Summary
As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.
Abstract
A cultura organotípica da fatia é um modelo in vitro poderoso que imite em condições do vivo mais pròxima do que culturas dissociadas da pilha preliminar. No desenvolvimento pós-natal inicial, as células cerebelares de Purkinje são conhecidas por passar por um período vulnerável, durante o qual passam por morte celular programada. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar a cultura de fatiacerebelar organotípica do mouse durante este momento crítico. As fatias são ainda mais rotuladas para avaliar a sobrevivência celular de Purkinje e a eficácia de tratamentos neuroprotetores. Este método pode ser extremamente valioso para a tela para novas moléculas neuroativas.
Introduction
A modelagem in vitro é uma ferramenta essencial na pesquisa biomédica. Ele permite que os investigadores para estudar e controlar rigorosamente mecanismos específicos em tipos de células restritas, ou em sistemas isolados / órgãos. A cultura organotípica da fatia é uma técnica in vitro amplamente utilizada, especial no campo da neurociência1. O método foi estabelecido pela primeira vez por Gähwiler, que cultou fatias cerebrais usando a técnica de tubo de rolo2,e mais tarde modificado por Yamamoto et al., que introduziu o uso de uma membrana microporosa para realizar culturas de fatias corticais3. Em comparação com as culturas celulares primárias, as culturas organotípicas apresentam a vantagem de preservar a citoarquitetura do tecido, bem como as conexões células-células nativas no plano da seção de tecido.
As fatias organotípicas foram cultivadas a partir de muitas partes do sistema nervoso central, como o hipocampo4,córtex5,estriado6,cerebelo4,7,e medula espinhal8,9,entre outros. Eles foram provados para ser uma ferramenta poderosa na descoberta de drogas estudos10. Os efeitos das moléculas neuroativas podem ser avaliados de muitas maneiras: sobrevivência e neurodegeneração usando imunomanchas e bioquímica, formação de circuito neuronal ou interrupção usando eletrofisiologia e imagem viva.
O objetivo deste trabalho é descrever um método simples para realizar a cultura cerebellar organotypic da fatia, que é sabida para ser um modelo relevante para imitar o desenvolvimento cerebellar in vitro. Particularmente, nós focalizamos no estudo da morte desenvolvente da pilha de Purkinje. In vivo, as células de Purkinje passam por apoptose durante a primeira semana pós-natal, atingindo o pico no dia pós-natal 3 (P3)11. O mesmo padrão é observado na cultura cerebellar fatia, com neurônios Purkinje morrendo por apoptose quando cerebella são retirados de animais entre P1 e P8, com um pico de P34,12. O uso das culturas organotípicas de fatiacerebelares permitiu identificar várias moléculas neuroprotetoras7,13,bem como compreender parte dos mecanismos envolvidos nesta morte celular programada14,15,16. Aqui, descrevemos um protocolo baseado no estudo de Stoppini et al.17 no hipocampo, e adaptado ao cerebelo por Dusart et al.4 Inclui dissecação rápida e corte de cerebella pós-natal; cortar a cultura em uma inserção da cultura celular contendo uma membrana microporosa, com ou sem tratamento neuroprotetor; e imunofluorescência manchando para avaliar a sobrevivência neuronal.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o comitê de Estudos em Animais da Northwestern University.
1. Preparação antes das culturas organotípicas de fatiacerebelares
- Em uma capa de cultura celular pulverizada com 70% de etanol de antemão, prepare 200 mL de meio de cultura em um filtro de vácuo de 250 mL mL ligado a um receptor de garrafa estéril. Adicione 100 mL de Basal Medium Eagle (BME), 50 mL de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 mL de soro de cavalo inativado de calor, 1 mL de 200 mM L-Glutamina (concentração final 1 mM) e 5 mL de 200 g/l glicose (concentração final 5 mg/mL). Filtro a vácuo do meio de cultura e mantê-lo em +4 °C por até um mês.
- No armário esterilizado da biossegurança, retire uma placa da cultura de 6 poços de seu pacote. Preencha cada poço com 1 mL de meio de cultura. Se um tratamento for testado, adicione o agente farmacológico ao bem tratado e ao mesmo volume de solução do veículo para o poço de controle. No presente estudo, adicionamos 1 μL de solução estéril de 3 M KCl ao poço tratado (30 mM final) e 1 μL de água estéril aos poços de controle.
- Traga para dentro da capa da cultura celular o número necessário de inserções de cultura celular embrulhadas individualmente com membrana hidrofílico de politetrafluoroetileno (PTFE) (tamanho dos poros = 0,4 μm). Cuidadosamente desembrulhá-los e tirar as inserções de cultura celular com fórceps estéreis. Solte-os um por um em um poço de uma placa de 6 poços, evitando bolhas na interface entre a membrana de inserção e o meio de cultura celular. Deixe as inserções de equilíbrio no meio em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 2 h antes da cultura.
NOTA:O helicóptero do tecido reside permanentemente na capa da cultura da pilha. - Prepare dois copos de 200 mL, um preenchido com 150 mL de água estéril, e o outro preenchido com 150 mL 70% de etanol. Mergulhe as ferramentas cirúrgicas no banho de etanol de 70% e, em seguida, na água antes de usá-los.
NOTA:Não use ferramentas cirúrgicas imediatamente após o contato com o etanol. - Desinfete a lâmina de dois gumes no copo de etanol de 70%. Coloque-o no suporte da lâmina usando fórceps estéreis e mantenha-o no lugar usando a chave de braçadeira de lâmina. Deixe secar até usar.
- Desinfete o disco de plástico fornecido com o helicóptero de tecido no copo de etanol de 70%. Pulverizar a tabela de corte com 70% de etanol antes de colocar o disco sobre ele. Deixe secar até que use.
2. Dissection e Cerebellar Organotypic Slice Cultures 2. Dissection e Cerebellar Organotypic Slice Cultures
- Traga o filhote de cachorro do rato dentro da capa da cultura da pilha para executar a dissecação.
- Decapitar o filhote rapidamente usando tesoura sem cor de funcionamento (Figura 1A).
- Ao segurar a cabeça do filhote pelo nariz com fórceps de vestir em linha reta, corte o couro cabeludo usando uma tesoura de olho reto, a partir da extremidade posterior, e indo lateral para midline.
- Prossiga de forma idêntica para o crânio.
NOTA:Certifique-se de apontar dicas de tesoura para fora para evitar danificar o cerebelo durante a dissecação. - Tire o cérebro e transferi-lo para um prato de 60 mm cheio de HBSS frio + 5 mg / mL glicose.
- Dissecar cuidadosamente o cerebelo usando fórceps finos retos estéreis (Figura 1B). Transfira-o para o disco de plástico colocado na mesa de corte do helicóptero de tecido usando fórceps finos curvos estéreis.
- Oriente o tecido girando a tabela de corte para executar seções da parasagital.
- Mova a tabela de corte puxando o botão da liberação da tabela à direita, assim que a lâmina é posicionada na borda do tecido.
- Ajuste a espessura da fatia a 350 μm e a velocidade da lâmina ao meio.
- Comece o helicóptero. Uma vez que todo o cerebelo foi cortado(Figura 1C),desligue o helicóptero.
- Retire o disco de plástico com fórceps estéreis.
- Cuidadosamente trazer o disco de plástico perto de um prato de 60 mm contendo HBSS + 5 mg / mL glicose. Pipette HBSS frio + 5 mg / mL glicose no tecido usando uma pipeta de transferência estéril para permitir a colheita de fatias cerebelares no prato cheio de tampão.
- Separe as fatias cerebelares umas das outras usando uma microssonda. Tire seções de boa qualidade com a pipeta de transferência (recomenda-se usar seções de tecido que estão perto dos vermes) e deixá-las em uma inserção de cultura celular pré-equilibrada (Figura 1D).
- Posicione as fatias cerebelares na inserção da cultura celular usando a microssonda e, em seguida, retire cuidadosamente o excesso de Solução de glicose HBSS + 5 mg/mL com a pipeta de transferência.
NOTA:Nesta fase, o tecido é extremamente concurso e propenso a danos físicos. O número máximo de fatias cerebelares por inserção da cultura celular depende da idade do animal doador. 6-8 fatias podem ser cultivadas para um animal P0-P4-old, e 4-6 fatias para animais com mais de P5. - Coloque o prato de cultura na incubadora, mudando o meio completamente a cada 2-3 dias.
- Para avaliar a sobrevivência celular de Purkinje, as fatias podem ser coletadas tão cedo quanto 5 dias in vitro. Para outros fins, eles podem ser mantidos na cultura por várias semanas(Figura 1F).
NOTA:No caso dos experimentos de sobrevivência celular de Purkinje, não há necessidade de renovar o tratamento farmacológico ao mudar a cultura celular (Figura 1F).
3. Imunofluorescência
- Retire a placa de 6 poços da incubadora. Remover o meio de cultura celular, lave a inserção da cultura celular com 1x PBS e corrigir as fatias com solução de paraformaldeído fria de 4% para 1 h, com 1 mL a inserção da cultura celular e 500 μL em cima da inserção da cultura celular.
- Lave as inserções 4x 10 min com 1x PBS, com 1 mL abaixo e 500 μL em cima da inserção, em um shaker orbital.
- Com um pincel, transfira as fatias cerebelares da inserção da cultura de 1 célula para 1 poço de 24 poços pré-preenchidos com 1x PBS, 0,25% Triton X-100 e 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/well.
- Permeabilize e bloqueie as fatias por incubação na PBS-TB por 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar com anticorpos primários diluídos na solução PBS-TB, durante a noite em + 4 °C, em um agitador orbital, 200 μL/well.
- No dia seguinte, realize quatro laviras de 10 min com 1x PBS, em um agitador orbital, 500 μL/well.
- Incubar com anticorpos secundários diluídos na solução PBS-TB, duas horas à temperatura ambiente, em um agitador orbital, e protegido da luz, 200 μL/well.
- Executar quatro lavações de 10 min com 1x PBS, em um agitador orbital, 500 μL/well.
- Contramanchar as fatias usando Hoechst 33342, diluído em 1x PBS (2 μg/mL), por 10 min à temperatura ambiente, protegido da luz, 500 μL/bem.
- Monte as fatias cerebelares em um slide de microscopia com uma pipeta de transferência. Deixe-os secar completamente, protegidos da luz. Reumificar-los com 1x PBS e aplicar um coverslip coberto com poucas gotas de montagem média (~ 80 μL). Evite fazer bolhas.
- Uma vez que o meio de montagem tenha curado, as seções cerebelares estão prontas para serem imagemdas.
4. Imagem e Quantificação da Sobrevivência Celular
- Ligue o microscópio e lasers de acordo com o fabricante e / ou as instruções da instalação de núcleo de imagem.
- Iniciar o software de aquisição.
- Usando um objetivo 10X, localizar fatias cerebelares não alteradas que apresentam 9-10 lóbulos (geralmente seções cerebelares perto dos vermes).
- Ativar a aquisição da pilha z. Defina a gama da z-pilha para incluir todas as células Purkinje presentes na fatia cerebelar. Defina um tamanho de etapa de 2 μm e inicie a aquisição. Salve a imagem adquirida no formato do fabricante de software de aquisição para preservar os metadados associados.
- Abra o arquivo adquirido no ImageJ usando o plugin bioformato18.
- Vá para image > Stacks > Z-projeto... (Figura 2A).
- Escolha a intensidade máxima no menu de entrega do tipo projeção e clique em OK (Figura 2B).
- Uma imagem 2-D achatada será gerada. Clique duas vezes na ferramenta Multi-point para permitir que a janela point tool apareça. Desverifique a opção de pontos do rótulo para facilitar a visualização de células contadas. Em seguida, clique diretamente em uma soma de uma célula purkinje para começar a contar (Figura 1E). O número total de células contadas será indicado na parte inferior da janela point tool (Figura 3).
NOTA:Normalmente, pelo menos 3 seções não danificadas contendo 9-10 lóbulos por inserção da cultura celular podem ser quantificadas. Para avaliar o efeito neuroprotetor de um agente farmacológico, pelo menos 3 experimentos independentes devem ser realizados.
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Representative Results
Como mostrado na Figura 4,este protocolo produz culturas organotípicas de fatiacerebelares nas quais a sobrevivência celular de Purkinje pode ser avaliada após as etapas de imunofluorescência e aquisição de imagem. As células purkinje foram rotuladas com uma combinação de anticorpos anticalbindin d-28K (diluição 1/200) e anti-rato Alexa594 (diluição 1/300). A costura da imagem foi feita automaticamente pelo software da aquisição do microscópio (NIS-Elementos) para obter um retrato da fatia cerebellar inteira. Os números de células de Purkinje por fatia foram inseridos no software Prism 8 para gerar o gráfico e realizar análiseestatística. No P6, a sobrevivência celular de Purkinje foi baixa no controle, consistente com sua conhecida janela de vulnerabilidade4 (Figura 4A,E). A sobrevivência aumentou à medida que o animal doador envelheceu e saiu deste período crítico (Figura 4C,E). As fatias cerebelares foram tratadas com alta concentração de KCl para induzir com sucesso sua despolarização e sobrevivência14 (Figura 4B,D,E).
Figura 1: Ilustração do protocolo da dissecação à quantificação da sobrevivência da pilha de Purkinje.
O filhote de rato é rapidamente decapitado (A). Após a dissecação cerebral, o cerebelo é isolado(B),e depois picado em fatias de 350 μm de largura (C). As seções cerebellares são colocadas em uma inserção de cultura celular tratada ou tratada (D)e mantidas na cultura por pelo menos 5 dias in vitro. O tecido é então fixado em paraformaldeído de 4%, a imunocoloração é realizada e as imagens são adquiridas com um microscópio confocal. Por último, o número de célula saqueado é quantificado em cada fatia usando a ferramenta Multipoint em ImageJ (E). (F)Esquemático do curso do tempo do tratamento de KCl durante a cultura. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Configurações de ImageJ usadas para achatar a pilha 3D antes da quantificação. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Configurações usadas para contar o número da célula purkinje usando a ferramenta Multipoint no ImageJ com um exemplo de uma fatia cerebellar sendo quantificada. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Sobrevivência da pilha de Purkinje na cultura cerebellar organotypic da fatia que segue o tratamento elevado de KCl.
Imagem representativa de fatias cerebelares tiradas no dia pós-natal 6(A, B) ou 8(C, C', D, D'),ou não tratadas(A, C, C') ou tratadas com 30 mM KCl (B, D, D'). (C' e D') Maior vista de ampliação das regiões brancas encaixotadas em C e D. As fatias foram mantidas 5 dias in vitro antes da fixação. As células purkinje são rotuladas com Calbindin D-28K em vermelho. Barra de escala = 500 μm (A-D), e 100 μm(C' e D'). (E)Quantificação da sobrevivência celular purkinje de culturas P6 e P8, no controle ou tratado com 30 mM KCl, mostra uma maior sobrevivência com o tratamento (Teste Mann-Whitney, n = 3 a 5 fatias). Os dados são expressos como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A cultura cerebellar da fatia é uma ferramenta poderosa para estudar a morte programada da pilha de Purkinje durante o desenvolvimento postnatal. Esta técnica pode ser usada para selecionar rapidamente moléculas candidatas para seu potencial neuroprotetor. A principal vantagem é que a configuração é simples e muito rentável, e requer apenas um investimento modesto em equipamentos (um vibratome pode custar até 3 vezes mais do que um helicóptero de tecido). Além disso, 10 a 15 fatias saudáveis podem ser geradas a partir de um filhote de rato, permitindo que diferentes ensaios sejam realizados em paralelo usando apenas um animal.
Para obter resultados consistentes e reprodutíveis, é fundamental realizar a cultura da forma mais eficiente possível e escolher seções cerebelares saudáveis para serem cultivadas. Este método também é adequado para a cultura de longo prazo (até vários meses). Assim, é essencial usar a boa técnica asséptica durante o processo de dissecção e corte para evitar contaminações e a necessidade de complementar culturas com antibióticos.
O modelo de cultura cerebellar da fatia preserva as interações celulares existentes no plano da seção de tecidos e na região cultivada. Isso vem com uma ressalva: conexões com alvos fora da região cultivada podem ser cortadas. O fornecimento de fatores neurotróficos fornecidos por fibras aferentes pode ser interrompido também e prejudicar a sobrevivência neuronal. Isto pode parcialmente ser contornado executando co-culturas organotypic da fatia. Tem sido demonstrado que as fibras de escalada podem penetrar culturas de fatias cerebelares pós-natais quando co-cultivadas com culturas inferiores de fatia de azeitona14,19. Mais interessante, as células Purkinje contactado por fibras de escalada sobreviveu14.
Aqui, nos concentramos no uso da cultura organotípica para procurar moléculas neuroprotetoras no cerebelo em desenvolvimento. No entanto, este método é igualmente adequado para outras condições, tais como neurodegeneração20,regeneração axonal21,e monitoramento da atividade do circuito neuronal22,23. As aplicações pós-cultura vão além da imunofluorescência. As fatias podem ser usadas para estudos bioquímicos ou de expressão gênica, a fim de investigar os mecanismos biológicos envolvidos no efeito neuroprotetor de um determinado composto. Ao todo, este modelo pode lançar as bases para encontrar novas moléculas neuroativas antes do teste in vivo e ser um suplemento eficaz e confiável para estudos mecanicistas in vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O trabalho de imagem foi realizado no Northwestern University Center for Advanced Microscopy generosamente apoiado pela NCI CCSG P30 CA060553 concedida ao Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Agradecemos a Sean McDermott por sua assistência técnica e apoio, e Maya Epstein para as ilustrações desenhadas à mão mostrado na Figura 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
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