuvent être maintenus en culture pendant plusieurs semaines(figure 1F).
REMARQUE: Dans le cas des expériences de survie cellulaire de Purkinje, il n'est pas nécessaire de renouveler le traitement pharmacologique lors du changement de milieu de culture cellulaire(figure 1F).
3. Immunofluorescence
- Sortez l'assiette de 6 puits de l'incubateur. Retirez le milieu de culture cellulaire, lavez l'insert de culture cellulaire avec 1x PBS, et fixez les tranches avec la solution froide de paraformaldéhyde de 4% pendant 1 h, avec 1 ml sous l'insert de culture cellulaire et 500 l sur le dessus de l'insert de culture cellulaire.
- Laver les inserts 4x 10 min avec 1x PBS, avec 1 ml sous et 500 l sur le dessus de l'insert, sur un shaker orbital.
- À l'aide d'un pinceau, transférer les tranches de cérévelateur d'un insert de culture cellulaire à 1 puits d'un puits prérempli de 1x PBS, 0,25 % de Triton X-100 et 3 % de BSA (PBS-TB), 500 l/puits.
- Perméabilize et bloquer les tranches par incubation en PBS-TB pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber avec des anticorps primaires dilués dans la solution PBS-TB, pendant la nuit à 4 oC, sur un shaker orbital, 200 l/puits.
- Le lendemain, effectuer quatre lavages de 10 min avec 1x PBS, sur un shaker orbital, 500 l/puits.
- Incuber avec des anticorps secondaires dilués dans la solution PBS-TB, deux heures à température ambiante, sur un shaker orbital, et protégé de la lumière, 200 l/puits.
- Effectuer quatre lavages de 10 min avec 1x PBS, sur un shaker orbital, 500 l/puits.
- Contre-tache des tranches à l'aide de Hoechst 33342, diluées en 1x PBS (2 g/mL), pendant 10 min à température ambiante, à l'abri de la lumière, 500 l/puits.
- Monter les tranches de cervelateur sur une diapositive de microscopie avec une pipette de transfert. Laissez-les sécher complètement à l'air, à l'abri de la lumière. Réhumidifiez-les à l'arme 1x PBS et appliquez un bordereau recouvert de quelques gouttes de milieu de montage (80 l). Évitez de faire des bulles.
- Une fois que le support de montage a guéri, les sections de cervelateur sont prêtes à être image.
4. Imagerie et quantification de la survie cellulaire
- Allumez le microscope et les lasers selon les instructions du fabricant et/ou du noyau d'imagerie.
- Démarrer le logiciel d'acquisition.
- À l'aide d'un objectif 10X, localiser les tranches de cervelateur non altérées qui présentent 9 à 10 lobules (généralement des sections cérévelaires proches du verme).
- Activer l'acquisition z-stack. Définissez la gamme de la z-stack pour inclure toutes les cellules Purkinje présentes dans la tranche de cervelateur. Définir une taille d'étape de 2 m et commencer l'acquisition. Enregistrer l'image acquise dans le format du fabricant de logiciels d'acquisition pour préserver les métadonnées associées.
- Ouvrez le fichier acquis dans ImageJ à l'aide du plugin Bio-formats18.
- Aller à l'image 'gt; Stacks 'gt; Z-project... (Figure 2A).
- Choisissez l'intensité maximale dans le menu de déroulant de type Projection et cliquez sur OK (Figure 2B).
- Une image 2D aplatie sera générée. Double clic sur l'outil Multi-point pour laisser la fenêtre Point Tool s'affiche. Dévérifier l'option points d'étiquette pour faciliter la visualisation des cellules comptées. Ensuite, cliquez directement sur un soma d'une cellule Purkinje pour commencer à compter (Figure 1E). Le nombre total de cellules comptées sera indiqué au bas de la fenêtre Point Tool (figure 3).
REMARQUE: Habituellement, au moins 3 sections non endommagées contenant 9 à 10 lobules par insertion de culture cellulaire peuvent être quantifiées. Pour évaluer l'effet neuroprotecteur d'un agent pharmacologique, au moins 3 expériences indépendantes devraient être effectuées.
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Representative Results
Comme le montre la figure 4, ce protocole produit des cultures de tranches de cervelateurs organotypiques dans lesquelles la survie des cellules de Purkinje peut être évaluée après les étapes d'immunofluorescence et d'acquisition d'image. Les cellules purkinje ont été étiquetées avec une combinaison d'anticorps anti-Calbindin D-28K (dilution 1/200) et d'anticorps anti-souris Alexa594 (dilution 1/300). La couture d'image a été faite automatiquement par le logiciel d'acquisition de microscope (NIS-Elements) pour obtenir une image de la tranche entière de cervelateur. Les numéros de cellules purkinje par tranche ont été saisis dans le logiciel Prism 8 pour générer le graphique et effectuer une analyse statistique. À P6, la survie des cellules de Purkinje était faible dans le contrôle, conformément à leur fenêtre de vulnérabilité connue4 (Figure 4A,E). La survie a augmenté à mesure que l'animal donneur grandissait et sortait de cette période critique(figure 4C,E). Les tranches de cérévelin ont été traitées avec une forte concentration de KCl pour induire avec succès leur dépolarisation et leur survie14 (Figure 4B,D,E).
Figure 1 : Illustration du protocole de la dissection à la quantification de survie cellulaire de Purkinje.
Le chiot souris est rapidement décapité (A). Après la dissection du cerveau, le cervelet est isolé (B), puis coupé en tranches de 350 m de largeur (C). Les sections de cervelateur sont placées sur un insert de culture cellulaire de contrôle ou traité (D) et maintenues en culture pendant au moins 5 jours in vitro. Le tissu est alors fixé dans le paraformaldehyde de 4%, l'immunostaining est exécuté, et les images sont acquises avec un microscope confocal. Enfin, le numéro de cellule Purkinje est quantifié dans chaque tranche à l'aide de l'outil Multipoint dans ImageJ (E). (F) Schématique du cours de temps du traitement de KCl pendant la culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Paramètres ImageJ utilisés pour aplatir la pile 3D avant la quantification. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Paramètres utilisés pour compter le numéro de cellule de Purkinje à l'aide de l'outil Multipoint dans ImageJ avec un exemple de tranche de cérovel en cours de quantification. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Survie de cellules de Purkinje dans la culture de tranche de cervelateur organotypic suivant le traitement élevé de KCl.
Image représentative des tranches de cervelateur prises au jour postnatal 6 (A, B) ou 8 (C , D , D'),soit non traitées (A, C, C') ou traitées avec 30 mM KCl (B, D, D'). (C' et D') Vue de grossissement plus élevée des régions en boîte blanches en C et D. Les tranches ont été conservées 5 jours in vitro avant la fixation. Les cellules Purkinje sont étiquetées avec Calbindin D-28K en rouge. Barre d'échelle de 500 m (AetD), et 100 m (C' et D'). (E) La quantification de la survie des cellules de Purkinje des cultures P6 et P8, en contrôle ou traitée avec 30 mM KCl, montre une survie plus élevée avec le traitement (test Mann-Whitney, n ' 3 à 5 tranches). Les données sont exprimées comme étant moyennes - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La culture de tranches de céveltove est un outil puissant pour étudier la mort cellulaire programmée de Purkinje pendant le développement postnatal. Cette technique peut être utilisée pour dépister rapidement les molécules candidates pour leur potentiel neuroprotecteur. Le principal avantage est que la configuration est simple et très rentable, et ne nécessite qu'un investissement modeste dans l'équipement (un vibratome peut coûter jusqu'à 3 fois plus cher qu'un hélico de tissu). En outre, 10 à 15 tranches saines peuvent être générées à partir d'un chiot de souris, ce qui permet d'effectuer différents essais en parallèle à l'aide d'un seul animal.
Afin d'obtenir des résultats cohérents et reproductibles, il est essentiel d'exécuter la culture aussi efficacement que possible et de choisir des sections de cervelateur saines à cultivés. Cette méthode convient également à la culture à long terme (jusqu'à plusieurs mois). Ainsi, il est essentiel d'utiliser une bonne technique aseptique pendant le processus de dissection et de hachage pour éviter les contaminations et la nécessité de compléter les cultures avec des antibiotiques.
Le modèle de culture de tranches de cévetovepelle préserve les interactions cellulaires-cellules existantes dans le plan de la section tissulaire et dans la région cultivée. Ceci est accompagné d'une mise en garde : les connexions avec des cibles à l'extérieur de la région cultivée pourraient être rompues. L'approvisionnement en facteurs neurotrophiques fournis par les fibres afférentes pourrait être discontinué ainsi et altérer la survie neuronale. Cela peut être partiellement contourné par l'exécution de co-cultures tranches organotypiques. Il a été démontré que les fibres grimpantes peuvent pénétrer les cultures de tranches de cervelateur postnatales lorsqu'elles sont co-cultivées avec des cultures inférieures de tranches d'olive14,19. Plus intéressant encore, les cellules Purkinje contactépares par les fibres grimpantes ont survécuà 14.
Ici, nous nous sommes concentrés sur l'utilisation de la culture de tranche organotypique pour rechercher des molécules neuroprotectrices dans le cervelet en développement. Cependant, cette méthode est également adaptée à d'autres conditions telles que la neurodégénérescence20, la régénération axonale21, et la surveillance de l'activité du circuit neuronal22,23. Les applications post-culture vont au-delà de l'immunofluorescence. Des tranches peuvent être utilisées pour des études biochimiques ou d'expression génique, afin d'étudier les mécanismes biologiques impliqués dans l'effet neuroprotecteur d'un composé donné. Au total, ce modèle peut jeter les bases pour trouver de nouvelles molécules neuroactives avant l'essai in vivo et être un complément efficace et fiable aux études mécanistes in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les travaux d'imagerie ont été réalisés au Northwestern University Center for Advanced Microscopy généreusement soutenu par NCI CCSG P30 CA060553 décerné au Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Nous remercions Sean McDermott pour son assistance technique et son soutien, et Maya Epstein pour les illustrations dessinées à la main présentées à la figure 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
