Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, Northwestern University, Feinberg School of Medicine

Summary

תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.

Abstract

תרבות הפרוסה האורגנותית היא מודל רב-עוצמה החיקוי לvivo בתנאים הקרובים יותר מאשר בתרבויות תאים ראשיות שאינן מקבילות. בפיתוח מוקדם לאחר הלידה, המוח הפורקיאר Purkinje ידועים לעבור תקופה פגיעה, שבמהלכה הם עוברים מוות תאים מתוכנת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבצע העכבר באמצעות התרבות פרוסה בזמן קריטי זה. הפרוסות מסומנות עוד כדי להעריך את ההישרדות של התאים Purkinje ואת היעילות של טיפולים נוירומגן. שיטה זו יכולה להיות רבת ערך למסך עבור מולקולות נוירואקטיביות חדשות.

Introduction

בדוגמנות חוץ גופית הוא כלי חיוני במחקר ביו רפואי. הוא מאפשר לחוקרים ללמוד ולשלוט היטב במנגנונים ספציפיים בסוגי תאים מוגבלים, או במערכות מבודדות/איברים. תרבות הפרוסה האורגנותית היא בשימוש נרחב בטכניקת מבחנה, במיוחד בתחום המוח המדעי1. השיטה הוקמה לראשונה על ידי Gähwiler, אשר מתרבות פרוסות המוח באמצעות טכניקת שפופרת רולר2, ומאוחר יותר שונה על ידי יאממוטו ואח ', מי הציג את השימוש של קרום מיקרונקבובי לבצע תרבויות פרוסה קורטיקלית3. בהשוואה לתרבויות התאים הראשוניים, תרבויות הפרוסה האורגאותיות מציגות את היתרון של שמירה על הארכיטקטורה הציטותאית של הרקמה, כמו גם התקשרויות מקוריות של תאי התא במישור של מקטע הרקמה.

פרוסות אורגאואיות מתורמות מחלקים רבים של מערכת העצבים המרכזית, כגון ההיפוקמפוס4,קליפת 5, סטריאטום6, המוח השני4,7, וחוט השדרה8,9, בין היתר. הם הוכחו להיות כלי רב עוצמה במחקר גילוי סמים10. ההשפעות של מולקולות נוירואקטיביות ניתן להעריך בדרכים רבות: הישרדות וניוון שימוש באמצעות חיסוני וביוכימיה assays, היווצרות מעגלים עצביים, או שיבוש באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה חיה.

מטרת העבודה הזאת היא לתאר שיטה פשוטה לביצוע תרבות פרוסה בצורת אורגנויוגית, שידועה כמודל רלוונטי לחיקוי התפתחות מעשית בתחום החוץ. במיוחד, התמקדנו במחקר של תא מוות התפתחותי של Purkinje. ב vivo, התאים Purkinje עוברים ואפופטוזיס במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, לשיא ביום לאחר הלידה 3 (P3)11. דפוס זהה הוא נצפתה בתרבות פרוסה של המוח, עם נוירונים purkinje מתים על ידי אפופטוזיס כאשר המוח נלקח מבעלי חיים בין P1 ו P8, עם שיא ב P34,12. השימוש בתרביות פרוסה בלבלר מאפשר לזהות מספר מולקולות נוירוגינים7,13, כמו גם הבנת חלק מהמנגנונים המעורבים במוות התאים המתוכנת הזה14,15,16. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על המחקר של סטופיני ואח '17 ב היפוקמפוס, והותאם המוח המהיר על ידי דוארט ואח '4 זה כולל חיתוך מהיר וחיתוך של המוח פוסט לידה; לחתוך את התרבות על הוספת תרבות התא המכיל קרום מיקרונקבובי, עם או בלי טיפול נוירומגן; וכתמים מאימונועצביים כדי להעריך את ההישרדות העצבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הכרוכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן.

1. הכנה לפני תרבויות הפרוסה האורגליתית

  1. ב תרבות תא כיסוי מרוסס עם 70% אתנול מראש, להכין 200 mL של מדיום התרבות ב 250 mL בקבוק ואקום העליון מחובר מקלט בקבוק סטרילי. הוסף 100 mL של בסיס בינונית נשר (BME), 50 mL של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), 50 mL של סרום הסוס חום המופעל, 1 מ ל של 200 mM L-גלוטמין (ריכוז סופי 1 מ"מ), ו-5 מ ל של 200 g/L גלוקוז (הריכוז הסופי 5 מ"ג/mL). ואקום-לסנן את מדיום התרבות ולשמור אותו ב-+ 4 ° צ' עבור עד חודש.
  2. בארון הביובטיחות מעוקר, להוציא צלחת התרבות 6-היטב מהחבילה שלה. מלא כל טוב עם 1 מ ל של התרבות הבינונית. אם הטיפול נבדק, להוסיף את הסוכן התרופתי לבאר מטופלים, ואת אותו נפח של פתרון הרכב עבור השליטה היטב. במחקר הנוכחי, הוספנו 1 μL של סטרילית 3 M KCl פתרון היטב שטופלו (30 מ"מ סופי) ו 1 μL של מים סטרילי לבארות בקרת.
  3. להביא בתוך התרבות תאים מכסה את המספר הדרוש של התרבות העטופה בנפרד הגוף מוסיף הידרופיפילית polyטטרפלואורואתילן (מצופה) קרום (גודל נקבובית = 0.4 μm). בזהירות לפתוח אותם להוציא את התרבות התא מוסיף עם מלקחיים סטרילי. הפל אותם אחד אחד בבאר של 6-היטב צלחת, הימנעות בועות בממשק בין קרום להכניס את המדיום תרבות התא. תן את התוספות להדיה במדיום 37 ° c, 5% CO2 חממה לפחות 2 h לפני התרבות.
    הערה: קוצץ הרקמות שוכן לצמיתות במכסה התרבותי של התאים.
  4. להכין 2 200 mL כוסות, אחד מלא 150 mL מים סטרילי, והשני מלא 150 mL 70% אתנול. טובלים את כלי הניתוח באמבטיית אתנול 70% ולאחר מכן במים לפני השימוש בהם.
    הערה: אין להשתמש בכלים כירורגיים מיד לאחר המגע עם אתנול.
  5. חטא את הלהב הכפול בגביע. האתנול של 70% מניחים אותו על מחזיק הלהב באמצעות מלקחיים סטרילי ולהחזיק אותו למקום באמצעות מפתח הברגים התפס. . תנו לו להתייבש עד השימוש
  6. לחטא את הדיסק פלסטיק שסופקו עם מסוק הרקמה בגביע האתנול 70%. רסס את שולחן החיתוך עם 70% אתנול לפני הצבת הדיסק על זה. . תנו להתייבש עד שתשתמשו

2. לחיתוך וללבלר מתרבויות הפרוסה

  1. הביאו את גור העכבר בתוך המכסה של תרבות התא כדי לבצע את הקרע.
  2. לערוף את ראשו של הגור במהירות באמצעות מספרייםהפעלהישר (איור 1א).
  3. בעוד מחזיק את ראשו של הכלבלב על ידי האף עם מלקחיים ההלבשה ישר, לחתוך לפתוח את הקרקפת באמצעות מספריים עין ישר, החל מהקצה האחורי, והולך לרוחב קו האמצע.
  4. . המשך באופן זהה לגולגולת
    הערה: הקפד להפנות את קצות המספריים כלפי חוץ כדי להימנע מפגיעה בעורק המוח במהלך הניתוח.
  5. להוציא את המוח ולהעביר אותו לצלחת 60-mm מלא HBSS קר + 5 מ"ג/mL גלוקוז.
  6. בזהירות לנתח את המוח באמצעות מלקחיים בסדר ישר סטרילי (איור 1B). להעביר אותו על דיסק פלסטיק ממוקם על השולחן חיתוך של המסוק רקמות באמצעות מלקחיים סטרילי מעוקל בסדר.
  7. מכוון את הרקמה על ידי סיבוב שולחן החיתוך כדי לבצע מקטעים פאראבריים.
  8. הזז את שולחן החיתוך על-ידי משיכת כפתור השחרור של הטבלה ימינה, כך שהלהב ממוקם בקצה הרקמה.
  9. התאימו את עובי הפרוסה ל-350 יקרומטר ולמהירות הלהב לבינונית.
  10. . תתניע את המסוק ברגע שכל המוח חתוך (איור 1ג), כבה את המסוק.
  11. להסיר את הדיסק הפלסטי עם מלקחיים סטרילי.
  12. בזהירות להביא את הדיסק פלסטיק קרוב למנה 60-mm המכיל HBSS + 5 מ"ג/mL גלוקוז. פיפטה קר HBSS + 5 mg/mL גלוקוז על הרקמה באמצעות פיפטה העברה סטרילית כדי לאפשר קציר של פרוסות המוח בתבשיל מלא מאגר.
  13. הפרידו בין הפרוסות המוח. בעזרת מיקרו-לווין להוציא מקטעים באיכות טובה עם פיפטה העברה (מומלץ להשתמש בסעיפים הרקמה הקרובים vermis) ולשחרר אותם בתוך הוסף תרבות התאים לפני השפה (איור 1ד).
  14. מקמו את פרוסות המוח על הוסף תרבות התא באמצעות microprobe, ולאחר מכן להסיר בזהירות את העודף HBSS + 5 mg/mL הפתרון גלוקוז עם העברת הצנרת.
    הערה: בשלב זה הרקמה מאוד רכה ונוטה לנזק פיזי. המספר המירבי של פרוסות מרביות לכל תרבות התא תלוי בגיל בעל החיים התורם. 6 – 8 פרוסות יכול להיות מתורבת עבור חיה P0-P4-old, ו 4-6 פרוסות עבור בעלי חיים מבוגרים יותר P5.
  15. מניחים את קערת התרבות בחממה, משנה את המדיום לחלוטין כל 2-3 ימים.
  16. כדי להעריך את ההישרדות של התאים Purkinje, פרוסות ניתן לאסוף מוקדם ככל 5 ימים ב מבחנה. למטרות אחרות, ניתן לשמור אותם בתרבות במשך מספר שבועות (איור 1F).
    הערה: במקרה של Purkinje הישרדות התאים ניסויים, אין צורך לחדש את הטיפול תרופתי בעת שינוי תרבות התא בינונית (איור 1F).

3. אימונולואורנציה

  1. . תוציא את הצלחת ה -6 מהאינקובטור הסרת מדיום תרבות התא, לשטוף את הוספת תרבות התא עם 1x PBS, ולתקן את הפרוסות עם קר 4% פאראפורמלדהיד פתרון עבור 1 h, עם 1 mL תחת הוספת תרבות התא ו 500 μL על גבי הוספת תרבות התא.
  2. לשטוף את מוסיף 4x 10 דקות עם 1x PBS, עם 1 mL תחת ו-500 μL על גבי הוספת, על שייקר מסלולית.
  3. עם מברשת, להעביר את הפרוסות המוח מתוך 1 תרבות תא להוסיף 1 היטב של 24-היטב pre-מלא עם 1x PBS, 0.25% טריטון X-100, ו 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/ובכן.
  4. חדירות ולחסום את הפרוסות על ידי דגירה ב-PBS-TB עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
  5. דגירה עם נוגדנים העיקרי מדולל בפתרון PBS-TB, לילה ב + 4 ° c, על שייקר מסלולית, 200 μL/ובכן.
  6. ביום הבא, לבצע ארבע שוטף של 10 דקות עם 1x PBS, על שייקר מסלולית, 500 μL/ועוד.
  7. דגירה עם נוגדנים משני מדולל בפתרון PBS-TB, שעתיים בטמפרטורת החדר, על שייקר מסלולית, ומוגן מפני אור, 200 μL/ובכן.
  8. לבצע ארבע שוטף של 10 דקות עם 1x PBS, על שייקר מסלולית, 500 μL/ובכן.
  9. מנוגד את הפרוסות באמצעות Hoechst 33342, מדולל ב-1x PBS (2 μg/mL), עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור, 500 μL/ועוד.
  10. לטעון את פרוסות המוח בשקופית מיקרוסקופית עם פיפטה העברה. , תנו להם להתייבש לגמרי. מוגנים מפני אור מחולל לחות מחדש עם PBS 1x ולהחיל שמיכות מכוסה עם כמה טיפות של בינונית הרכבה (~ 80 μL). להימנע מלעשות בועות כלשהן.
  11. ברגע שהמדיום הגובר נרפא, מקטעים מקרבלאר מוכנים לדימות.

4. הדמיה וקוונפיקציה של הישרדות התאים

  1. הפעל את המיקרוסקופ ולייזרים על פי היצרן ו/או הוראות מתקן הדמיה ליבה.
  2. הפעל את תוכנת הרכישה.
  3. באמצעות מטרה 10x, לאתר פרוסות המוח לא שונה כי ההווה 9-10 אוניות (בדרך כלל מקטעים המוח קרוב vermis).
  4. הפעל את רכישת מחסנית z. הגדר את הטווח של מחסנית z כדי לכלול את כל תאי Purkinje הנמצאים בפרוסת המוח. להגדיר גודל 2 יקרומטר צעד ולהתחיל את הרכישה. שמור את התמונה שנרכשה בתבנית של יצרן תוכנת הרכישה כדי לשמר את המטא-נתונים המשויכים.
  5. פתח את הקובץ הנרכש ב-ImageJ באמצעות התוסף הביו-תבניות18.
  6. עבור לתמונה > ערימות > Z-פרוייקט. ..
  7. בחרו ' עוצמה מקסימלית ' בתפריט הנפתח ' סוג הקרנה ' ולחצו על ' אשר ' ('איור 2ב').
  8. תמונה דו-ממדית משוטח תיווצר. לחיצה כפולה על הכלי מרובת הנקודות כדי לאפשר לחלון הצבע של הכלי להופיע. בטל את הסימון באפשרות נקודות התווית כדי להקל על הדמיית תאים שנספרו. לאחר מכן, לחץ ישירות על סומה של תא Purkinje כדי להתחיל לספור (איור 1E). המספר הכולל של התאים שנספרו יציין בתחתית חלון הכלי (איור 3).
    הערה: בדרך כלל, לפחות 3 סעיפים שאינם פגומים המכילים 9-10 אוניות לכל תרבות התא ניתן לכמת. כדי להעריך את ההשפעה הנוירומגנה של סוכן תרופתי, לפחות 3 ניסויים עצמאיים יש לבצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שניתן לראות באיור 4, פרוטוקול זה מפיק בתרבויות הפרוסה האורגאולית שבהן ניתן להעריך את הישרדות התאים של Purkinje בעקבות הטיפול הimmunofluorescence ושלבי רכישת התמונה. תאים purkinje סומנו עם שילוב של אנטי Calbindin D-28K (דילול 1/200) ו Alexa594 נגד העכבר (דילול 1/300) נוגדנים. תפרים תמונה נעשה באופן אוטומטי על ידי תוכנת רכישת מיקרוסקופ (שקלים-אלמנטים) כדי לקבל תמונה של הפרוסה כולה המוח. מספרי תאים של purkinje לכל פרוסה הוזנו בתוכנת פריזמה 8 כדי ליצור את התרשים ולבצע ניתוח סטטיסטי. ב P6, הישרדות התאים Purkinje היה נמוך בפקד, עקבי עם חלון הפגיעות הידוע שלהם4 (איור 4A, E). הישרדות גדל כמו חיה התורם גדל ויצא התקופה הקריטית (איור 4C, E). פרוסות המוח היו מטופלים עם ריכוז KCl גבוה כדי לגרום בהצלחה depolarization שלהם והישרדות14 (איור 4B, D, E).

Figure 1
איור 1: אילוסטרציה של הפרוטוקול מניתוח לפני כימות הישרדות התאים Purkinje.
הכלבלב של העכבר הוא נערףבמהירות (א). בעקבות ניתוח מוחי, המוח החצי מבודד (ב), ולאחר מכן קצוצים לתוך פרוסות 350 μm-רוחב (C). קטעי המוח ממוקמים על שליטה או מטופלים הוספת תרבות התא (D) ומתוחזק בתרבות לפחות 5 ימים בתוך מבחנה. הרקמה מתוקנת לאחר מכן ב-4% פאראפורמלדהיד, כתמים חיסוני מבוצע, ותמונות נרכשים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. לבסוף, מספר התאים של Purkinje מכמת בכל פרוסה באמצעות הכלי Multipoint ב-ImageJ (E). (ו) סכמטי של קורס הזמן של הטיפול ב-kcl במהלך התרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הגדרות ImageJ המשמשות לשטח את מחסנית תלת-ממד לפני הכמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הגדרות המשמשות לספירת מספר התאים של Purkinje באמצעות הכלי Multipoint ב-ImageJ עם דוגמה לפרוסה בעלת מחשב המשמש ככמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הישרדות התאים הפורקינאית בתרבות הפרוסה לאחר הטיפול KCl גבוהה.
דמות מייצגת של פרוסות מוח שצולמו ביוםהשני6 (א, ב) או 8 (c, c, d, d '), לא מטופלים (A, c, c) או מטופלים עם 30 מ"מ kcl (B, d, d '). (C ' and D ') תצוגת הגדלה גבוהה יותר של האזורים הלבנים באזור C ו- D. פרוסות הוחזקו 5 ימים במבחנה. לפני הקיבעון תאי פורקיג'ה מתויג בעזרת קלבינדין D-28K באדום. סרגלבקנה מידה= 500 יקרומטר (A –D), ו 100 יקרומטר (C ' ו -d '). (ה) קוונפיקציה של הישרדות תא Purkinje מ P6 ו P8, בשליטה או מטופלים עם 30 מ"מ kcl, מראה הישרדות גבוהה יותר עם הטיפול (מבחן מאן-ויטני, n = 3 כדי 5 פרוסות). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התרבות פרוסה בלבלר הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור מתוכנת Purkinje מתוכנתים המוות במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי במהירות מולקולות מועמד במסך עבור הפוטנציאל הנוירולוגי שלהם. היתרון העיקרי הוא כי ההתקנה היא פשוטה וחסכונית מאוד, והוא רק דורש השקעה צנועה ציוד (משחק הרטט יכול לעלות עד פי 3 יותר מאשר מסוק רקמות). יתר על כן, 10 כדי 15 פרוסות בריאות ניתן ליצור מגור אחד העכבר, המאפשר בחני שונים להתבצע במקביל באמצעות חיה אחת בלבד.

כדי לקבל תוצאות עקביות ולהתרבות, זה קריטי לבצע את התרבות בצורה היעילה ביותר וכלה לבחור חלקים בריאים בעלי מוח להיות תרבותי. שיטה זו מתאימה גם לתרבות ארוכת טווח (עד מספר חודשים). So, זה חיוני להשתמש בטכניקת אספטי טובה במהלך הניתוח וחיתוך התהליך כדי למנוע זהום ואת הצורך להשלים את התרבויות עם אנטיביוטיקה.

המודל התרבותי לחיתוך המוח משמר את האינטראקציות הקיימות בתא התאים במישור הרקמה, ובאזור התרבותי. זה מגיע עם אזהרה: קשרים עם מטרות מחוץ לאזור תרבותי עלול להיות קטוע. האספקה בגורמים neurotrophic שסופקו על ידי סיבים כלי לימפה עשוי להיות הופסק גם ולפגוע הישרדות עצבית. ניתן להקיף את הדבר באופן חלקי על-ידי ביצוע שיתוף הפעולה של הפרוסה האורגאולית. זה כבר הוכח כי מטפסים הטיפוס יכולים לחדור את התרבויות לפני הלידה של המוח כאשר שותף בתרבות עם החלק הנחות של זיתים זית14,19. מעניין יותר, התאים Purkinje יצרו קשר על ידי סיבי טיפוס שרדו14.

כאן, התמקדנו בשימוש בתרבות הפרוסה האורגנותית כדי לחפש מולקולות של הגנה עצבית במוח המתפתח. עם זאת, שיטה זו מתאימה באותה מידה לתנאים אחרים, כגון ניוון נוירולוגי20, התחדשות סיבי21, וניטור של פעילות מעגל עצבי22,23. האפליקציות שלאחר התרבות מעלות מעבר לאימונולובורנציה. ניתן להשתמש בפרוסות עבור לימודי ביטויים ביוכימיים או גנים, כדי לחקור את המנגנונים הביולוגיים המעורבים בהשפעה הנוירולוגית של תרכובת נתונה. בסך הכל, מודל זה יכול להטיל את היסודות למציאת מולקולות נוירואקטיביות חדשות לפני בדיקה vivo ולהיות תוסף יעיל ואמין במחקרים vivo מכניסטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודת הדמיה בוצעה במרכז אוניברסיטת נורת'ווסטרן עבור מיקרוסקופ מתקדם נתמך על ידי NCI CCSG P30 CA060553 הוענק למרכז רוברט ה לוריא מקיף סרטן. אנו מודים לשון מקדרמוט על הסיוע והתמיכה הטכניים שלו, ומאיה אפשטיין לאיורים המוצגים ביד המוצגת באיור 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody ThermoFisher scientific A21203
Basal Medium Eagle (BME) ThermoFisher scientific 21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2 NuAire NU-540-400
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) Abcam ab82812
CO2 Incubator NuAire NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates Fisher Scientific 07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm Fisher Scientific 12-545-E
Dressing forceps, straight Harvard Apparatus 72-8949
Double edge blades Fisher Scientific 50949411
Ethanol 200 proof Decon Labs, Inc 2701
Eye Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8428
Fine forceps Fisher Scientific 16-100-127
L-Glutamine 100X ThermoFisher scientific 25030149
Glucose solution ThermoFisher scientific A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution ThermoFisher scientific 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Fisher Scientific H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin ThermoFisher scientific 26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper Fisher Scientific NC9914528
Microprobes Fisher Scientific 08-850
Millicell Cell Culture Inserts Millipore Sigma PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL ThermoFisher scientific 168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system Nikon
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Paraformaldehyde Acros Organics 41678-0010
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher scientific P10144
Operating Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8403
Orbital shaker Belly Dancer IBI Scientific BDRLS0003
Prism 8 GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring Fisher Scientific FB012921
Tissue culture plate, 24 well Falcon/Corning 353047
Transfer pipettes, sterile ThermoFisher scientific 13-711-21
Triton X-100 ThermoFisher scientific BP151-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  2. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  3. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  4. Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
  5. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
  7. Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
  8. Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
  9. Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
  10. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  11. Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
  12. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
  13. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
  14. Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
  15. Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
  16. Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
  17. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  18. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  19. Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
  20. Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
  21. Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
  22. Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
  23. Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).

Tags

מדעי המוח סוגיה 154 מדעי המוח מוח מוחי אורגאוטימית תא Purkinje פיתוח הגנה עצבית
הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. … More

Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (154), e60353, doi:10.3791/60353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter