Summary
Los cultivos de rodajas organotípicas son una poderosa herramienta para estudiar los procesos neurodesarrollo o degenerativos/regenerativos. Aquí, describimos un protocolo que modela la muerte del neurodesarrollo de las células de Purkinje en cultivos de rebanadas cerebelosas de ratón. Este método puede beneficiar la investigación en el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.
Abstract
El cultivo de rebanadas organotípicas es un potente modelo in vitro que imita las condiciones in vivo más de cerca que los cultivos celulares primarios disociados. En el desarrollo postnatal temprano, se sabe que las células de Purkinje cerebelosas pasan por un período vulnerable, durante el cual se someten a muerte celular programada. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar la cultura de corte cerebelosa organotípico de ratón durante este momento crítico. Las rodajas se etiquetan además para evaluar la supervivencia celular de Purkinje y la eficacia de los tratamientos neuroprotectores. Este método puede ser extremadamente valioso para detectar nuevas moléculas neuroactivas.
Introduction
El modelado in vitro es una herramienta esencial en la investigación biomédica. Permite a los investigadores estudiar y controlar estrechamente mecanismos específicos en tipos de células restringidas, o en sistemas u órganos aislados. El cultivo de rebanadas organotípicas es una técnica in vitro ampliamente utilizada, especialmente en el campo de la neurociencia1. El método fue establecido por primera vez por El sr. G-hwiler, que cultivaba rebanadas cerebrales usando la técnica de tubo de rodillo2,y más tarde modificado por Yamamoto et al., que introdujeron el uso de una membrana microporosa para realizar cultivos de rebanadas corticales3. En comparación con los cultivos celulares primarios, los cultivos de rebanadas organotípicas presentan la ventaja de preservar la citoarquitectura del tejido, así como las conexiones celulares nativas en el plano de la sección del tejido.
Las rebanadas organotípicas se han cultivado desde muchas partes del sistema nervioso central, como el hipocampo4,la corteza5,el estriado6,el cerebelo4,7,y la médula espinal8,9,entre otros. Se ha demostrado que son una herramienta poderosa en los estudios de descubrimiento de fármacos10. Los efectos de las moléculas neuroactivas se pueden evaluar de muchas maneras: supervivencia y neurodegeneración mediante inmunomanchas y ensayos bioquímicos, formación de circuitos neuronales, o interrupción mediante electrofisiología y imágenes en vivo.
El objetivo de este trabajo es describir un método simple para realizar el cultivo organotípico de rodajas cerebelosas, que se sabe que es un modelo relevante para imitar el desarrollo cerebeloso in vitro. Particularmente, nos centramos en el estudio de la muerte del desarrollo celular de Purkinje. In vivo, las células de Purkinje se someten a apoptosis durante la primera semana postnatal, alcanzando su punto máximo en el día postnatal 3 (P3)11. El mismo patrón se observa en el cultivo de rodajas cerebelosas, con las neuronas Purkinje muriendo por apoptosis cuando la cerebella se toma de animales entre P1 y P8, con un pico en P34,12. El uso de los cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas ha permitido identificar varias moléculas neuroprotectoras7,13, así como la comprensión de parte de los mecanismos involucrados en esta muerte celular programada14,15,16. Aquí, describimos un protocolo basado en el estudio de Stoppini et al.17 en el hipocampo, y adaptado al cerebelo por Dusart et al.4 Incluye disección rápida y corte de cerebella postnatal; cultivo de corte en un inserto de cultivo celular que contiene una membrana microporosa, con o sin tratamiento neuroprotector; y la tinción de inmunofluorescencia para evaluar la supervivencia neuronal.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el comité de estudios de animales de la Universidad Northwestern.
1. Preparación previa a cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas
- En una campana de cultivo celular rociada con 70% de etanol de antemano, prepare 200 ml de medio de cultivo en un filtro de vacío de 250 ml de botella-tapa unido a un receptor de botella estéril. Añadir 100 ml de águila basal media (BME), 50 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), 50 ml de suero de caballo activado por calor, 1 ml de L-glutamina (concentración final 1 mM) y 5 ml de glucosa de 200 g/L (concentración final 5 mg/ml). Filtrar al vacío el medio de cultivo y mantenerlo a +4 oC durante un mes.
- En el gabinete de bioseguridad esterilizado, saque una placa de cultivo de 6 pocillos de su paquete. Llenar cada pozo con 1 mL de medio de cultivo. Si se prueba un tratamiento, añada el agente farmacológico al pozo tratado y el mismo volumen de solución del vehículo para el pozo de control. En el presente estudio, añadimos 1 l de solución estéril de 3 M KCl al pozo tratado (30 mM final) y 1 l de agua estéril a los pozos de control.
- Lleve dentro de la campana de cultivo celular el número necesario de insertos de cultivo celular envueltos individualmente con membrana de politetrafluoroetileno hidrófilo (PTFE) (tamaño de los poros a 0,4 m). Desenvuélvalos con cuidado y saque las inserciones de cultivo celular con fórceps estériles. Colóquelos uno por uno en un pozo de una placa de 6 pocillos, evitando burbujas en la interfaz entre la membrana de inserción y el medio de cultivo celular. Dejar que las plaquitas equilibran en el medio en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% durante al menos 2 h antes del cultivo.
NOTA: El helicóptero de tejido reside permanentemente en la campana de cultivo celular. - Preparar dos vasos de 200 ml, uno lleno de 150 ml de agua estéril, y el otro lleno de 150 ml 70% de etanol. Sumerja las herramientas quirúrgicas en el baño de etanol del 70% y luego en agua antes de usarlas.
NOTA: No utilice herramientas quirúrgicas inmediatamente después del contacto con etanol. - Desinfecte la hoja de doble filo en el vaso de precipitados de etanol del 70%. Colóquelo en el soporte de la hoja con fórceps estériles y sosténgaslo en su lugar con la llave de la abrazadera de la hoja. Dejar secar hasta que se use.
- Desinfecte el disco de plástico suministrado con el helicóptero de tejido en el vaso de precipitados de etanol del 70%. Rocíe la mesa de corte con 70% de etanol antes de colocar el disco sobre ella. Dejar secar hasta que lo use.
2. Disección y Cerebelosa Culturas de Rebanadas Organotípicas
- Lleve el cachorro de ratón dentro de la capucha de cultivo celular para realizar la disección.
- Decapitar al cachorro rápidamente usando tijeras rectas de funcionamiento(Figura 1A).
- Mientras sostiene la cabeza del cachorro por la nariz con fórceps de apósito recto, abre el cuero cabelludo usando tijeras de ojos rectas, comenzando desde el extremo posterior, y yendo lateral a la línea media.
- Proceda de forma idéntica para el cráneo.
NOTA: Asegúrese de apuntar las puntas de las tijeras hacia afuera para evitar dañar el cerebelo durante la disección. - Saque el cerebro y transfiéralo a un plato de 60 mm lleno de HBSS frío + 5 mg/ml de glucosa.
- Diseccionar cuidadosamente el cerebelo usando fórceps finos rectos estériles(Figura 1B). Transfiera al disco de plástico colocado en la mesa de corte del helicóptero de tejido utilizando fórceps finos curvos estériles.
- Orientar el tejido girando la mesa de corte para realizar secciones parasagitales.
- Mueva la mesa de corte tirando de la perilla de liberación de la mesa hacia la derecha, para que la hoja se coloque en el borde del tejido.
- Ajuste el espesor de la rebanada a 350 m y la velocidad de la hoja a medio.
- Arranca el helicóptero. Una vez cortado todo el cerebelo(Figura 1C),apague el helicóptero.
- Retire el disco de plástico con fórceps estériles.
- Lleve cuidadosamente el disco de plástico cerca de una placa de 60 mm que contenga HBSS + 5 mg/ml de glucosa. Pipetear en frío HBSS + 5 mg/ml de glucosa en el tejido utilizando una pipeta de transferencia estéril para permitir la cosecha de rodajas de cerebelosa en el plato lleno de tampón.
- Separelas las rodajas cerebelosas entre sí usando una microsonda. Saque secciones de buena calidad con la pipeta de transferencia (se recomienda utilizar secciones de tejido cercanas a la vermis) y dejarlas en una plaquita de cultivo celular preequilibrada(Figura 1D).
- Coloque las rodajas cerebelosas en el inserto de cultivo celular utilizando la microsonda y, a continuación, retire cuidadosamente el exceso de solución de glucosa HBSS + 5 mg/ml con la pipeta de transferencia.
NOTA: En esta etapa el tejido es extremadamente sensible y propenso a daños físicos. El número máximo de rodajas cerebelosas por inserción de cultivo celular depende de la edad del animal donante. Se pueden cultivar de 6 a 8 rebanadas para un animal de P0-P4, y de 4 a 6 rebanadas para animales mayores de P5. - Coloque el plato de cultivo en la incubadora, cambiando el medio por completo cada 2-3 días.
- Para evaluar la supervivencia celular de Purkinje, las rodajas se pueden recolectar tan pronto como 5 días in vitro. Para otros fines, se pueden mantener en cultivo durante varias semanas(Figura 1F).
NOTA: En el caso de los experimentos de supervivencia celular de Purkinje, no es necesario renovar el tratamiento farmacológico al cambiar el medio de cultivo celular(Figura 1F).
3. Inmunofluorescencia
- Saca la placa de 6 pocillos de la incubadora. Retire el medio de cultivo celular, lave el inserto de cultivo celular con 1pbS y fije las rodajas con una solución fría de paraformaldehído del 4% durante 1 h, con 1 ml debajo de la plaquita de cultivo celular y 500 ml encima de la plaquita de cultivo celular.
- Lavar las plaquitas 4x 10 min con 1x PBS, con 1 ml debajo y 500 l en la parte superior de la plaquita, en un agitador orbital.
- Con un cepillo, transfiera las rodajas cerebelosas de 1 inserción de cultivo celular a 1 pozo de 24 pozos precargados con 1pbS, 0.25% Triton X-100 y 3% BSA (PBS-TB), 500 ol/bien.
- Permeabilizar y bloquear las rodajas por incubación en PBS-TB durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar con anticuerpos primarios diluidos en la solución de PBS-TB, durante la noche a + 4 oC, en un agitador orbital, 200 l/bien.
- Al día siguiente, realizar cuatro lavados de 10 min con 1x PBS, en un agitador orbital, 500 l/bien.
- Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en la solución de PBS-TB, dos horas a temperatura ambiente, en un agitador orbital, y protegidos de la luz, 200 l/bien.
- Realizar cuatro lavados de 10 min con 1x PBS, en un agitador orbital, 500 l/bien.
- Contranasal las rodajas con Hoechst 33342, diluido en 1x PBS (2 g/ml), durante 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz, 500 l/pozo.
- Monte las rodajas cerebelosas en una corredera de microscopía con una pipeta de transferencia. Deja que se sequen completamente al aire, protegidos de la luz. Rehumidificarlos con 1pbS y aplica un cubreobjetos cubierto con unas gotas de medio de montaje (80 l). Evite hacer burbujas.
- Una vez que el medio de montaje se ha curado, las secciones cerebelosas están listas para ser imágenadas.
4. Imagen y cuantificación de la supervivencia celular
- Encienda el microscopio y los láseres de acuerdo con las instrucciones del fabricante y/o del núcleo de imágenes.
- Inicie el software de adquisición.
- Usando un objetivo 10X, localiza rodajas cerebelosas no alteradas que presentan de 9 a 10 lóbulos (generalmente secciones cerebelosas cercanas a los vermis).
- Active la adquisición de la pila z. Defina el rango de la pila z para incluir todas las células de Purkinje presentes en la rebanada cerebelosa. Establezca un tamaño de paso de 2 m e inicie la adquisición. Guarde la imagen adquirida en el formato del fabricante del software de adquisición para conservar los metadatos asociados.
- Abra el archivo adquirido en ImageJ utilizando el plugin Bioformatos18.
- Vaya a Imagen > Pilas > Proyecto Z... (Figura 2A).
- Elija Intensidad máxima en el menú desplegable Tipo de proyección y haga clic en Aceptar (figura 2B).
- Se generará una imagen 2D aplanada. Haga doble clic en la herramienta Multipunto para permitir que aparezca la ventana Herramienta Punto. Desactive la opción Puntos de etiqueta para facilitar la visualización de celdas contadas. A continuación, haga clic directamente en un soma de una célula de Purkinje para comenzar a contar (Figura 1E). El número total de celdas contadas se indicará en la parte inferior de la ventana Herramienta Punto (Figura 3).
NOTA: Por lo general, se pueden cuantificar al menos 3 secciones no dañadas que contienen de 9 a 10 lóbulos por plaquita de cultivo celular. Para evaluar el efecto neuroprotector de un agente farmacológico, se deben realizar al menos 3 experimentos independientes.
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Representative Results
Como se muestra en la Figura 4, este protocolo produce cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas en los que se puede evaluar la supervivencia celular de Purkinje siguiendo los pasos de inmunofluorescencia y adquisición de imágenes. Las células purkinje fueron etiquetadas con una combinación de anticuerpos anti-Calbindin D-28K (dilución 1/200) y Alexa594 anti-ratón (dilución 1/300). La costura de imágenes se realizó automáticamente mediante el software de adquisición de microscopios (NIS-Elements) para obtener una imagen de toda la rebanada cerebelosa. Los números de celda de Purkinje por sector se introdujeron en el software Prism 8 para generar el gráfico y realizar análisis estadísticos. En P6, la supervivencia de la célula de Purkinje era baja en el control, consistente con su conocida ventana de vulnerabilidad4 (Figura 4A,E). La supervivencia aumentó a medida que el animal donante crecía y salía de este período crítico(Figura 4C,E). Las rodajas cerebelosas fueron tratadas con alta concentración de KCl para inducir con éxito su despolarización y supervivencia14 (Figura 4B,D,E).
Figura 1: Ilustración del protocolo de la disección a la cuantificación de supervivencia de la célula de Purkinje.
El cachorro del ratón se decapita rápidamente (A). Después de la disección cerebral, el cerebelo se aísla (B), y luego se corta en rodajas de 350 m de ancho (C). Las secciones cerebelosas se colocan en un inserto de cultivo celular tratado o de control (D) y se mantienen en cultivo durante al menos 5 días in vitro. El tejido se fija entonces en 4% de paraformaldehído, se realiza inmunostainización y se adquieren imágenes con un microscopio confocal. Por último, el número de celda de Purkinje se cuantifica en cada sector utilizando la Herramienta Multipunto en ImageJ (E). (F) Esquema del curso de tiempo del tratamiento de KCl durante el cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de ImageJ utilizada para aplanar la pila 3D antes de la cuantificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración utilizada para contar el número de celda de Purkinje mediante la herramienta Multipunto en ImageJ con un ejemplo de un sector cerebeloso que se está cuantificando. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Supervivencia de la célula Purkinje en el cultivo de rodajas organospiales cerebelosas después de un alto tratamiento con KCl.
Imagen representativa de las rodajas cerebelosas tomadas en el día postnatal 6 (A, B) u 8 (C, C', D, D'),ya sea sin tratar (A, C, C') o tratadas con 30 mM KCl (B, D, D'). (C' y D') Vista de ampliación más alta de las regiones en caja blanca en C y D. Los cortes se mantuvieron 5 días in vitro antes de la fijación. Las células de Purkinje están etiquetadas con Calbindin D-28K en rojo. Barra de escala a 500 m(A–D) y 100 ám(C' y D'). (E) La cuantificación de la supervivencia celular de Purkinje a partir de cultivos P6 y P8, en control o tratada con 30 mM de KCl, muestra una mayor supervivencia con el tratamiento (prueba Mann-Whitney, n.o 3 a 5 rebanadas). Los datos se expresan como medias : SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El cultivo de rodajas cerebelosa es una poderosa herramienta para estudiar la muerte celular programada de Purkinje durante el desarrollo postnatal. Esta técnica se puede utilizar para examinar rápidamente las moléculas candidatas para su potencial neuroprotector. La principal ventaja es que la configuración es simple y muy rentable, y sólo requiere una inversión modesta en equipos (un vibratome puede costar hasta 3 veces más que un helicóptero de tejido). Además, se pueden generar de 10 a 15 rodajas sanas a partir de un cachorro de ratón, lo que permite realizar diferentes ensayos en paralelo utilizando un solo animal.
Con el fin de obtener resultados consistentes y reproducibles, es fundamental realizar la cultura de la manera más eficiente posible y elegir secciones cerebelosas saludables a cultivar. Este método también es adecuado para el cultivo a largo plazo (hasta varios meses). Por lo tanto, es esencial utilizar una buena técnica aséptica durante el proceso de disección y picado para evitar contaminaciones y la necesidad de complementar los cultivos con antibióticos.
El modelo de cultivo de sectores cerebelosos conserva las interacciones células celulares existentes en el plano de la sección de tejido y en la región cultivada. Esto viene con una advertencia: las conexiones con objetivos fuera de la región cultivada podrían ser cortadas. El suministro en factores neurotróficos proporcionados por fibras aferentes podría ser descontinuado, así y afectar la supervivencia neuronal. Esto se puede eludir parcialmente mediante la realización de co-cultivos de sectores organotípicos. Se ha demostrado que las fibras de escalada pueden penetrar en los cultivos de rodajas cerebelosas posnatales cuando se co-cultivan con cultivos inferiores de rodajas de olivo14,19. Más interesante, las células de Purkinje contactadas por las fibras de escalada sobrevivieron14.
Aquí, nos centramos en el uso del cultivo de rebanadas organotípicas para buscar moléculas neuroprotectoras en el cerebelo en desarrollo. Sin embargo, este método es igualmente adecuado para otras condiciones como la neurodegeneración20,la regeneración axonal21,y el seguimiento de la actividad del circuito neuronal22,23. Las aplicaciones post-cultivo van más allá de la inmunofluorescencia. Los cortes se pueden utilizar para estudios bioquímicos o de expresión génica, con el fin de investigar los mecanismos biológicos implicados en el efecto neuroprotector de un compuesto dado. En conjunto, este modelo puede sentar las bases para encontrar nuevas moléculas neuroactivas antes de las pruebas in vivo y ser un suplemento eficaz y confiable a los estudios mecánicos in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo por imágenes se realizó en el Northwestern University Center for Advanced Microscopy con el apoyo generoso de NCI CCSG P30 CA060553 otorgado al Centro Integral del Cáncer Robert H Lurie. Agradecemos a Sean McDermott por su asistencia técnica y apoyo, y maya Epstein por las ilustraciones dibujadas a mano que se muestran en la Figura 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
