Summary
Organotypic skive kulturer er et kraftig verktøy for å studere neurodevelopmental eller degenerative/regenererende prosesser. Her beskriver vi en protokoll som modeller den neurodevelopmental død Purkinje celler i mus lillehjernen skive kulturer. Denne metoden kan ha nytte forskning i nervecellene narkotika funn.
Abstract
Organotypic Slice-kultur er en kraftig in vitro-modell som mimicks in vivo-tilstander tettere enn dissosiert primær cellekulturer. I tidlig postnatal utvikling, lillehjernen Purkinje celler er kjent for å gå gjennom en sårbar periode, der de gjennomgår programmert celle død. Her gir vi en detaljert protokoll for å utføre musen organotypic lillehjernen Slice kultur i denne kritiske tiden. Skivene er videre merket for å vurdere Purkinje celle overlevelse og effekten av nervecellene behandlinger. Denne metoden kan være svært verdifull for skjermen for nye neuroactive molekyler.
Introduction
In vitro modellering er et viktig verktøy i biomedisinsk forskning. Det gjør at etterforskerne å studere og tett kontroll spesifikke mekanismer i begrensede celletyper, eller i isolerte systemer/organer. Organotypic Slice kultur er en mye brukt in vitro teknikk, spesielt innen nevrovitenskap1. Metoden ble først etablert av Gähwiler, som kultivert hjerne skiver ved hjelp av valsen tube teknikk2, og senere endret av Yamamoto et al., som introduserte bruk av en mikroporøse membran for å utføre kortikale Slice kulturer3. Sammenlignet med primær cellekulturer, organotypic skjære kulturer presentere fordelen av å bevare cytoarchitecture av vevet, samt native celle-celle-tilkoblinger i planet av vevet delen.
Organotypic skiver har blitt kultivert fra mange deler av det sentrale nervesystemet, slik som hippocampus4, cortex5, striatum6, lillehjernen4,7og ryggmarg8,9, blant andre. De har vist seg å være et kraftig verktøy i stoffet funnet studier10. Virkningene av neuroactive molekyler kan vurderes på mange måter: overlevelse og neurodegeneration ved hjelp av immunostaining og biokjemi analyser, neuronal krets formasjon, eller forstyrrelse ved hjelp av elektrofysiologi og live-Imaging.
Målet med dette arbeidet er å beskrive en enkel metode for å utføre organotypic lillehjernen skive kultur, som er kjent for å være en relevant modell for å etterligne lillehjernen utvikling in vitro. Spesielt fokuserte vi på studiet av Purkinje celle utviklings død. In vivo, Purkinje celler gjennomgår apoptose i løpet av den første postnatal uken, med topp på postnatal dag 3 (P3)11. Det samme mønsteret er observert i lillehjernen Slice kultur, med Purkinje neurons døende av apoptose når cerebella er Hentet fra dyr mellom P1 og P8, med en topp på P34,12. Bruken av organotypic lillehjernen skive kulturer har lov til å identifisere flere nervecellene molekyler7,13, samt forstå en del av mekanismene som er involvert i denne programmerte cellen død14,15,16. Her beskriver vi en protokoll basert på studiet av Stoppini et al.17 i hippocampus, og tilpasset lillehjernen av Dusart et al.4 den inkluderer Rapid disseksjon og hakking av postnatal cerebella; kutting kultur på en cellekultur innsats som inneholder en mikroporøse membran, med eller uten nervecellene behandling; og immunofluorescence flekker å vurdere neuronal overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som involverer dyr ble utført i samsvar med Northwestern University Animal Studies Committee.
1. forberedelse før organotypic lillehjernen sektor kulturer
- I en cellekultur hette sprayet med 70% etanol på forhånd, forberede 200 mL kultur medium i et 250 mL flaske-Top vakuum filterfestet til en steril flaske mottaker. Tilsett 100 mL av basal medium Eagle (BME), 50 mL av Hanks balanserte salt løsning (HBSS), 50 mL varme deaktivert heste serum, 1 mL 200 mM L-glutamin (siste konsentrasjon 1 mM) og 5 mL 200 glukose (siste konsentrasjon 5 mg/mL). Vakuum-filtrerer kultur mediet og holder det ved + 4 ° c i opptil en måned.
- I den sterilisert biosafety skapet, ta ut en 6-brønn kultur plate fra pakken sin. Fyll hver brønn med 1 mL kultur medium. Hvis en behandling er testet, tilsett farmakologisk middel til den behandlede brønnen, og det samme volumet av kjøretøy løsning for kontrollen godt. I denne studien la vi til 1 μL steril 3 M KCl løsning på den behandlede brønnen (30 mM endelig) og 1 μL av sterilt vann til kontroll brønnene.
- Bring inne i cellen kultur panseret det nødvendige antall individuelt innpakket cellekultur innsatser med hydrofile polytetrafluoretylen (PTFE) membran (pore størrelse = 0,4 μm). Forsiktig pakke dem og ta ut cellen kultur inserts med steril tang. Drop dem en etter en i en brønn av en 6-brønn plate, unngå bobler i grensesnittet mellom innsatsen membranen og cellen kultur medium. La inserts likevekt i mediet i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator i minst 2 timer før kultur.
Merk: vevet Chopper bor permanent i cellen kulturen panseret. - Forbered 2 200 mL kanner, en fylt med 150 mL sterilt vann, og den andre fylt med 150 mL 70% etanol. Dypp kirurgiske verktøy i 70% etanol bad og deretter i vann før du bruker dem.
Merk: ikke bruk kirurgiske verktøy umiddelbart etter kontakt med etanol. - Desinfisere den doble kantet blad i 70% etanol beger. Plasser den på bladholderen ved hjelp av steril tang og hold den på plass med kniv skrunøkkelen. La den tørke til bruk.
- Desinfisere plast platen som følger med vevs helikopteret i 70% etanol begeret. Spray skjære bordet med 70% etanol før du plasserer platen på den. La tørke til bruk.
2. disseksjon og lillehjernen Organotypic Slice kulturer
- Bringe musa pup innenfor cellen kulturen Hood å utføre det disseksjon.
- Halshugge det pup rask benytter likefram fungerer saks (skikkelsen 1en).
- Stund avholde det pup ' leder av nesen med likefram dressing tang, kutt åpen hodebunnen benytter likefram øye saks, igangsetting fra det bakre end, og går side å midtlinjen.
- Fortsett identisk for skallen.
Merk: Sørg for å peke saks spisser utover for å unngå skade på lillehjernen under disseksjon. - Ta ut hjernen og overføre den til en 60-mm parabol fylt med kaldt HBSS + 5 mg/mL glukose.
- Forsiktig analysere ut det lillehjernen benytter steril likefram fin tang (skikkelsen 1B). Overfør den til plast platen plassert på skjære bordet av vevet helikopter ved hjelp av sterile buede fine tang.
- Orientere vevet ved å rotere skjære bordet for å utføre parasagittal seksjoner.
- Beveg skjære bordet ved å trekke i bord utløsnings knotten til høyre, slik at bladet er plassert på kanten av vevet.
- Juster skive tykkelsen til 350 μm og blad hastigheten til middels.
- Start helikopteret. Når hele lillehjernen har blitt skiver (figur 1C), slå av helikopteret.
- Fjern plast plate med steril tang.
- Ta forsiktig med plast platen i nærheten av en 60-tallerken som inneholder HBSS + 5 mg/mL glukose. Pipetter kaldt HBSS + 5 mg/mL glukose på vevet ved hjelp av en steril overførings pipette for å tillate høsting av lillehjernen skiver i den buffer fylte parabolen.
- Skill de lillehjernen stykkene fra hverandre ved hjelp av en microprobe. Ta ut god kvalitet seksjoner med overføringen pipette (det anbefales å bruke vev seksjoner som er nær vermis) og slippe dem av i en pre-equilibrated cellekultur sette inn (figur 1D).
- Plasser de lillehjernen sektorene på cellekultur innsatsen ved hjelp av microprobe, og fjern deretter forsiktig den overflødige HBSS + 5 mg/mL glukose oppløsningen med overførings pipette.
Merk: på dette stadiet er vevet ekstremt anbud og utsatt for fysisk skade. Det maksimale antallet lillehjernen skiver per cellekultur innsats avhenger av alderen til donor dyret. 6 – 8 skiver kan være kultivert for et p0 – P4-gammelt dyr, og 4 – 6 skiver for dyr som er eldre enn P5. - Plasser kulturen parabolen i inkubator, endre mediet helt hver 2-3 dager.
- For å vurdere Purkinje celle overlevelse, kan skiver samles så tidlig som 5 dager in vitro. For andre formål, kan de bli opprettholdt i kultur i flere uker (figur 1F).
Merk: når det gjelder Purkinje celle overlevelse eksperimenter, er det ikke nødvendig å fornye farmakologisk behandling ved endring av cellekultur medium (figur 1F).
3. Immunofluorescence
- Ta ut 6-brønn plate fra inkubator. Fjern cellekultur medium, vask cellekultur innsatsen med 1x PBS, og fest skiver med kald 4% paraformaldehyde løsning for 1 t, med 1 mL under cellekultur innsatsen og 500 μL på toppen av cellekultur innsatsen.
- Vask innsatsene 4X 10 min med 1x PBS, med 1 mL under og 500 μL oppå innsatsen, på en orbital shaker.
- Med en pensel, overføre lillehjernen skiver fra 1 cellekultur sett inn til 1 brønn av en 24-vel pre-fylt med 1x PBS, 0,25% Triton X-100, og 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/brønn.
- Permeabilize og blokker skiver ved inkubasjons i PBS-TB for 1 time ved romtemperatur.
- Ruge med primær antistoffer fortynnet i PBS-TB-oppløsning, over natten ved + 4 ° c, på en orbital shaker, 200 μL/brønn.
- Neste dag utfører du fire vasker på 10 minutter med 1x PBS, på en orbital shaker, 500 μL/brønn.
- Ruge med sekundære antistoffer fortynnet i PBS-TB oppløsning, to timer ved romtemperatur, på en orbital shaker, og beskyttet mot lys, 200 μL/brønn.
- Utfør fire vasker på 10 minutter med 1x PBS, på en orbital shaker, 500 μL/brønn.
- Counterstain skiver ved hjelp av Hoechst 33342, fortynnet i 1x PBS (2 μg/mL), i 10 min ved romtemperatur, beskyttet mot lys, 500 μL/brønn.
- Monter de lillehjernen stykkene på et mikroskopi lysbilde med en overførings pipette. La dem lufttørke helt, beskyttet mot lys. Humidify dem på nytt med 1x PBS og Påfør en dekkglass dekket med få dråper festemiddel (~ 80 μL). Unngå å lage bobler.
- Når monterings mediet har herdet, er lillehjernen seksjoner klare til å bli avbildet.
4. bildebehandling og kvantifisering av celle overlevelse
- Slå på mikroskopet og lasere i henhold til instruksjonene fra produsenten og/eller bilde kjerne fasiliteten.
- Start oppkjøpet programvare.
- Ved hjelp av et 10X objektiv, Finn ikke-endrede lillehjernen skiver som presenterer 9-10 lobules (vanligvis lillehjernen seksjoner nær vermis).
- Aktiver kjøp av z-stakk. Definer rekkevidden til z-stakken for å inkludere alle Purkinje-celler som finnes i lillehjernen sektoren. Sett en 2 μm trinn størrelse og starte oppkjøpet. Lagre det mottatte bildet i formatet til produsenten av anskaffelses programvaren for å beholde de tilknyttede metadataene.
- Åpne ervervet filen i ImageJ ved hjelp av bio-formater plugin18.
- Gå til bilde > stabler > Z-Project... (figur 2A).
- Velg Maks intensitet i rullegardinmenyen for projeksjons type, og klikk på OK (figur 2B).
- Et sammenslått 2D-bilde vil bli generert. Dobbeltklikk på flerpunkts verktøyet for å la punkt verktøy vinduet vises. Fjern merkingen av etikett poeng alternativet for å lette telte celler visualisering. Deretter klikker du direkte på en Soma av en Purkinje celle for å begynne å telle (figur 1E). Det totale antallet telte celler vil bli angitt nederst i punkt verktøy vinduet (Figur 3).
Merk: vanligvis, minst 3 ikke-skadede seksjoner som inneholder 9-10 lobules per cellekultur innsats kan være kvantifisert. For å vurdere den nervecellene effekten av en farmakologisk middel bør minst 3 uavhengige eksperimenter utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i Figur 4, produserer denne protokollen organotypic lillehjernen skive kulturer der Purkinje celle overlevelse kan vurderes etter immunofluorescence og bilde oppkjøpet trinn. Purkinje celler ble merket med en kombinasjon av anti-Calbindin D-28K (fortynning 1/200) og Alexa594 anti-mus (fortynning 1/300) antistoffer. Image søm ble gjort automatisk av mikroskop oppkjøpet programvare (NIS-Elements) for å få et bilde av hele lillehjernen skive. Purkinje celle tall per skive ble lagt inn i Prism 8 programvare for å generere diagrammet og utføre statistisk analyse. På P6 var Purkinje celle overlevelse lav i kontrollen, i samsvar med deres kjente sårbarhet vindu4 (Figur 4A, E). Overlevelse økte etter hvert som donor dyret ble eldre og forlot denne kritiske perioden (Figur 4C, E). Lillehjernen skiver ble behandlet med høy KCl konsentrasjon for å kunne indusere deres depolarization og overlevelse14 (Figur 4B, D, E).
Figur 1: illustrasjon av protokollen fra disseksjon til Purkinje celle overlevelse kvantifisering.
Musa valp er raskt halshugget (A). Etter hjerne disseksjon er lillehjernen isolert (B), og deretter hakket i 350 μm-bredde skiver (C). De lillehjernen seksjonene er plassert på en kontroll eller behandlet cellekultur sette inn (D) og vedlikeholdes i kultur i minst 5 dager in vitro. Vevet blir så festet i 4% paraformaldehyde, immunostaining er utført, og bilder er ervervet med et konfokalmikroskopi mikroskop. Til slutt, Purkinje celle nummer er kvantifisert i hver skive ved hjelp av multipunkt verktøyet i ImageJ (E). (F) skjematisk av tiden løpet av KCl behandling under kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ImageJ-innstillinger som brukes til å slå sammen 3D-stakken før kvantifisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: innstillinger som brukes til å telle Purkinje celle nummer ved hjelp av multipunkt verktøyet i ImageJ med et eksempel på en lillehjernen skive blir kvantifisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Purkinje celle overlevelse i organotypic lillehjernen Slice kultur etter høy KCl behandling.
Representativt bilde av lillehjernen skiver tatt på postnatal dag 6 (A, B) eller 8 (c, c ', D, D '), enten ubehandlet (A, c, c') eller behandlet med 30 mm KCl (B, d, d '). (C ' og d') Høyere forstørrelse visning av de hvite eske regionene i C og D. Skiver ble holdt 5 dager in vitro før fiksering. Purkinje celler er merket med Calbindin D-28K i rødt. Scale bar = 500 μm (A-D), og 100 μm (C ' og D '). (E) kvantifisering av Purkinje celle overlevelse fra P6 og P8 kulturer, i kontroll eller behandlet med 30 mm KCl, viser en høyere overlevelse med behandlingen (mann-Whitney test, n = 3 til 5 skiver). Data uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lillehjernen Slice kultur er et kraftig verktøy for å studere programmert Purkinje celle død under postnatal utvikling. Denne teknikken kan brukes til å raskt skjermen kandidat molekyler for deres nervecellene potensial. Den største fordelen er at oppsettet er enkelt og svært kostnadseffektivt, og krever bare en beskjeden investering i utstyr (en vibratome kan koste opptil 3 ganger mer enn et vev helikopter). Dessuten, 10 å 15 rask skive kan utviklet fra ettall musen pup, tillater for annerledes analyser å bli utført parallelt benytter bare ettall dyr.
For å oppnå konsistente og reproduserbar resultater, er det avgjørende å utføre kulturen så effektivt som mulig og å velge sunne lillehjernen seksjoner for å være kultivert. Denne metoden egner seg også for lang tids kultur (opptil flere måneder). Derfor er det viktig å bruke god aseptisk teknikk under disseksjon og hakke prosessen for å unngå forurensninger og behovet for å supplere kulturer med antibiotika.
Den lillehjernen skive kultur modellen bevarer eksisterende celle-celle interaksjoner i planet av vevet delen, og i regionen kultivert. Dette kommer med en påminnelse: forbindelser med mål utenfor den kultivert region kan bli kuttet. Forsyningen i nevrotropisk faktorer som tilbys av afferente Fibre kan seponeres i tillegg og svekke neuronal overlevelse. Dette kan delvis omgås ved å utføre organotypic Slice co-kulturer. Det har vist seg at klatring Fibre kan trenge postnatal lillehjernen skive kulturer når co-kultivert med dårligere Olive Slice kulturer14,19. Mer interessant, Purkinje celler kontaktet av klatring fibre overlevde14.
Her fokuserte vi på bruken av organotypic skive kultur for å søke etter nervecellene molekyler i utviklings lillehjernen. Imidlertid er denne metoden like egnet for andre forhold som neurodegeneration20, axonal gjenfødelse21, og overvåking av neuronal krets aktivitet22,23. Den post-kulturen programmer går utover immunofluorescence. Skiver kan brukes til biokjemiske eller gen uttrykks studier, for å undersøke de biologiske mekanismene som er involvert i den nervecellene effekten av et gitt stoff. Til sammen kan denne modellen legge grunnlaget for å finne nye neuroactive molekyler før in vivo-testing og være en effektiv og pålitelig supplement til in vivo mekanistisk studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Imaging arbeidet ble utført ved Northwestern University Center for Advanced mikroskopi sjenerøst støttet av NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for sin tekniske assistanse og støtte, og Maya Epstein for hånd-tegnet illustrasjoner vist i figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
