Summary
Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.
Abstract
Organotipik dilim kültürü, vivo koşullarda ayrışmış birincil hücre kültürlerinden daha yakından taklit eden güçlü bir in vitro modeldir. Erken doğum sonrası gelişiminde, serebellar Purkinje hücrelerinin programlanmış hücre ölümü sırasında savunmasız bir dönemden geçtiği bilinmektedir. Burada, bu kritik dönemde fare organotipik serebellar dilim kültürünü gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Dilimler purkinje hücre sağkalım ve nöroprotektif tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için daha fazla etiketlenir. Bu yöntem yeni nöroaktif molekülleriçin ekran için son derece değerli olabilir.
Introduction
In vitro modelleme biyomedikal araştırmalarda önemli bir araçtır. Araştırmacıların kısıtlı hücre tiplerinde veya izole sistemlerde/organlarda belirli mekanizmaları incelemesine ve sıkı bir şekilde kontrol etmesine olanak tanır. Organotipik dilim kültürü özellikle nöroloji alanında in vitro tekniğinde yaygın olarak kullanılan bir kültürdür1. Yöntem ilk Gähwiler tarafından kuruldu, kim roller tüptekniği2 kullanarak beyin dilimleri kültürlü , ve daha sonra Yamamoto ve ark tarafından modifiye, kortikal dilim kültürleri gerçekleştirmek için mikrogözenekli membran kullanımı tanıttı3. Birincil hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim kültürleri doku sitomimarisinin yanı sıra doku bölümünün düzleminde yerli hücre-hücre bağlantılarını koruma avantajını sunar.
Organotipik dilimler merkezi sinir sisteminin birçok yerinden kültürlü olmuştur, hipokampus gibi4, korteks5, striatum6, beyincik4,7, ve omurilik8,9, diğerleri arasında. Onlar ilaç keşif çalışmalarında güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır10. Nöroaktif moleküllerin etkileri birçok şekilde değerlendirilebilir: immünboyama ve biyokimya testleri kullanılarak sağkalım ve nörodejenerasyon, nöronal devre oluşumu, ya da elektrofizyoloji ve canlı görüntüleme kullanarak bozulma.
Bu çalışmanın amacı, in vitro serebellar gelişimi taklit etmek için ilgili bir model olduğu bilinen organotipik serebellar dilim kültürü gerçekleştirmek için basit bir yöntem tanımlamaktır. Özellikle Purkinje hücre gelişimsel ölümü üzerine yoğunlaştık. In vivo, Purkinje hücreleri ilk doğum sonrası hafta boyunca apoptoz geçmesi, postnatal gün 3 pik (P3)11. Aynı desen serebellar dilim kültüründe gözlenir, Cerebella P1 ve P8 arasında hayvanlardan alındığında Purkinje nöronlar apoptosis tarafından ölüyor, P3 bir tepe ile4,12. Organotipik serebellar dilim kültürlerin kullanımı çeşitli nöroprotektifmolekülleritanımlamak için izin verdi 7,13, yanı sıra bu programlanmış hücre ölümü dahil mekanizmaların bir kısmını anlamak14,15,16. Burada, Hipokampus Stoppini ve ark.17 çalışmasına dayalı bir protokol tarif ve Dusart ve ark.4 Tarafından beyincik adapte bu hızlı diseksiyon ve postnatal serebella doğrama içerir; nöroprotektif tedavi li veya olmadan, mikrogözenekli membran içeren bir hücre kültürü eklemek üzerine dilimleme kültürü; ve nöronal sağkalımı değerlendirmek için immünoresans boyama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm deneyler Northwestern Üniversitesi Hayvan Araştırmaları komitesine uygun olarak yapılmıştır.
1. Organotipik serebellar dilim kültürleri öncesinde hazırlık
- Önceden %70 etanol püskürtülen bir hücre kültüründe, steril şişe alıcısına bağlı 250 mL şişe üstü vakum filtresinde 200 mL kültür ortamı hazırlayın. 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), 50 mL Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 50 mL ısı yalıtımlı at serumu, 1 mL 200 mM L-Glutamin (son konsantrasyon 1 mM) ve 5 mL 200 g/L glukoz (son konsantrasyon 5 mg/mL) ekleyin. Kültür ortamını vakumla filtreleyin ve bir aya kadar +4 °C'de tutun.
- Sterilize edilmiş biyogüvenlik kabininde, paketinden 6 kuyulu bir kültür plakası alın. Her kuyuya 1 mL kültür ortamı doldurun. Bir tedavi test edilirse, tedavi kuyuya farmakolojik ajan ekleyin, ve iyi kontrol için araç çözeltisi aynı hacimde. Bu çalışmada, tedavi edilen kuyuya 1 μL steril 3 M KCl çözeltisi (30 mM final) ve kontrol kuyularına 1 μL steril su ekledik.
- Hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) membran (gözenek boyutu = 0,4 μm) ile ayrı ayrı sarılmış hücre kültürü eklerin gerekli sayıda hücre kültürü başlık içine getirin. Dikkatlice onları açmak ve steril forceps ile hücre kültürü ekler çıkarmak. Ekleme zarı ve hücre kültürü ortamı arasındaki arabirimde kabarcıklardan kaçınarak, 6 kuyulu bir plakanın içine teker teker bırakın. Ekler in37 °C, 5% CO2 kuluçka içinde en az 2 saat kültür önce orta dengesağlar.
NOT: Doku helikopteri hücre kültüründe kalıcı olarak bulunur. - Biri 150 mL steril su ile dolu, diğeri 150 mL %70 etanol le doldurulmuş iki adet 200 mL beafer hazırlayın. Cerrahi aletleri kullanmadan önce %70 etanol banyosuna ve daha sonra suya batırın.
NOT: Etanol ile temastan hemen sonra cerrahi aletler kullanmayın. - %70 etanol kabında çift kenarlı bıçağı dezenfekte edin. Steril forceps kullanarak bıçak tutucuüzerine yerleştirin ve bıçak kelepçe anahtarı kullanarak yerine tutun. Kullanıma kadar kurutun.
- % 70 etanol beaker doku helikopter ile sağlanan plastik disk dezenfekte. Diski üzerine yerleştirmeden önce kesme masasını %70 etanolle püskürtün. Kullanıma kadar kurualım.
2. Diseksiyon ve Serebellar Organotypic Dilim Kültürleri
- Diseksiyonu gerçekleştirmek için fare yavrusunu hücre kültürü başlığının içine getirin.
- Düz çalışma makası kullanarak yavrunun kafasını hızlı bir şekilde decapitate(Şekil 1A).
- Düz pansuman forceps ile burun tarafından yavrubaşını tutarken, arka ucundan başlayarak, düz göz makas kullanarak kafa derisi açık kesilmiş ve orta hatta yanal gidiyor.
- Kafatası için aynı şekilde ilerleyin.
NOT: Diseksiyon sırasında beyincik zarar önlemek için dışa makas uçları işaret emin olun. - Beyni çıkar ve soğuk HBSS + 5 mg/mL glikoz ile dolu 60 mm'lik bir tabağa aktarın.
- Steril düz ince forceps kullanarak beyincik dikkatlice dışarı incelemek (Şekil 1B). Steril kavisli ince çalgılar kullanarak doku helikopterinin kesme masasına yerleştirilen plastik diske aktarın.
- Parasagittal kesitler gerçekleştirmek için kesme tablosunu döndürerek dokuyu yönlendirin.
- Bıçak dokunun kenarına yerleştirilmiş, böylece masa serbest düğüm sağa çekerek kesme tablosu taşıyın.
- Dilim kalınlığını 350 μm'ye, bıçak hızını orta hıza ayarlayın.
- Helikopteri çalıştırın. Tüm beyincik dilimlendikten sonra(Şekil 1C),helikopteri kapatın.
- Steril forceps ile plastik disk çıkarın.
- Plastik diski HBSS + 5 mg/mL glikoz içeren 60 mm'lik bir tabağa dikkatlice yakınlaştırın. Pipet soğuk HBSS + 5 mg / mL glukoz tampon dolu çanak serebellar dilimleri hasat sağlamak için steril bir transfer pipet kullanarak doku üzerine.
- Serebellar dilimlerini bir mikroprob kullanarak birbirinden ayırın. Transfer pipeti ile kaliteli bölümleri alın (vermise yakın doku bölümleri kullanılması tavsiye edilir) ve önceden dengelenmiş hücre kültürü eklemesine bırakın (Şekil 1D).
- Serebellar dilimleri mikroprobu kullanarak hücre kültürü ekine yerleştirin, sonra transfer pipeti ile fazla HBSS + 5 mg/mL glukoz çözeltisini dikkatlice çıkarın.
NOT: Bu aşamada doku son derece hassas ve fiziksel hasareğilimli. Hücre kültürü eklemek başına serebellar dilimlerin maksimum sayısı donör hayvanın yaşına bağlıdır. P0-P4 yaşındaki bir hayvan için 6-8 dilim, P5'ten büyük hayvanlar için 4-6 dilim kültürlenebilir. - Kültür çanamasını kuvöze yerleştirin, ortayı 2-3 günde bir tamamen değiştirin.
- Purkinje hücre sağkalım değerlendirmek için, dilimler kadar erken toplanabilir 5 gün in vitro. Diğer amaçlar için, birkaç hafta boyunca kültür de tutulabilir(Şekil 1F).
NOT: Purkinje hücre sağkalım deneylerinde, hücre kültürü ortamını değiştirirken farmakolojik tedaviyi yenilemeye gerek yoktur (Şekil 1F).
3. İmmünofluoresans
- Kuvözden 6 kuyulu plakayı çıkar. Hücre kültürü ortamını kaldırın, hücre kültürünü 1x PBS ile yıkayın ve dilimleri 1 saat boyunca soğuk %4 paraformaldehit çözeltisi ile düzeltin, hücre kültürü kesici ucunun altında 1 mL ve hücre kültürü kesici ucunun üzerine 500 μL ile düzeltin.
- Uçları 4x 10 dk'yı 1x PBS ile, 1 mL altında ve 500°L'lik uçları bir orbital shaker üzerinde yıkayın.
- Bir fırça ile, 1 hücre kültüründen serebellar dilimleri 1 x PBS, 0.25% Triton X-100 ve% 3 BSA (PBS-TB), 500 μL / iyi ile önceden doldurulmuş 24 iyi bir kuyu ya da 1.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS-TB'de kuluçka ya da kesitleri permeabilize edin ve engelleyin.
- PBS-TB çözeltisinde seyreltilmiş primer antikorlarla, bir gecede + 4 °C'de, bir orbital shaker üzerinde, 200 μL/well ile inkübül.
- Ertesi gün, 1x PBS ile 10 dakika dört yıkar, bir orbital shaker, 500 μL / iyi.
- PBS-TB çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla, oda sıcaklığında iki saat, bir orbital shaker üzerinde inkübatve ışıktan korunur, 200 μL/iyi.
- 1x PBS ile 10 dk'lık dört yıkAma, orbital shaker, 500 μL/iyi yapın.
- 1x PBS (2 μg/mL) olarak seyreltilmiş, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıktan korunan, 500 μL/iyi olan Hoechst 33342 kullanarak dilimleri ters boylayın.
- Serebellar dilimleri transfer pipetile mikroskopi slayt üzerine monte edin. Tamamen kurusunlar, ışıktan korunsunlar. 1x PBS ile yeniden nemleştirin ve birkaç damla montaj ortamı (~80 μL) ile kaplanmış bir kapak kayması uygulayın. Herhangi bir kabarcıklar yapmaktan kaçının.
- Montaj ortamı iyileştikten sonra serebellar kesitler görüntülenmeye hazırdır.
4. Hücre Sağkalımının Görüntülenmesi ve Ölçülmesi
- Mikroskobu ve lazerleri üreticinin ve/veya görüntüleme çekirdeği tesisinin talimatlarına göre açın.
- Satın alma yazılımını başlatın.
- 10X hedefi kullanarak, 9-10 lobules (genellikle vermise yakın serebellar kesitler) mevcut değişmemiş serebellar dilimleri bulmak.
- z yığını edinimi etkinleştirin. Serebellar dilimmevcut tüm Purkinje hücreleri içerecek şekilde z-yığınının aralığını tanımlayın. 2 μm adım boyutu ayarlayın ve satın alma başlatın. İlişkili meta verileri korumak için edinilen resmi edinme yazılımı üreticisi biçiminde kaydedin.
- Bio-formatlar eklentisi18kullanarak ImageJ edinilen dosyayı açın.
- Resim > Yığınlar > Z-projesine git... (Şekil 2A).
- Projeksiyon türü açılır menüde Maksimum Yoğunluk'u seçin ve Tamam 'ı tıklatın (Şekil 2B).
- Düzleştirilmiş bir 2-B görüntü oluşturulur. Point Tool penceresinin görünmesi için Çok noktalı araca çift tıklayın. Sayılan hücre görselleştirmesini kolaylaştırmak için Etiket noktaları seçeneğini kaldırın. Daha sonra, saymaya başlamak için bir Purkinje hücresinin soma üzerine doğrudan tıklayın (Şekil 1E). Sayılan hücrelerin toplam sayısı Nokta Aracı penceresinin alt kısmında gösterilir (Şekil 3).
NOT: Genellikle hücre kültürü kesici uç başına 9-10 lobül içeren en az 3 hasarsız bölüm ölçülebilir. Farmakolojik bir ajanın nöroprotektif etkisini değerlendirmek için en az 3 bağımsız deney yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4'tegösterildiği gibi, bu protokol, purkinje hücre sağkalımının immünfloresans ve görüntü edinim adımlarından sonra değerlendirilebileceği organotipik serebellar dilim kültürleri üretmektedir. Purkinje hücreleri anti-Calbindin D-28K (seyreltme 1/200) ve Alexa594 anti-fare (seyreltme 1/300) antikorları kombinasyonu ile etiketlenmiştir. Görüntü dikiş otomatik olarak mikroskop satın alma yazılımı (NIS-Elements) tarafından tüm serebellar dilim bir resim elde etmek için yapıldı. Purkinje dilim başına hücre numaraları prism 8 yazılımına girildi grafik oluşturmak ve istatistiksel analiz yapmak için. P6'da Purkinje hücre sağkalım kontrolü düşüktü ve bilinen güvenlik açığı penceresi4 ile tutarlıydı (Şekil 4A,E). Donör hayvan yaşlandıkça ve bu kritik dönemden çıktıkça sağkalım artmıştır(Şekil 4C,E). Serebellar dilimler depolarizasyon ve sağkalımlarını başarılı bir şekilde indüklemek için yüksek KCl konsantrasyonu ile tedavi edildi14 (Şekil 4B,D,E).
Şekil 1: Diseksiyondan Purkinje hücre sağkalım niceline kadar protokolün çizimi.
Fare yavrusu nun kafası hızla kesilir (A). Beyin diseksiyonu sonrasında, beyincik izole edilir(B), ve daha sonra 350 μm genişliğinde dilimler halinde doğranmış(C). Serebellar kesitler kontrol veya tedavi hücre kültürü eklemek üzerine yerleştirilir(D) ve en az 5 gün in vitro kültür korunur. Doku daha sonra % 4 paraformaldehit le sabitlenir, immünboyama yapılır ve resimler konfokal mikroskop ile elde edilir. Son olarak, Purkinje hücre numarası ImageJ(E)multipoint aracı kullanılarak her dilimde ölçülür. (F) Kültür sırasında KCl tedavisinin zaman dilimişeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3D yığınını nicelemeönce düzleştirmek için kullanılan ImageJ ayarları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ImageJ'deki Multipoint aracını kullanarak Purkinje hücre numarasını saymak için kullanılan ayarlar ve serebellar dilimin sayısallaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yüksek KCl tedavisi sonrası organotipik serebellar dilim kültüründe Purkinje hücre sağkalım.
Doğum sonrası 6(A, B) veya 8(C, C', D , D'), tedavi edilmeyen (A, C, C') veya 30 mM KCl (B, D, D'ile tedavi edilen serebellar dilimlerinin temsili görüntüsü . (C' ve D') C ve D'dekibeyaz kutulu bölgelerin daha yüksek büyütme görünümü. Dilimler fiksasyondan 5 gün önce in vitro olarak tutulmuştur. Purkinje hücreleri kırmızı Calbindin D-28K ile etiketlenir. Ölçek çubuğu = 500 μm (A–D), ve 100 μm (C' ve D'). (E) P6 ve P8 kültürlerinden Purkinje hücre sağkalımını kontrol altında veya 30 mM KCl ile tedavi edilen, tedavi ile daha yüksek bir sağkalım gösterir (Mann-Whitney testi, n = 3-5 dilim). Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serebellar dilim kültürü, doğum sonrası gelişim sırasında programlanmış Purkinje hücre ölümünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Ana avantajı kurulum basit ve çok uygun maliyetli olmasıdır, ve sadece ekipman mütevazı bir yatırım gerektirir (bir vibratom kadar mal olabilir 3 kat daha fazla bir doku helikopteri). Ayrıca, 10 ila 15 sağlıklı dilimler bir fare yavrusu ndan oluşturulabilir, böylece tek bir hayvan kullanılarak paralel olarak farklı tahliller yapılabilir.
Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kültürün mümkün olduğunca verimli bir şekilde gerçeklemesi ve kültürlenecek sağlıklı serebellar kesitlerin tercih edilmesi çok önemlidir. Bu yöntem uzun vadeli kültür için de uygundur (birkaç aya kadar). Yani, kontaminasyonve antibiyotik ile kültürleri tamamlamak için ihtiyaç önlemek için diseksiyon ve doğrama işlemi sırasında iyi aseptik tekniği kullanmak esastır.
Serebellar dilim kültür modeli doku bölümünün düzleminde mevcut hücre hücre etkileşimlerini korur, ve bölgede kültürlü. Bu bir uyarı ile birlikte gelir: kültürlü bölge dışında hedefleri ile bağlantıları kesilmiş olabilir. Afferent lifler tarafından sağlanan nörotrofik faktörlerde kaynağı da kesilebilir ve nöronal sağkalımı bozabilir. Bu kısmen organotypic dilim co-kültürler icra ederek atlatılabilir. Bu tırmanma lifleri inferior zeytin dilimi kültürleri14,19ile co-kültürlü zaman postnatal serebellar dilim kültürleri nüfuz edebilir gösterilmiştir. Daha ilginç, Purkinje hücreleri tırmanma lifleri ile temas14hayatta .
Burada, gelişmekte olan beyincik nöroprotektif molekülleri aramak için organotipik dilim kültürünün kullanımına odaklandık. Ancak, bu yöntem nörodejenerasyon gibi diğer koşullar için eşit uygundur20, aksonal rejenerasyon21, ve nöronal devre aktivitesinin izlenmesi22,23. Kültür sonrası uygulamalar immünororesans ötesine geçer. Dilimler biyokimyasal veya gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabilir, belirli bir bileşiğin nöroprotektif etkisi nde yer alan biyolojik mekanizmaları araştırmak için. Tamamen, Bu model in vivo test önce yeni nöroaktif molekülleri bulmak için zemin hazırlayabilir ve in vivo mekanistik çalışmalar için etkili ve güvenilir bir ek olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Northwestern Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi'nde NCI CCSG P30 CA060553 tarafından cömertçe desteklenen ve Robert H Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi'ne verilen görüntüleme çalışmaları gerçekleştirildi. Biz sean McDermott onun teknik yardım ve destek için teşekkür ederim, ve Maya Epstein şekil 1gösterilen elle çizilmiş çizimler için .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
