Summary
オルガノイトスライス培養は、神経発達または変性/再生プロセスを研究するための強力なツールです。ここでは、マウス小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞の神経発達死をモデル化するプロトコルについて説明する。この方法は、神経保護創薬の研究に役立つ可能性があります。.
Abstract
オルガノチピックスライス培養は、解肉された一次細胞培養よりも近い生体内条件で模倣する強力なインビトロモデルである。出生後の初期の発達では、小脳プルキンジェ細胞は脆弱な期間を経て、その間にプログラムされた細胞死を受けることが知られている。ここでは、この重要な時期にマウスのオルガトイピック小脳スライス培養を実行するための詳細なプロトコルを提供します。スライスはさらにプルキンエ細胞の生存および神経保護処置の有効性を評価するために標識される。この方法は、新しい神経活性分子をスクリーニングするために非常に貴重なことができます。
Introduction
インビトロモデリングは、生物医学研究に不可欠なツールです。これにより、研究者は、制限された細胞型、または隔離されたシステム/器官内の特定のメカニズムを研究し、厳密に制御することができます。オルガノイトスライス培養は、特に神経科学1の分野で、インビトロ技術で広く使用されている。この方法は、ローラーチューブ技術2を用いて脳スライスを培養したゲーウィラーによって最初に確立され、後に山本らによって改変され、皮質スライス培養を行うために微多孔膜の使用を導入した3。一次細胞培養と比較して、組織皮症スライス培養物は、組織の細胞建築、ならびに組織セクションの平面における天然細胞間接続を維持するという利点を提示する。
組織図スライスは、海馬4、皮質5、線条体6、小脳4、7、および脊髄8、9などの中枢神経系の多くの部分から培養されている。彼らは創薬研究10の強力なツールであることが証明されています。神経活性分子の効果は、免疫染色および生化学アッセイを用いた生存および神経変性、神経回路形成、または電気生理学とライブイメージングを用いた破壊など、多くの方法で評価することができる。
この研究の目的は、小脳の発達をインビトロで模倣する関連モデルであることが知られている組織性小脳スライス培養を行う簡単な方法を記述することです。特に、プルキンエ細胞発達死の研究に着目した。生体内では、プルキンエ細胞は、出生後の最初の週にアポトーシスを受け、出生後3日目(P3)11でピークに達する。小脳スライス培養においても同じパターンが観察され、P1とP8の間の動物からセレベラを採取するとプルキンエニューロンがアポトーシスによって死亡し、ピークはP34、12である。組織性小脳スライス培養物の使用は、いくつかの神経保護分子7、13を同定することを可能にし、ならびにこのプログラムされた細胞死14、15、16に関与するメカニズムの一部を理解することを可能にした。ここでは、海馬におけるStoppiniらの研究に基づくプロトコルを記述し、Dusartら4による小脳に適応した出生後セレベラの急速な解剖および切り刻みが含まれる。神経保護治療の有無にかかわらず、微多孔膜を含む細胞培養インサートに培養をスライスする。および免疫蛍光染色は、神経細胞の生存を評価する。
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Protocol
動物を含むすべての実験は、ノースウェスタン大学動物研究委員会に従って行われた。
1. 組織性小脳スライス培養前の準備
- 70%エタノールを事前に噴霧した細胞培養フードで、滅菌ボトルレシーバーに取り付けられた250mLボトルトップ真空フィルターで200mLの培養培地を調製します。基底ミディアムイーグル(BME)、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)の50 mL、熱不活性化馬血清の50 mL、200 mM L-グルタミン(最終濃度1mM)の1mL、200g/Lグルコース(最終濃度5mg/mL)の5mLを加えます。培養培地を真空フィルターし、+4°Cで1ヶ月まで保持します。
- 殺菌されたバイオセーフティキャビネットで、パッケージから6ウェル培養プレートを取り出します。培養培地1mLで各ウェルを充填します。治療がテストされた場合は、薬理学的薬剤を適切に処理し、コントロールウェル用の同じ量の車両溶液を追加します。本研究では、処理井戸に滅菌3M KCl溶液を1μL、無菌水を1μLをコントロールウェルに添加した。
- 親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜(細孔サイズ=0.4μm)で個々に包まれた細胞培養物の必要数を細胞培養フードの中に持ち込みます。慎重にそれらをラップ解除し、無菌鉗子で細胞培養挿入物を取り出します。インサート膜と細胞培養培地との界面で気泡を避け、6ウェルプレートのウェルに1つずつドロップします。培地中のインサートを37°C、5%CO2インキュベーターで少なくとも2時間培養前に平衡化させる。
メモ:組織チョッパーは、永久に細胞培養フードに存在する。 - 200 mL ビーカー 2 つ、1 つは 150 mL の無菌水で満たされ、もう 1 つは 150 mL 70% エタノールで満たされます。70%エタノール浴に外科用具を浸し、使用する前に水に浸します。
メモ:エタノールと接触した直後に手術用具を使用しないでください。 - 70%エタノールビーカーの両刃を消毒する。滅菌鉗子を使用してブレードホルダーに置き、ブレードクランプレンチを使用して所定の位置に保持します。使用するまで乾燥させてください。
- 70%エタノールビーカーにティッシュチョッパーを備えたプラスチックディスクを消毒する。ディスクを置く前に、70%エタノールで切断テーブルをスプレーします。使用するまで乾燥させてください。
2. 解剖と小脳の乱視スライス文化
- マウスの子犬を細胞培養フードの中に入れて解剖を行います。
- まっすぐな操作はさみを使用して子犬を素早く切り捨てなさい(図1A)。
- まっすぐなドレッシング鉗子で鼻で子犬の頭を保持しながら、まっすぐな目のはさみで頭皮を切り開き、後端から始めて、横から中線に向かいます。
- 頭蓋骨について同じように進みます。
メモ:解剖中に小脳に損傷を与えないように、はさみの先端を外側に向けてください。 - 脳を取り出し、冷たいHBSS + 5 mg /mLグルコースで満たされた60ミリメートルの皿に転送します。
- 滅菌ストレートファイン鉗子を用いて小脳を慎重に解剖する(図1B)。滅菌曲線細かい鉗子を使用して、組織チョッパーの切断テーブルに置かれたプラスチックディスクに移します。
- 切断テーブルを回転させて組織の向きを変え、準円部切片を行う。
- テーブルリリースノブを右に引っ張って切断テーブルを動かして、ブレードが組織の端に配置されるようにします。
- スライスの厚さを350μmに、ブレードの速度を中程度に調整します。
- チョッパーを起動します。小脳全体をスライスしたら(図1C)、チョッパーをオフにします。
- 滅菌鉗子でプラスチックディスクを取り外します。
- プラスチックディスクをHBSS + 5 mg/mLのブドウ糖を含む60mm皿に慎重に近づけます。ピペット冷たいHBSS + 5 mg /mLグルコースは、無菌転写ピペットを使用して組織上にグルコースを、緩衝液で満たされた皿の小脳スライスの収穫を可能にする。
- マイクロプローブを使用して小脳スライスを互いに分離します。転写ピペットで良質のセクションを取り出し(真ん中に近い組織切片を使用することをお勧めします)、予備平衡細胞培養挿入物でそれらをドロップします(図1D)。
- マイクロプローブを使用して細胞培養インサートに小脳スライスを配置し、転写ピペットで余分なHBSS + 5 mg/mLグルコース溶液を慎重に除去します。
メモ:この段階では、組織は非常に圧痛があり、物理的な損傷を受けやすいです。細胞培養挿入物当たりの小脳スライスの最大数は、ドナー動物の年齢に依存する。6 ~8 個のスライスは、P0~P4 齢の動物の場合は培養でき、P5 より古い動物の場合は 4 ~ 6 個のスライスを培養できます。 - 培養器に培養皿を入れ、2~3日ごとに培地を完全に交換します。
- プルキンエ細胞の生存を評価するために、スライスはインビトロで5日早く収集することができる。その他の目的のために、それらは数週間培養中に維持することができる(図1F)。
注:プルキンエ細胞生存実験の場合、細胞培養培地を変える際に薬理学的治療を更新する必要はない(図1F)。
3. 免疫蛍光
- インキュベーターから6ウェルプレートを取り出します。細胞培養培地を除去し、細胞培養インサートを1x PBSで洗浄し、冷たい4%パラホルムアルデヒド溶液を1時間固定し、細胞培養インサートの下に1mL、細胞培養インサートの上に500μLを加えた。
- インサートを1x PBSで4x 10分洗い、インサートの上に1mL、インサートの上に500°Lを、軌道シェーカーで洗浄します。
- ブラシを使用して、1細胞培養インサートから14ウェルプリフィルド1ウェルの1ウェルに小脳スライスを移し、1x PBS、0.25%トリトンX-100、および3%BSA(PBS-TB)、500 μL/ウェルをあらかじめ入力します。
- 室温で1時間PBS-TBでインキュベーションしてスライスを透過・ブロックします。
- PBS-TB溶液中で希釈した一次抗体を用いてインキュベートし、+4°で一晩、軌道シェーカー上で、200μL/ウェル。
- 翌日は、軌道シェーカー500μL/ウェルで1x PBSで10分の4回のワッシュを行います。
- PBS-TB溶液中で希釈された二次抗体を用いてインキュベートし、室温で2時間、軌道シェーカー上で、光から保護し、200μL/ウェル。
- 軌道シェーカー、500 μL/ウェルで1x PBSで10分の4回のワッシュを行います。
- Hoechst 33342を使用してスライスを反染色し、1x PBS(2μg/mL)で希釈し、室温で10分間、光から保護し、500 μL/ウェル。
- 小脳スライスを転写ピペットで顕微鏡スライドに取り付けます。光から保護された空気を完全に乾燥させます。1x PBSで再加湿し、取り付け媒体(約80°L)の数滴で覆われたカバースリップを適用します。泡を作ることは避けてください。
- 取り付け媒体が治ったら、小脳のセクションはイメージする準備ができている。
4. 細胞生存のイメージングと定量
- 製造元やイメージングコア施設の指示に従って、顕微鏡やレーザーの電源を入れます。
- 取得ソフトウェアを起動します。
- 10X の目的を使用して、9 ~ 10 個の小葉 (通常は真皮に近い小脳セクション) を存在する未変更の小脳スライスを見つけます。
- Z スタック取得をアクティブにします。小脳スライスに存在するすべてのプルキンエ細胞を含むように Z スタックの範囲を定義します。2μmのステップサイズを設定し、取得を開始します。取得した画像を取得ソフトウェアの製造元の形式で保存し、関連するメタデータを保持します。
- バイオフォーマットプラグイン18を使用してImageJで取得したファイルを開きます。
- [イメージ] > [スタック] > [Z プロジェクト... (図 2A) ] に移動します。
- [投影タイプ]ドロップダウン メニューで[最大強度]を選択し、[OK](図 2B)をクリックします。
- フラット化された 2-D イメージが生成されます。[マルチポイント]ツールをダブルクリックして、[ポイントツール]ウィンドウを表示します。[ラベルポイント] オプションをオフにすると、カウントされたセルの視覚化が容易になります。次に、プルキンェ細胞のソーマを直接クリックしてカウントを開始します(図1E)。カウントされたセルの総数は、[ポイント ツール] ウィンドウの下部に表示されます (図 3)。
メモ:通常、細胞培養挿入物あたり9~10個の小葉を含む少なくとも3つの損傷のないセクションを定量化することができます。薬理学的薬剤の神経保護効果を評価するために、少なくとも3つの独立した実験を行う必要があります。
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Representative Results
図4に示すように、このプロトコルは、プルキンエ細胞生存を免疫蛍光および画像取得ステップに従って評価することができる組織図小脳スライス培養物を生成する。プルキンジェ細胞を抗カルビンジンD-28K(希釈1/200)およびAlexa594抗マウス(希釈1/300)抗体の組み合わせで標識した。画像ステッチは、顕微鏡取得ソフトウェア(NIS-Elements)によって自動的に行われ、小脳スライス全体の画像を得た。スライスあたりのPurkinjeセル番号は、チャートを生成し、統計分析を実行するためにPrism 8ソフトウェアに入力されました。P6では、プルキンエ細胞の生存率はコントロールが低く、既知の脆弱性ウィンドウ4(図4A,E)と一致していました。ドナー動物が年を取り、この重要な期間を終了するにつれて生存率が増加しました (図 4C,E)。小脳スライスを高いKCl濃度で処理し、脱分極と生存14を正常に誘導した(図4B,D,E)。
図1:解剖からプルキンイェ細胞生存率までのプロトコルの図
マウスの子犬はすぐに首を切り落とされます (A).脳解剖後、小脳を単離し(B)、350μm幅のスライス(C)に切り刻む。小脳切片は、コントロールまたは処理された細胞培養インサート(D)上に配置され、インビトロで少なくとも5日間培養中に維持される。その後、組織を4%パラホルムアルデヒドに固定し、免疫染色を行い、共焦点顕微鏡で写真を取得します。最後に、Purkinje セル番号は ImageJ のマルチポイント ツール (E) を使用して各スライスで定量化されます。(F)培養中のKCl処理の経時経過の概略図この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 定量化前に 3D スタックをフラット化するために使用する ImageJ 設定この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 定量化される小脳スライスの例を使用して、ImageJ のマルチポイント ツールを使用して Purkinje セル番号をカウントするために使用される設定。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:高KCl処理後の組織性小脳スライス培養におけるプルキンジェ細胞生存。
出生後6日目(A、B)または8(C、C'、D、D')で撮影された小脳スライスの代表的な画像は、未処理(A、C、C')または30mM KCl(B、D、D')で処理される。 (C'およびD')CおよびDの白いボックス化された領域の高い倍率ビュー 。スライスは固定前に5日間インビトロで保存した。プルキンエ細胞は、赤でカルビンジンD-28Kで標識されています。スケール バー = 500 μm (A–D)、および 100 μm (C 'およびD')。(E)P6およびP8培養物からのプルキンエ細胞生存の定量は、30mM KClで対照または処理された、治療によるより高い生存率を示す(Mann-Whitney試験、n=3〜5スライス)。データは平均 ±SEM で表されます。
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Discussion
小脳スライス培養は、出生後の発達中にプログラムされたプルキンエ細胞死を研究するための強力なツールです。この技術は、その神経保護電位の候補分子を迅速にスクリーニングするために使用することができる。主な利点は、セットアップがシンプルで非常に費用対効果が高く、機器への適度な投資を必要とすること(ビブラートームはティッシュチョッパーの3倍以上のコストがかかる)ということです。さらに、1匹のマウスの子犬から10~15個の健康なスライスを生成できるため、1匹の動物のみを用いて異なるアッセイを並行して行うことができます。
一貫した再現性の高い結果を得るためには、できるだけ効率的に培養を行い、培養する健康な小脳切片を選択することが重要です。この方法は、長期培養(数ヶ月まで)にも適しています。だから, 汚染や抗生物質で培養を補う必要性を避けるために解剖とチョッピングプロセス中に良好な無菌技術を使用することが不可欠です.
小脳スライス培養モデルは、組織切片の平面および培養領域における既存の細胞間相互作用を保持する。これには注意が必要です: カルチャ領域外のターゲットとの接続が切断される可能性があります。アフェレント繊維によって提供される神経栄養因子の供給は、同様に中止され、神経細胞の生存を損なう可能性があります。これは、組織学的なスライスの共培養を行うことによって部分的に回避することができます。下のオリーブスライス培養物14、19と共培養すると、登山繊維が出生後小脳スライス培養物に浸透できることが示されている。さらに興味深いことに、登山繊維によって接触したプルキンエ細胞は14を生き残った。
ここでは、発達中の小脳における神経保護分子を探索するためのオルガノミピックスライス培養の使用に焦点を当てた。しかしながら、この方法は、神経変性20、軸索再生21、および神経回路活動のモニタリングなどの他の条件にも等しく適している。培養後のアプリケーションは、免疫蛍光を超えています。スライスは、所定の化合物の神経保護効果に関与する生物学的メカニズムを調べるために、生化学的または遺伝子発現研究に使用することができる。全体として, このモデルは、生体内試験の前に新しい神経活性分子を見つけるための基礎を築くことができ、生体内の機械的研究に効果的かつ信頼性の高いサプリメントになります.
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
イメージング作業は、ロバートHルーリー総合がんセンターに授与されたNCI CCSG P30 CA060553によって寛大にサポートされているノースウェスタン大学先端顕微鏡センターで行われました。ショーン・マクダーモットの技術支援とサポートに感謝し、図1に示す手描きのイラストに対するマヤ・エプスタインに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
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