Summary
Organotypic slice kulturer är ett kraftfullt verktyg för att studera neuroutvecklingsrelaterade eller degenerativa/regenerativa processer. Här beskriver vi ett protokoll som modellerar den neuroutvecklande döden av Purkinje celler i mus cerebellär slice kulturer. Denna metod kan gynna forskning inom neuroprotektiva Drug discovery.
Abstract
Organotypic slice kultur är en kraftfull in vitro-modell som mimicks in vivo villkor närmare än dissocierade primära cellkulturer. I tidig postnatal utveckling, cerebellär Purkinje celler är kända för att gå igenom en sårbar period, under vilken de genomgår programmerad celldöd. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att utföra mus organotypic cerebellär slice kultur under denna kritiska tid. Skivorna är ytterligare märkta för att bedöma Purkinje cellöverlevnad och effekten av neuroprotektiva behandlingar. Denna metod kan vara mycket värdefullt att skärmen för nya neuroaktiva molekyler.
Introduction
In vitro-modellering är ett viktigt verktyg i biomedicinsk forskning. Det gör det möjligt för utredare att studera och noggrant kontrollera specifika mekanismer i begränsade celltyper, eller i isolerade system/organ. Organotypic slice kultur är en allmänt använd in vitro-teknik, särskilt inom neurovetenskap1. Metoden fastställdes först av Gähwiler, som odlade hjärn skivor med hjälp av rullrör teknik2, och senare modifierad av Yamamoto et al., som introducerade användningen av en mikroporös membran för att utföra kortikala slice kulturer3. Jämfört med primära cellkulturer, organotypic slice kulturer presentera fördelen av att bevara cytoarchitecture av vävnaden, samt infödda cell-cell-anslutningar i planet av vävnaden avsnitt.
Organotypic skivor har kultiverats från många delar av det centralanervsystemet, såsom Hippocampus4, cortex5, striatum6, lillhjärnan4,7, och ryggmärgen8,9, bland annat. De har visat sig vara ett kraftfullt verktyg i Drug discovery studier10. Effekterna av neuroaktiva molekyler kan bedömas på många sätt: överlevnad och neurodegeneration med hjälp av immunofärgning och biokemi analyser, neuronala krets bildning, eller störningar med hjälp av elektrofysiologi och Live-Imaging.
Målet med detta arbete är att beskriva en enkel metod för att utföra organotypic cerebellär slice kultur, som är kända för att vara en relevant modell för att efterlikna cerebellär utveckling in vitro-. Särskilt fokuserade vi på studiet av Purkinje cell utvecklings död. In vivo, Purkinje celler genomgår apoptos under den första postnatal veckan, topp på postnatal dag 3 (P3)11. Samma mönster observeras i cerebellär slice kultur, med Purkinje nervceller dör av apoptos när cerebella tas från djur mellan P1 och P8, med en topp på P34,12. Användningen av organotypic cerebellär segment kulturer har tillåtit att identifiera flera nervskyddande molekyler7,13, samt förstå en del av de mekanismer som deltar i denna programmerade celldöd14,15,16. Här beskriver vi ett protokoll baserat på studien av stoppini et al.17 i hippocampus, och anpassas till lillhjärnan av Dusart et al.4 det inkluderar snabb dissektion och hackning av postnatal cerebella; skivning kultur på en cellkultur Infoga som innehåller en mikroporösa membran, med eller utan nervskyddande behandling; och immunofluorescenfärgning för att bedöma neuronala överlevnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med djur utfördes i enlighet med Northwestern University Animal Studies kommittén.
1. beredning före organotypic cerebellär segment kulturer
- I en cellkultur huva besprutas med 70% etanol i förväg, förbereda 200 mL odlingssubstrat i en 250 mL flaska-Top vakuum filter bifogas en steril flaska mottagare. Tillsätt 100 ml basal medium Eagle (BME), 50 mL Hanks balanserad saltlösning (HBSS), 50 mL av Värmeinaktiverade häst serum, 1 mL 200 mM L-glutamin (slutlig koncentration 1 mM) och 5 mL 200 g/L glukos (slutlig koncentration 5 mg/mL). Vakuum-filtrera odlingsmediet och behåll det vid + 4 ° c i upp till en månad.
- I det steriliserade biosäkerhets skåpet, ta ut en 6-brunn kultur tallrik från sitt paket. Fyll varje brunn med 1 mL odlingssubstrat. Om en behandling testas, tillsätt farmakologiska medlet till den behandlade brunnen, och samma volym av fordonets lösning för kontroll väl. I den nuvarande studien lade vi till 1 μL steril 3 M KCl-lösning till den behandlade brunnen (30 mM slutlig) och 1 μL sterilt vatten till kontroll brunnarna.
- Ta in cellkulturen huva det nödvändiga antalet individuellt lindade cellkultur skär med hydrofila polytetrafluoreten (PTFE) membran (porstorlek = 0,4 μm). Försiktigt packa upp dem och ta ut cellodling skär med sterila tång. Släpp dem en efter en i en brunn av en 6-bra tallrik, undvika bubblor i gränssnittet mellan skär membranet och cell odlingsmediet. Låt skären jämvikt i mediet i en 37 ° c, 5% Co2 inkubator för minst 2 h före kulturen.
Anmärkning: vävnads helikoptern permanent bosatt i cell Culture Hood. - Förbered 2 200 mL bägare, en fylld med 150 mL sterilt vatten, och den andra fylld med 150 mL 70% etanol. Doppa de kirurgiska verktygen i 70% etanol badet och sedan i vatten innan du använder dem.
Obs: Använd inte kirurgiska verktyg omedelbart efter kontakt med etanol. - Desinficera det tveeggade bladet i etanol bägaren 70%. Placera den på bladhållaren med hjälp av sterila tång och håll den på plats med hjälp av blad kläm nyckeln. Låt den torka tills den används.
- Desinficera plastskivan som medföljer vävnads helikoptern i etanol bägaren 70%. Spraya skärbordet med 70% etanol innan du placerar skivan på den. Låt torka tills användning.
2. dissektion och cerebellär Organotypic slice kulturer
- Ta mus valp inuti cell Culture Hood att utföra dissektion.
- Halshugga PUP snabbt med hjälp av raka sax (figur 1A).
- Fördriva tiden hållande den pup ' huvud vid näsan med rak påklädning forceps, klippa öppen den hårbotten användande rak öga saxen, startande från den bakre ände, och gående lateral till mittlinjen.
- Fortsätt identiskt för skallen.
Obs: se till att peka saxspetsarna utåt för att undvika att skada lillhjärnan under dissektion. - Ta ut hjärnan och överföra den till en 60-mm maträtt fylld med kallt HBSS + 5 mg/mL glukos.
- Försiktigt dissekera ut lillhjärnan med hjälp av sterila raka fina tång (figur 1B). Överför den till plastskivan placerad på skärbordet i vävnads helikoptern med hjälp av sterila böjda fina pinkför.
- Orientera vävnaden genom att rotera skärbordet för att utföra parasagittal sektioner.
- Flytta skärbordet genom att dra i tabellen release ratten till höger, så att bladet är placerad vid kanten av vävnaden.
- Justera segment tjockleken till 350 μm och bladets hastighet till medel.
- Starta helikoptern. När hela lillhjärnan har skivade (figur 1C), stänga av helikoptern.
- Ta bort plastskivan med sterila tång.
- Ta försiktigt plastskivan nära en 60-mm maträtt som innehåller HBSS + 5 mg/mL glukos. Pipettera kallt HBSS + 5 mg/mL glukos på vävnaden med en steril överföringspipett för att tillåta skörd av cerebellär skivor i den buffertfyllda skålen.
- Separera cerebellär skivor från varandra med hjälp av en microprobe. Ta ut bra kvalitet avsnitt med överföringspipett (det rekommenderas att använda vävnad sektioner som är nära vermis) och släppa dem i en pre-equilibrated cellkultur Infoga (figur 1D).
- Placera lillhjärnan skivor på cellodling infoga med hjälp av mikrosond, sedan försiktigt bort överskottet HBSS + 5 mg/mL glukoslösning med överföringspipett.
Obs: i detta skede vävnaden är extremt anbud och benägna att fysiska skador. Det maximala antalet cerebellär skivor per cell odlings insats beror på donatordjurets ålder. 6 – 8 skivor kan odlas för ett P0 – P4-gammalt djur, och 4 – 6 skivor för djur äldre än P5. - Placera kultur skålen i inkubatorn och ändra mediet helt varje 2 – 3 dagar.
- För att bedöma Purkinje cellöverlevnad, skivor kan samlas in så tidigt som 5 dagar in vitro-. För andra ändamål kan de bibehållas i kultur under flera veckor (figur 1F).
Anmärkning: när det gäller Purkinje cellöverlevnad experiment, finns det ingen anledning att förnya den farmakologiska behandlingen vid byte av cell odlingssubstrat (figur 1F).
3. immunofluorescens
- Ta ut 6-brunnen plattan från inkubatorn. Ta bort cellodlingsmedium, tvätta cell odlings insatsen med 1x PBS, och fixera skivorna med kallt 4% paraformaldehydlösning för 1 h, med 1 mL under cell odlings insatsen och 500 μL ovanpå cellkultur insatsen.
- Tvätta skären 4x 10 min med 1x PBS, med 1 mL under och 500 μL ovanpå skäret, i orbitalskak.
- Med en borste, överföra cerebellär skivor från 1 cellkultur infoga till 1 brunn av en 24-brunn pre-fyllt med 1x PBS, 0,25% Triton X-100, och 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/brunn.
- Permeabilize och blockera skivor genom inkubation i PBS-TB för 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera med primära antikroppar som späds ut i PBS-TB-lösningen, över natten vid + 4 ° c, i orbitalskak, 200 μL/brunn.
- På följande dag, utföra fyra tvättar av 10 min med 1x PBS, på en orbital shaker, 500 μL/brunn.
- Inkubera med sekundära antikroppar som späds ut i PBS-TB-lösningen, två timmar i rumstemperatur, i orbitalskak och skyddat från ljus, 200 μL/brunn.
- Utför fyra tvättar på 10 min med 1x PBS, i orbitalshakern, 500 μL/brunn.
- Försänker skivorna med Hoechst 33342, utspädd i 1x PBS (2 μg/mL), för 10 min vid rumstemperatur, skyddas från ljus, 500 μL/brunn.
- Montera lillhjärnan skivor på en mikroskopi bild med en överföringspipett. Låt dem lufttorka helt, skyddas från ljus. Re-humidify dem med 1x PBS och tillämpa en täckslip täckt med några droppar av monteringsmedel (~ 80 μL). Undvik att göra några bubblor.
- När monterings mediet har härdat, cerebellär sektioner är redo att avbildas.
4. avbildning och kvantifiering av cell överlevnad
- Slå på mikroskopet och lasrar enligt tillverkaren och/eller Imaging Core facility ' s instruktioner.
- Starta förvärvs programvaran.
- Med hjälp av en 10X mål, lokalisera icke-förändrade cerebellär skivor som presenterar 9 – 10 lobules (vanligtvis cerebellär avsnitt nära vermis).
- Aktivera förvärvet av z-stack. Definiera intervallet för z-stacken för att inkludera alla Purkinje celler som finns i lillhjärnan slice. Ställ in en steg storlek på 2 μm och starta förvärvet. Spara den förvärvade bilden i formatet för anskaffningsprogram tillverkaren för att bevara de associerade metadata.
- Öppna den förvärvade filen i ImageJ med hjälp av bio-format plugin18.
- Gå till bild ≫ stackar > Z-projekt... (figur 2a).
- Välj Max intensitet i listmenyn projektionstyp och klicka på OK (bild 2B).
- En tillplattad 2-D bild kommer att genereras. Dubbel klick på det många--punkt redskap till låta den punkt redskap fönster framträda. Avmarkera alternativet etikett punkter för att underlätta inventerade celler visualisering. Klicka sedan direkt på en Soma av en Purkinje cell för att börja räkna (figur 1E). Det totala antalet räknade celler kommer att anges längst ner i punkt verktygs fönstret (figur 3).
Anmärkning: vanligtvis, minst 3 icke-skadade sektioner som innehåller 9 – 10 lobules per cellkultur infoga kan kvantifieras. För att bedöma den neuroprotektiva effekten av ett farmakologiskt medel ska minst 3 oberoende experiment utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som framgår av figur 4, detta protokoll producerar organotypic cerebellär segment kulturer där Purkinje cellöverlevnad kan bedömas efter immunofluorescens och bild förvärv steg. Purkinje celler var märkta med en kombination av anti-Calbindin D-28K (utspädning 1/200) och Alexa594 anti-mus (utspädning 1/300) antikroppar. Bild sömnad gjordes automatiskt av Mikroskop förvärv programvara (NIS-element) för att få en bild av hela cerebellär slice. Purkinje cell nummer per segment angavs i Prism 8 programvara för att generera diagrammet och utföra statistisk analys. Vid P6 var Purkinje cellöverlevnad låg i kontrollen, i enlighet med deras kända sårbarhet fönster4 (figur 4a, E). Överlevnaden ökade när donatordjuret blev äldre och lämnade denna kritiska period (figur 4C, E). Cerebellär skivor behandlades med hög KCl koncentration att framgångsrikt inducera deras depolarisering och överlevnad14 (figur 4B, D, E).
Bild 1: illustration av protokollet från dissektion till Purkinje cellöverlevnad kvantifiering.
Musen PUP är snabbt halshuggen (a). Efter hjärn dissektion, lillhjärnan är isolerad (B), och sedan hackad i 350 μm-bredd skivor (C). Lillhjärnan sektionerna placeras på en kontroll eller behandlade cellkultur Infoga (D) och upprätthålls i kulturen i minst 5 dagar in vitro-. Vävnaden är sedan fast i 4% paraformaldehyd, immunofärgning utförs, och bilder förvärvas med ett konfokala Mikroskop. Slutligen är Purkinje cell nummer kvantifieras i varje segment med hjälp av Multipoint verktyget i ImageJ (E). (F) Schematisk tidsförlopp för KCL-behandling under kultur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: ImageJ-inställningar som används för att platta ut 3D-stacken före kvantifieringen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inställningar som används för att räkna Purkinje cell nummer med Multipoint verktyget i ImageJ med ett exempel på en cerebellär slice kvantifieras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Purkinje cellöverlevnad i organotypic cerebellär slice kultur efter hög KCl behandling.
Representativ bild av cerebellär skivor tagna på postnatal dag 6 (a, B) eller 8 (c, c, d, d), antingen obehandlade (a, c, c) eller behandlade med 30 mm KCL (B, d, d). (C och D) Högre förstoringsgrad för de vita inramade regionerna i C och D. Skivor hölls 5 dagar in vitro före fixering. Purkinje celler är märkta med Calbindin D-28K i rött. Scale bar = 500 μm (A–d) och 100 μm (C ' och d'). (E) kvantifiering av Purkinje cellöverlevnad från P6-och P8-kulturer, kontroll eller behandlad med 30 mm KCL, visar en högre överlevnad med behandlingen (Mann-Whitney test, n = 3 till 5 skivor). Data uttrycks som medelvärdet ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebellär slice kultur är ett kraftfullt verktyg för att studera programmerad Purkinje celldöd under postnatal utveckling. Denna teknik kan användas för att snabbt skärmen kandidat molekyler för deras nervskyddande potential. Den största fördelen är att installationen är enkel och mycket kostnadseffektiv, och endast kräver en blygsam investering i utrustning (en vibratome kan kosta upp till 3 gånger mer än en vävnad chopper). Dessutom kan 10 till 15 friska skivor genereras från en mus PUP, vilket möjliggör olika analyser som ska utföras parallellt med endast ett djur.
För att få konsekventa och reproducerbara resultat, är det viktigt att utföra kulturen så effektivt som möjligt och att välja friska cerebellär sektioner som ska odlas. Denna metod är också lämplig för långsiktig kultur (upp till flera månader). Så, det är viktigt att använda bra aseptisk teknik under dissektion och hugga processen för att undvika föroreningar och behovet av att komplettera kulturer med antibiotika.
Den cerebellär slice kultur modell bevarar befintliga cell-cell interaktioner i planet av vävnaden avsnitt, och i regionen odlade. Detta kommer med en varning: anslutningar med mål utanför den odlade regionen kan vara avskiljt. Utbudet i neurotrofiska faktorer som afferenta fibrer kan avbrytas samt och försämra neuronala överlevnad. Detta kan delvis kringgås genom att utföra organotypic segment Co-kulturer. Det har visat sig att klättring fibrer kan penetrera postnatal cerebellär segment kulturer när Co-odlade med sämre oliv slice kulturer14,19. Mer intressant, Purkinje celler kontaktad av klättring fibrer överlevde14.
Här fokuserade vi på användningen av organotypic slice kultur för att söka efter nervskyddande molekyler i utvecklingen cerebellum. Emellertid, denna metod är lika lämplig för andra förhållanden såsom neurodegeneration20, axonal förnyelse21, och övervakning av neuronala krets aktivitet22,23. Postkulturapplikationerna går utöver immunofluorescens. Skivor kan användas för biokemiska eller gen uttrycks studier, för att undersöka de biologiska mekanismer som är involverade i den neuroprotektiva effekten av en given förening. Sammantaget kan denna modell lägga grunden för att hitta nya neuroaktiva molekyler före in vivo testning och vara ett effektivt och tillförlitligt komplement till in vivo mekanistiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Imaging arbete utfördes på Northwestern University Center for Advanced Microskopi generöst stöds av NCI CCSG P30 CA060553 tilldelas Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi tackar Sean McDermott för hans tekniska hjälp och stöd, och Maya Epstein för handritade illustrationer visas i figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
