Summary
Органотипические срезные культуры являются мощным инструментом для изучения нейроразвития или дегенеративных / регенеративных процессов. Здесь мы описываем протокол, который моделирует нейроразвитие смерти клеток Purkinje в мыши мозжечковой культуры ломтик. Этот метод может принести пользу исследованиям в нейропротекторных открытий наркотиков.
Abstract
Organotypic срез культуры является мощным in vitro модель, которая имитирует в условиях vivo более тесно, чем разъединенных первичных культур клеток. В начале послеродового развития, мозжечковые клетки Purkinje, как известно, проходят через уязвимый период, в течение которого они претерпевают запрограммированную гибель клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выполнения мыши organotypic мозжечковой культуры ломтик в это критическое время. Ломтики дополнительно помечены для оценки выживания клеток Пуркинье и эффективности нейропротекторных методов лечения. Этот метод может быть чрезвычайно ценным для проверки новых нейроактивных молекул.
Introduction
Моделирование in vitro является важным инструментом в биомедицинских исследованиях. Это позволяет следователям изучать и жестко контролировать конкретные механизмы в ограниченных типов клеток, или в изолированных системах / органах. Органотипическая срезная культура широко используется в пробирке техника, особенно в области неврологии1. Метод был впервые создан Гюхвилер, который культивируется мозг ломтиками с помощью роликовой трубки техники2, а затем изменены Ямамото и др., который ввел использование микропористых мембраны для выполнения корковых культур ломтик3. По сравнению с первичными культурами клеток, органотипические срезные культуры представляют собой преимущество сохранения цитоархитектуры ткани, а также родных клеточных соединений в плоскости ткани.
Органотипические ломтики были культивированы из многих частей центральной нервной системы, таких как гиппокамп4,кора5,стриатум6,мозжечок4,7,и спинной мозг 8,9, среди других. Они были доказаны, чтобы быть мощным инструментом в исследованиях открытия наркотиков10. Эффекты нейроактивных молекул можно оценить по-разному: выживание и нейродегенерация с помощью иммуностоинга и биохимии анализов, формирования нейрональных цепей, или нарушения с помощью электрофизиологии и живой визуализации.
Цель этой работы состоит в том, чтобы описать простой метод для выполнения органотипической мозжечковой культуры ломтик, который, как известно, соответствующая модель для имитации мозжечкового развития в пробирке. В частности, мы сосредоточились на изучении смерти клеток Пуркинье. In vivo, Purkinje клетки проходят апоптоз в течение первой послеродовой недели, достигнув пика в послеродовой день 3 (P3)11. Такая же картина наблюдается в мозжечковой культуры ломтик, с Purkinje нейронов умирают от апоптоза, когда церебелла взяты из животных между P1 и P8, с пиком на P34,12. Использование органотипических мозжечковых культур ломтик позволило определить несколько нейропротекторных молекул7,13, а также понимание части механизмов, участвующих в этой запрограммированной клеточной смерти14,15,16. Здесь мы описываем протокол, основанный на изучении Stoppini et al.17 в гиппокампе, и адаптированный к мозжечке Dusart et al.4 Он включает в себя быстрое вскрытие и измельчение послеродовой церебелли; нарезка культуры на вставку клеточной культуры, содержащая микропористую мембрану, с нейропротекторным лечением или без нее; и иммунофлуоресценции окрашивания для оценки выживаемости нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с участием животных проводились в соответствии с комитетом По изучению животных Северо-Западного университета.
1. Подготовка до органотипической мозжечковой культуры ломтик
- В клеточной культуре капот распыляется с 70% этанола заранее, подготовить 200 мл культуры среды в 250 мл бутылки-топ вакуумный фильтр, прикрепленный к стерильной бутылке приемника. Добавьте 100 мл базального среднего орла (BME), 50 мл сбалансированного соляного раствора Хэнкса (HBSS), 50 мл теплоинактивированной лошадиной сыворотки, 1 мл 200 мМ L-глютамина (окончательная концентрация 1 мМ) и 5 мл глюкозы 200 г/л (окончательная концентрация 5 мг/мл). Вакуум-фильтруйте среду культуры и держите ее на уровне 4 градусов по Цельсию в течение месяца.
- В стерилизованном шкафу биобезопасности выняйте из упаковки 6-колодец культурную плиту. Заполните каждый колодец с 1 мл культуры среды. Если лечение проверено, добавьте фармакологический агент к обработанной скважине, и такой же объем решения транспортного средства для управления хорошо. В настоящем исследовании мы добавили в обработанные скважины 1 кЛ стерильного раствора 3 М ККЛ (30 мМ финала) и 1 л стерильной воды.
- Принесите внутри капюшона клеточной культуры необходимое количество индивидуально обернутых вставок клеточной культуры с гидрофильной политетрафтотрилен (PTFE) мембрана (пор овый размер 0,4 мкм). Тщательно развернуть их и вынуть клеточной культуры вставки со стерильными щипцы. Бросьте их один за другим в колодец 6-ну хорошо пластины, избегая пузырьков на интерфейсе между вставкой мембраны и среды клеточной культуры. Пусть вставки уравновешивать в среде в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор, по крайней мере 2 ч до культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевой измельчитель постоянно находится в капюшоне клеточной культуры. - Приготовьте два бикера 200 мл, один из них заполнен стерильной водой 150 мл, а другой заполнен 150 мл 70% этанола. Dip хирургических инструментов в 70% этанола ванны, а затем в воде до их использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте хирургические инструменты сразу после контакта с этанолом. - Дезинфекция обоюдоострого лезвия в 70% этанола стакан. Поместите его на держатель лезвия с помощью стерильных щипц и удерживайте его на месте с помощью гаечного ключа лезвия. Дайте ему высохнуть до использования.
- Дезинфицировать пластиковый диск, обеспеченный тканевым измельчитель в 70% этанола стакан. Спрей режущий стол с 70% этанола до размещения диска на нем. Дайте высохнуть до использования.
2. Рассечение и церебеллярные органотипические культуры фрагмента
- Принесите щенка мыши внутри капюшона культуры клетки для выполнения вскрытия.
- Обезглавить щенка быстро с помощью прямых операционных ножниц(Рисунок 1A).
- Держа голову щенка за нос прямыми депеловыми щипцыми, разрежьте кожу головы ножницами прямого глаза, начиная с заднего конца и переходя боковыми к средней линии.
- Продолжить одинаково для черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы указать ножницы советы наружу, чтобы избежать повреждения мозжечка во время вскрытия. - Выняйте мозг и перенесите его в 60-мм блюдо, наполненное холодным HBSS и глюкозой 5 мг/мл.
- Тщательно вскрыть мозжечок с помощью стерильных прямых тонких щипцов(рисунок 1B). Перенесите его на пластиковый диск, помещенный на режущий стол тканевого измельчителя с помощью стерильных изогнутых тонких щипочек.
- Ориентируйте ткань, вращая режущий стол для выполнения паразиттальных секций.
- Переместите режущий стол, потянув за стол ручкой вправо, так что лезвие расположено на краю ткани.
- Отрегулируйте толщину ломтика до 350 мкм и скорость лезвия до средней.
- Запустите вертолет. После того, как весь мозжечок был нарезан(Рисунок 1C), выключите измельчитель.
- Удалите пластиковый диск стерильными щипками.
- Аккуратно принесите пластиковый диск близко к 60-мм блюду, содержащему HBSS и 5 мг/мл глюкозы. Pipette холодный HBSS 5 мг/мл глюкозы на ткани с помощью стерильной передачи пипетки, чтобы позволить уборку мозжечковых ломтиков в буфер-заполненные блюдо.
- Отделите мозжечковые ломтики друг от друга с помощью микрозонда. Выняйте секции хорошего качества с передачей пипетки (рекомендуется использовать ткани разделы, которые близки к vermis) и высадить их в предварительно уравновешенной клеточной культуры вставки (Рисунок 1D).
- Расположите мозжечковые ломтики на вставку клеточной культуры с помощью микрозонда, затем аккуратно удалите избыток HBSS - 5 мг/мл раствор глюкозы с помощью передачи пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе ткань чрезвычайно нежная и подвержена физическому повреждению. Максимальное количество мозжечковых ломтиков на вставку клеточной культуры зависит от возраста донорского животного. 6-8 ломтиков могут быть культивированы для P0-P4-старого животного, и 4-6 ломтиков для животных старше P5. - Поместите блюдо культуры в инкубатор, полностью меняя среду каждые 2-3 дня.
- Для оценки выживаемости клеток Пуркинье ломтики можно собирать уже через 5 дней в пробирке. Для других целей, они могут быть сохранены в культуре в течение нескольких недель(рисунок 1F).
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае экспериментов по выживанию клеток Purkinje, нет необходимости возобновлять фармакологическое лечение при изменении среды клеточной культуры(рисунок 1F).
3. Иммунофлуоресценция
- Вынизвините 6-колодую тарелку из инкубатора. Удалить среды культуры клеток, мыть клеточной культуры вставить с 1x PBS, и исправить ломтики с холодным 4% параформальдегида решение для 1 ч, с 1 мл под клеточной культуры вставки и 500 Л на вершине клеточной культуры вставки.
- Вымойте вставки 4x 10 мин с 1x PBS, с 1 мл под и 500 л на верхней части вставки, на орбитальной шейкер.
- С помощью кисти, передача мозжечковой ломтики из 1 клеточной культуры вставить в 1 хорошо 24-хорошо предварительно заполнены 1x PBS, 0,25% Тритон X-100, и 3% BSA (PBS-TB), 500 Л / хорошо.
- Пермяки и блокировать ломтики инкубации в PBS-ТБ в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубировать с первичными антителами, разбавленными в растворе PBS-TB, на ночь при 4 градусах По Цельсия, на орбитальном шейкере, 200 л/ну.
- На следующий день выполните четыре мотания по 10 мин с 1x PBS, на орбитальном шейкере, 500 л/ну.
- Инкубировать вторичными антителами, разбавленными в растворе PBS-TB, два часа при комнатной температуре, на орбитальной шейкере и защищенной от света, 200 л/ну.
- Выполните четыре стирки 10 мин с 1x PBS, на орбитальной шейкер, 500 л/ну.
- Противокоите ломтики с помощью Hoechst 33342, разбавленные в 1x PBS (2 мкг/мл), в течение 10 мин при комнатной температуре, защищены от света, 500 л/ну.
- Установите мозжечковые ломтики на слайд ескопии микроскопии с передачей пипетки. Пусть они полностью высохнут, защищены от света. Повторно увлажнить их с 1x PBS и применить coverslip покрыты несколько капель монтажа среды (80 л). Избегайте каких-либо пузырьков.
- После того, как монтажная среда вылечилась, мозжечковые секции готовы к изображению.
4. Визуализация и количественная оценка выживаемости клеток
- Включите микроскоп и лазеры в соответствии с инструкциями производителя и/или основных изображений.
- Запустите программное обеспечение для приобретения.
- Используя цель 10X, найдите неизмененные мозжечковые ломтики, которые представляют 9-10 лобул (обычно мозжечковые участки близко к vermis).
- Активировать приобретение z-stack. Определите диапазон z-стек, чтобы включить все клетки Purkinje, присутствующие в мозжечковом ломтике. Установите размер шага в 2 мкм и начните приобретение. Сохранить приобретенную картину в формате производителя программного обеспечения для приобретения, чтобы сохранить связанные метаданные.
- Откройте приобретенный файл в ImageJ с помощью плагина Bio-formats18.
- Перейти к изображению и gt; Стеки
- Выберите Максимальную интенсивность в меню выпадения типа проекции и нажмите OK (рисунок 2B).
- Сплющенный 2-D изображение будет создано. Дважды щелкните по многоточечному инструменту, чтобы показать окно Point Tool. Отоверьте опцию очков Label, чтобы облегчить визуализацию подсчитанных ячеек. Затем нажмите прямо на сому клетки Purkinje, чтобы начать подсчет(рисунок 1E). Общее количество подсчитанных ячеек будет указано в нижней части окна Point Tool (рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, по крайней мере 3 неповрежденных разделов, содержащих 9-10 lobules на вставку клеточной культуры, могут быть количественно оценены. Для оценки нейропротекторного эффекта фармакологического агента необходимо провести не менее 3 независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 4, этот протокол производит органотипические мозжечковые срез культуры, в которых purkinje выживания клеток может быть оценена после иммунофлуоресценции и изображения приобретения шагов. Клетки Пуркинье были помечены комбинацией антикальбиндина D-28K (разбавление 1/200) и антимышечных антимыков Alexa594 (разбавления 1/300) антител. Сшивание изображений было сделано автоматически программным обеспечением для приобретения микроскопа (NIS-Elements) для получения изображения всего мозжечкового ломтика. Номера клеток Purkinje на один срез были введены в программное обеспечение Prism 8 для создания диаграммы и выполнения статистического анализа. На P6, Purkinje выживаемость клеток был низким в управлении, в соответствии с их известной уязвимости окно4 (Рисунок 4A,E). Выживание увеличилось, как донорское животное стало старше и вышел из этого критического периода(Рисунок 4C,E). Церебелляры ломтики были обработаны с высокой концентрацией KCl, чтобы успешно вызвать их деполяризации и выживания14 (Рисунок 4B, D, E).
Рисунок 1: Иллюстрация протокола от вскрытия до количественной оценки выживаемости клеток Пуркинье.
Мышонок быстро обезглавлен(A). После вскрытия мозга, мозжечок изолирован (B), а затем нарезанный на 350 мкм шириной ломтиками (C). Мозжечковые секции помещаются на контрольную или обработанную вставку клеточной культуры(D) и поддерживаются в культуре в течение по крайней мере 5 дней в пробирке. Затем ткань фиксируется в 4% параформальдегида, проводится иммуностоинг, а снимки приобретаются с помощью конфокального микроскопа. Наконец, номер ячейки Purkinje количественно в каждом срезе с помощью инструмента Multipoint в ImageJ (E). (F) Схема времени курс лечения KCl во время культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Параметры ImageJ, используемые для выравнивания 3D-стека до количественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Настройки, используемые для подсчета числа клеток Purkinje с помощью инструмента Multipoint в ImageJ с примером количественной оценки мозжечкового ломтика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Purkinje выживания клеток в органотипической мозжечковой культуры ломтик после высокой обработки KCl.
Представитель изображение мозжечковых ломтиков, принятых в послеродовой день 6(A, B) или 8(C, C ', D '), либо необработанные(A, C, C') или лечение с 30 мм KCl(B, D, D '). (C' и D') Более высокое увеличение зрения белых коробочных регионов в C и D. Фрагменты хранились 5 дней в пробирке до фиксации. Клетки Пуркинье помечены красным цветом Calbindin D-28K. Шкала бар 500 мкм (A-D), и 100 мкм (C' и D '). (E) Количественная оценка выживания клеток Пуркинье из культур P6 и P8, в контроле или обработке с 30 мМ KCl, показывает более высокую выживаемость с лечением (тест Манн-Уитни, n no 3 до 5 ломтиков). Данные выражаются как средние значения - SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Церебелля среза культура является мощным инструментом для изучения запрограммированных Purkinje смерти клеток во время послеродового развития. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекулы кандидатов на их нейропротекторный потенциал. Основным преимуществом является то, что установка проста и очень рентабельна, и требует лишь скромных инвестиций в оборудование (вибратомможет может стоить до 3 раз больше, чем тканевый измельчитель). Кроме того, от 10 до 15 здоровых ломтиков могут быть получены из одного щенка мыши, что позволяет проводить различные анализы параллельно с использованием только одного животного.
Для того, чтобы получить последовательные и воспроизводимые результаты, очень важно, чтобы выполнить культуру как можно более эффективно и выбрать здоровые мозжечковые разделы, которые будут культивированы. Этот метод также подходит для долгосрочной культуры (до нескольких месяцев). Таким образом, важно использовать хорошую технику асептика во время вскрытия и измельчения процесса, чтобы избежать загрязнений и необходимость дополнения культур с антибиотиками.
Модель культуры мозжечкового среза сохраняет существующие взаимодействия клеток и клеток в плоскости ткани, а также в регионе культивируется. Это сопровождается оговоркой: связи с целями за пределами культурного региона могут быть разорваны. Поставка в нейротрофических факторов, предоставляемых афферентных волокон может быть прекращено, а также и ухудшить выживание нейронов. Это можно частично обойти, выполняя органотипические сокультуры среза. Было показано, что альпинизм волокон может проникать послеродовой мозжечковой среза культур, когда совместно с нижней оливковых культур ломтик14,19. Более интересно, Purkinje клетки связались с восхождением волокон выжил14.
Здесь мы сосредоточились на использовании органотипической культуры среза для поиска нейропротекторных молекул в развивающемся мозжечке. Тем не менее, этот метод в равной степени подходит для других условий, таких как нейродегенерация20, аксональной регенерации21, и мониторинг нейронной цепи деятельности22,23. Посткультурные приложения выходят за рамки иммунофлуоресценции. Фрагменты могут быть использованы для биохимических или генных исследований экспрессии, для того, чтобы исследовать биологические механизмы, участвующие в нейропротекторном эффекте данного соединения. В целом, эта модель может заложить основу для поиска новых нейроактивных молекул до тестирования in vivo и быть эффективным и надежным дополнением к in vivo механистических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Imaging работы были выполнены в Северо-Западном университете Центр расширенной микроскопии щедро поддерживается NCI CCSG P30 CA060553 присуждается Роберт H Lurie Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим Шона Макдермотта за его техническую помощь и поддержку, а Майю Эпштейн за рисованные иллюстрации, показанные на рисунке 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
