Summary
Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.
Abstract
Organotypic 슬라이스 배양은 분리된 1차 세포 배양보다 생체 내 상태를 더 가깝게 모방하는 강력한 시험관 내 모델입니다. 초기 출생 후 발달에서, 소뇌 Purkinje 세포는 그(것)들이 프로그램한 세포 죽음을 겪는 동안 취약한 기간을 통과하는 것을 알려지고 있습니다. 여기서, 우리는 이 중요한 시간 동안 마우스 organotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 슬라이스는 Purkinje 세포 생존및 신경 보호 처리의 효험을 평가하기 위하여 추가 표지됩니다. 이 방법은 새로운 신경 활성 분자를 선별하는 데 매우 유용 할 수 있습니다.
Introduction
생체 외 모델링은 생물 의학 연구에 필수적인 도구입니다. 그것은 조사자가 공부하고 제한한 세포 모형에 있는 특정 기계장치를 단단히 통제할 수 있습니다, 또는 고립된 시스템/기관에서. 오르가노티픽 슬라이스 배양은 특히 신경과학 분야에서 시험관내 기술로 널리 사용되고있다 1. 이 방법은 먼저 롤러 튜브 기술2를사용하여 뇌 조각을 배양한 Gähwiler에 의해 처음 확립되었으며, 나중에 야마모토 등에서 수정되었으며, 이들은 피질 슬라이스 배양을 수행하기 위해 미세 다공성 멤브레인의 사용을도입했습니다 3. 1 차적인 세포 배양에 비해, organotypic 슬라이스 배양은 조직의 세포 아키텍처를 보존하는 이점을 제시, 조직 섹션의 평면에서 뿐만 아니라 네이티브 세포 세포 연결.
Organotypic 조각은 해마4,피질5,줄무늬6,소뇌4,7,척수8,9,다른 사람의 사이에서 와 같은 중추 신경계의 많은 부분에서 배양되었습니다. 그들은 약물 발견 연구에서 강력한 도구로 입증되었습니다10. 신경 활성 분자의 효과 여러 가지 방법으로 평가 될 수 있다: 면역 염색 및 생화학 분석, 신경 회로 형성, 또는 전기 생리학 및 라이브 이미징을 사용 하 여 중단을 사용 하 여 생존 및 신경 변성.
이 작업의 목적은 시험관에서 소뇌 발달을 모방하는 관련 모델로 알려져 있는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화를 수행하는 간단한 방법을 설명하는 것입니다. 특히, 우리는 Purkinje 세포 발달 죽음의 연구 결과에 집중했습니다. 생체 내에서, Purkinje 세포는 출생 후 첫 번째 주 동안 세포 자멸을 겪고, 출생 후 일 3 (P3)11에피크. 소뇌 슬라이스 배양에서 동일한 패턴이 관찰되며, 세레베야가 P1과 P8 사이의 동물로부터 채취될 때, P34,12에서피크를 가진 후발성 세포사멸에 의해 죽어가는 Purkinje 뉴런과 함께 관찰된다. organotypic 소뇌 슬라이스 배양의 사용은 여러 신경 보호분자를식별 할 수 있다7,13,뿐만 아니라 이 프로그램 된 세포 사멸에 관련된 메커니즘의 일부를 이해14,15,16. 여기서, 우리는 해마에서 Stoppini et al.17의 연구에 기초한 프로토콜을 설명하고, Dusart et al.4에 의해 소뇌에 적응하여 산후 뇌의 급속한 해부 및 절단을 포함한다; 미세다공막을 함유하는 세포 배양 삽입체상에 배양물을 슬라이스하는 경우, 신경보호 치료 유무에 관계없이; 및 면역 형광 염색신경 생존을 평가하기 위해.
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Protocol
동물과 관련된 모든 실험은 노스웨스턴 대학 동물 연구 위원회에 따라 수행되었다.
1. 오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양 전 준비
- 사전에 70% 에탄올로 분무된 세포 배양 후드에서 멸균 병 수신기에 부착된 250 mL 병 상판 진공 필터에 배양 배지 200 mL를 준비합니다. 기저 중간 이글 100 mL(BME), 행크스 균형 소금 용액 50 mL(HBSS), 50 mL의 열 불활성화 말 세럼, 200 mM L-글루타민 1mL(최종 농도 1mM), 5 mL 의 200 g/L 글루코스(최종 농도 5 mg/mL)를 추가합니다. 배양 배지를 진공 걸이하고 최대 한 달 동안 +4 °C로 유지하십시오.
- 멸균 된 생물 안전 성 캐비닛에서 패키지에서 6 웰 배양 플레이트를 꺼내십시오. 배양 배지 1 mL로 각 우물을 채웁니다. 치료가 시험되는 경우, 약리학 적 제제를 잘 처리하고, 대조군을 위한 동일한 부피의 비컨티컬 용액을 잘 첨가한다. 본 연구에서, 우리는 잘 처리 된 잘 (30 mM 최종) 및 제어 웰에 멸균 수의 1 μL 3 M KCl 용액을 추가했다.
- 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인(공극 크기 = 0.4 μm)을 가진 개별적으로 래핑된 세포 배양 삽입물의 필요한 수의 세포 배양 후드 내부를 가져온다. 조심스럽게 포장을 풀고 멸균 집게로 세포 배양 삽입을 꺼내십시오. 삽입 막과 세포 배양 배지 사이의 계면에서 기포를 피하면서 6 웰 플레이트의 우물에 하나씩 떨어 뜨립니다. 인서트가 배양 전 적어도 2시간 동안 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 배지에서 평형을 지게 한다.
참고: 조직 헬기는 세포 배양 후드에 영구적으로 존재합니다. - 200 mL 비커 2개, 하나는 150 mL 멸균수로 채워지고 다른 하나는 150 mL 70% 에탄올로 채워져 있습니다. 수술 도구를 70% 에탄올 목욕에 담근 다음 사용하기 전에 물에 담급강하십시오.
참고: 에탄올과 접촉 한 직후 수술 도구를 사용하지 마십시오. - 70% 에탄올 비커에 양날 블레이드를 소독합니다. 멸균 집게를 사용하여 블레이드 홀더에 놓고 블레이드 클램프 렌치를 사용하여 제자리에 고정시면 됩니다. 사용할 때까지 말려 주세요.
- 70% 에탄올 비커에 티슈 헬기와 함께 제공된 플라스틱 디스크를 소독합니다. 디스크를 놓기 전에 70% 에탄올로 절단 테이블에 스프레이하십시오. 사용할 때까지 말리십시오.
2. 해부 및 소뇌 오르가노티픽 슬라이스 배양
- 마우스 새끼를 세포 배양 후드 내부에 가져와 해부를 수행한다.
- 직선 작동 가위를 사용하여 신속하게 강아지를 참수(그림 1A).
- 직선 드레싱 집게와 코에 의해 강아지의 머리를 잡고있는 동안, 직선 눈 가위를 사용하여 두피를 잘라, 후방 끝에서 시작, 중간 선에 측면으로 이동.
- 두개골에 대해 동일하게 진행합니다.
참고: 해부 중에 소뇌가 손상되지 않도록 가위 끝을 바깥쪽으로 가리십시오. - 뇌를 꺼내서 차가운 HBSS + 5 mg /mL 포도당으로 채워진 60mm 접시로 옮김하십시오.
- 멸균 스트레이트 미세 집게를 사용하여 소뇌를 조심스럽게 해부하십시오(그림 1B). 멸균 곡선 미세 집게를 사용하여 조직 헬기의 절단 테이블에 배치 된 플라스틱 디스크에 전송합니다.
- 절단 테이블을 회전시켜 조직을 방향을 지정하여 기생충 절편을 수행한다.
- 블레이드가 조직의 가장자리에 배치되도록 테이블 릴리스 노브를 오른쪽으로 당겨 절단 테이블을 이동합니다.
- 슬라이스 두께를 350 μm로 조정하고 블레이드 속도를 중간크기로 조정합니다.
- 헬기를 시작합니다. 소뇌 전체가 슬라이스되면(그림 1C),헬기를 끕니다.
- 멸균 집게로 플라스틱 디스크를 분리합니다.
- 플라스틱 디스크를 HBSS + 5 mg/mL 의 포도당이 들어 있는 60mm 접시에 조심스럽게 가져가십시오. 피펫 차가운 HBSS + 5 mg /mL 포도당은 완충제 접시에서 소뇌 슬라이스의 수확을 허용하기 위해 멸균 전달 파이펫을 사용하여 조직에.
- 마이크로 프로브를 사용하여 소뇌 조각을 서로 분리합니다. 전사 파이펫으로 양질의 섹션을 꺼내 (vermis에 가까운 조직 섹션을 사용하는 것이 좋습니다) 미리 균형 조정 된 세포 배양 삽입(그림 1D)에떨어 뜨립니다.
- 마이크로프로브를 사용하여 세포 배양 삽입에 소뇌 슬라이스를 배치한 다음, 전달 파이펫으로 초과 HBSS + 5 mg/mL 포도당 용액을 조심스럽게 제거합니다.
참고: 이 단계에서 조직은 매우 부드럽고 물리적 인 손상이 발생하기 쉽습니다. 세포 배양 삽입 당 소뇌 슬라이스의 최대 수는 기증자 동물의 나이에 따라 달라집니다. P0-P4-늙은 동물에 대해 6-8슬라이스를 배양할 수 있으며, P5보다 오래된 동물을 위해 4-6슬라이스를 배양할 수 있습니다. - 배양 접시를 인큐베이터에 놓고 매 2-3 일마다 매체를 완전히 변경하십시오.
- Purkinje 세포 생존을 평가하기 위해, 슬라이스는 시험관 내에서 5 일 이내에 수집 될 수있다. 다른 목적을 위해, 그들은 몇 주 동안 문화에서 유지 될 수있다(그림 1F).
참고: Purkinje 세포 생존 실험의 경우, 세포 배양 배지를 변경할 때 약리학적 치료를 갱신 할 필요가 없습니다(도 1F).
3. 면역 형광
- 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼낸다. 세포 배양 배지를 제거하고, 1x PBS로 세포 배양 삽입을 세척하고, 1시간 동안 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 슬라이스를 고정하고, 세포 배양 삽입하에 1 mL 및 500 μL을 세포 배양 삽입위에 부착하였다.
- 인서트를 1x PBS로 4x 10분 간 세척하고, 1mL 언더와 500 μL을 인서츠 상단에 오비탈 셰이커에 두립니다.
- 브러쉬로 소뇌 슬라이스를 1 세포 배양 삽입에서 1x PBS, 0.25 % 트리톤 X-100 및 3 % BSA (PBS-TB), 500 μL / well으로 미리 채워진 24 웰의 1 웰로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 돕습니다.
- 실온에서 1시간 동안 PBS-TB에서 배양하여 슬라이스를 투과하고 차단합니다.
- PBS-TB 용액에서 희석된 1차 항체로 배양하고, + 4°C에서, 궤도 셰이커, 200 μL/well에 투게소합니다.
- 다음 날, 궤도 셰이커, 500 μL/well에서 1x PBS로 10분 동안 4번의 세차서를 수행합니다.
- PBS-TB 용액에서 희석된 이차 항체로 배양하고, 실온에서 2시간, 궤도 셰이커에서, 그리고 빛으로부터 보호, 200 μL/well.
- 궤도 셰이커, 500 μL/well에서 1x PBS로 10분 동안 4번의 세실을 수행합니다.
- 1x PBS (2 μg / mL)로 희석 된 Hoechst 33342를 사용하여 슬라이스를 실온에서 10 분 동안 사용하여 빛으로부터 보호, 500 μL / well을 사용하여 슬라이스를 얼룩지게하십시오.
- 이송 피펫으로 현미경 슬라이드에 소뇌 슬라이스를 장착합니다. 빛으로부터 완전히 공기 건조시키십시오. 1x PBS로 다시 가습하고 장착 매체 (~ 80 μL)의 몇 방울로 덮여 커버 슬립을 적용합니다. 거품을 만들지 마십시오.
- 마운팅 매체가 경화되면 소뇌 절편을 이미지화 할 준비가됩니다.
4. 세포 생존의 화상 진찰 그리고 정량화
- 제조업체 및/또는 이미징 코어 시설의 지침에 따라 현미경 및 레이저를 켭니다.
- 수집 소프트웨어를 시작합니다.
- 10X 목표를 사용하여 9-10 개의 소엽 (일반적으로 소뇌 섹션이 vermis에 가까운)을 제시하는 변경되지 않은 소뇌 조각을 찾습니다.
- z 스택 획득을 활성화합니다. 소뇌 슬라이스에 존재하는 모든 Purkinje 세포를 포함하는 z-stack의 범위를 정의한다. 2 μm 단계 크기를 설정하고 수집을 시작합니다. 수집된 그림을 수집 소프트웨어 제조업체의 형식으로 저장하여 관련 메타데이터를 보존합니다.
- 바이오 포맷 플러그인18을사용하여 ImageJ에서 획득 한 파일을 엽니 다.
- 이미지 > 스택 > Z 프로젝트로 이동 ...(그림 2A).
- 투영 유형 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택하고 확인(그림 2B)을클릭합니다.
- 병합된 2-D 이미지가 생성됩니다. 다중 점 도구를 두 번 클릭하여 점 도구 창이 표시되도록 합니다. 레이블 점 옵션의 선택을 취소하여 계산된 셀 시각화를 용이하게 합니다. 그런 다음 Purkinje 세포의 소마를 직접 클릭하여 계수를 시작합니다(그림 1E). 계산된 셀의 총 수는 점 도구 창 의 하단에 표시됩니다(그림3).
참고: 일반적으로 세포 배양 삽입 당 9-10 개의 소엽을 포함하는 적어도 3 개의 손상되지 않은 섹션이 정량화 될 수 있습니다. 약리학적 인 에이전트의 신경 보호 효과를 평가하려면 적어도 3 개의 독립적 인 실험을 수행해야합니다.
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Representative Results
도 4에도시된 바와 같이, 이 프로토콜은 Purkinje 세포 생존이 면역 형광 및 이미지 획득 단계에 따라 평가될 수 있는 orgnotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 생성한다. 퍼킨제 세포는 항칼빈딘 D-28K(희석 1/200) 및 Alexa594 항마우스(희석 1/300) 항체의 조합으로 표지되었다. 이미지 스티칭은 전체 소뇌 슬라이스의 그림을 얻기 위해 현미경 수집 소프트웨어 (NIS-Elements)에 의해 자동으로 수행되었다. 슬라이스당 Purkinje 셀 번호는 차트를 생성하고 통계 분석을 수행하기 위해 프리즘 8 소프트웨어에 입력하였다. P6에서, Purkinje 세포 생존율은 그들의 공지된 취약성 창4와 일치하는 대조군에서 낮았다(도4A,E). 기증자 동물이 나이가 들고 이 중요한 기간을 종료함에 따라 생존이 증가했습니다(그림4C,E). 소뇌 슬라이스는 그들의 탈분극 및 생존을 성공적으로 유도하기 위해 높은 KCl 농도로처리하였다(도 4B, D, E).
도 1: Purkinje 세포 생존 정량화로 해부로부터 프로토콜의 예시.
마우스 강아지는 신속하게 참수(A). 뇌 해부에 따라 소뇌가 분리되고(B),350 μm 폭 슬라이스(C)로다진 후. 소뇌 절편은 대조군 또는 처리된 세포배양 삽입체(D)에 배치되고 시험관 내에서 적어도 5일 동안 배양내에서 유지된다. 조직은 4 % 파라 포름 알데히드에 고정되고 면역 염색이 수행되고 사진은 공초점 현미경으로 획득됩니다. 마지막으로, Purkinje 셀 번호는 ImageJ(E)의멀티 포인트 도구를 사용하여 각 슬라이스에서 정량화됩니다. (F)배양 시 KCl 치료의 시간 과정의 개략적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 정량화 전에 3D 스택을 병합하는 데 사용되는 ImageJ 설정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미지J의 다중 지점 도구를 사용하여 Purkinje 셀 번호를 계산하는 데 사용되는 설정과 소뇌 슬라이스의 예가 정량화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 높은 KCl 처리에 이어 오르노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존.
6일째(A, B)또는 8(C,C' , D, D')또는 30 mM KCl(B, D, D')으로처리된소뇌 슬라이스의 대표적인 이미지. (C'와 D') C 및 D의흰색 박스 영역의 더 높은 배율 뷰. 슬라이스는 고정 하기 전에 시험관내에서 5일 동안 보관되었다. Purkinje 세포는 적색에 칼빈딘 D-28K로 표지됩니다. 배율 막대 = 500 μm(A–D)및 100 μm(C' 및 D)) (e)P6 및 P8 배양물로부터의 Purkinje 세포 생존의 정량화, 30 mM KCl으로 대조 또는 처리, 치료와 함께 더 높은 생존을 나타낸다 (Mann-Whitney test, n= 3 = 3 ~ 5 슬라이스). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다.
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Discussion
소뇌 슬라이스 배양은 산후 발달 중에 프로그램된 Purkinje 세포 사멸을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 그들의 신경 보호 잠재력을 위한 후보 분자를 급속하게 스크리는 것을 이용될 수 있습니다. 주요 장점은 설정이 간단하고 매우 비용 효율적이며, 단지 장비에 적당한 투자가 필요하다는 것입니다 (진동은 조직 헬기보다 최대 3 배 더 많은 비용이 들 수 있습니다). 또한, 10 ~15개의 건강한 슬라이스를 하나의 마우스 새끼에서 생성할 수 있으며, 한 동물만 사용하여 다른 실험을 병렬로 수행할 수 있습니다.
일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면 가능한 한 효율적으로 배양을 수행하고 배양 할 건강한 소뇌 섹션을 선택하는 것이 중요합니다. 이 방법은 장기 배양(최대 수개월)에도 적합합니다. 따라서 오염을 피하기 위해 해부 및 자르는 과정에서 좋은 무균 기술을 사용하고 항생제로 배양을 보충할 필요성을 방지하는 것이 필수적입니다.
소뇌 슬라이스 배양 모델은 조직 섹션의 평면에서, 그리고 배양된 영역에서 기존의 세포-세포 상호작용을 보존한다. 이는 배양된 지역 외부의 대상과의 연결이 끊어질 수 있다는 주의사항입니다. 구심성 섬유에 의해 제공 되는 신경 영양 요인에 공급 뿐만 아니라 중단 될 수 있습니다 및 신경 생존을 손상. 이것은 부분적으로 organotypic 슬라이스 공동 배양을 수행하여 회피 할 수 있습니다. 등반 섬유는 열등한 올리브 슬라이스배양배양14,19와함께 배양할 때 산후 소뇌 슬라이스 배양에 침투할 수 있는 것으로 나타났다. 더 흥미롭게도, 등반 섬유에 의해 접촉 Purkinje 세포는14살아남았다.
여기에서, 우리는 개발 소뇌에 있는 신경 보호 분자를 검색하기 위하여 organotypic 조각 문화의 사용에 집중했습니다. 그러나, 이 방법은신경변성(20)및축축재생(21)및신경회로활성(22,23)의모니터링과 같은 다른 조건에 도 동일하게 적합하다. 포스트 컬쳐 응용은 면역 형광을 넘어. 슬라이스는 주어진 화합물의 신경 보호 효과에 관여하는 생물학적 기전을 조사하기 위해 생화학적 또는 유전자 발현 연구에 사용될 수 있다. 전부, 이 모델은 생체 내 테스트 전에 새로운 신경 활성 분자를 찾기위한 기초를 마련하고 생체 내 기계학 연구에 효과적이고 신뢰할 수있는 보충될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
화상 진찰 일은 로버트 H 루리 포괄적인 암 센터에 수여된 NCI CCSG P30 CA060553에 의해 관대하게 지원되는 고급 현미경 검사법에 대한 노스웨스턴 대학 센터에서 행해졌습니다. 숀 맥더모트의 기술 지원과 지원에 감사드리며, 그림 1에나타난 손으로 그린 그림에 대해 마야 엡스타인에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
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