Summary
אנו מציגים מערכת microinjectrode מיועד אלקטרופיזיולוגיה וסיוע משלוח של בדיקה ניסויית (כלומר, ננוחיישנים, microאלקטרודות), עם עירוי תרופה אופציונלי. רכיבים במיקרופלואידיג זמינים באופן נרחב לצינורית המכילה את הגשוש. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור הבנייה microinjectrode הוא כלול, עם תוצאות במהלך עירוי מוסקימול בקליפת מקוק.
Abstract
מערכת microinjectrode זו מיועדת לעירוי תרופות, אלקטרופיזיולוגיה ומסירה ואחזור של בדיקה ניסויית, כגון מיקרואלקטרודות ו ננו-חיישנים, אופטימיזציה לשימוש חוזר ונשנה בחיות מתנהגות. ניתן להגדיר את מערכת microinjectrode למטרות מרובות: (1) הסדר הפשוט של הצינורית למיקום של בדיקה ניסיונית שאחרת יהיה שברירי מדי לחדור את מאטר דורא, (2) אינפוזיה מיקרופלואידיג של סם, או באופן עצמאי או משולב לצינורית (כלומר, מיקרואלקטרודה, ננו-חיישן). בפרוטוקול זה אנו מסבירים את הצעד אחר צעד בניית המיקרו-הזרקה, הזיווגים שלה לרכיבי microflu, והפרוטוקול לשימוש במערכת בvivo. רכיבי מיקרופלואידים של מערכת זו מאפשרים משלוח של כרכים על הסולם nanoliter, עם נזק חדירה מינימלי. ניתן לבצע עירוי של סמים באופן עצמאי או בו זמנית עם בדיקה ניסויית כגון מיקרואלקטרודות או ננו-חיישנים בעלי חיים מתנהגים. יישומים של טווח מערכת זו מדידת ההשפעות של תרופה על פעילות החשמל הקורטיקלית והתנהגות, כדי להבין את הפונקציה של אזור מסוים של קליפת המוח בהקשר של ביצועים התנהגותיים מבוסס על מדידות בדיקה או ננוחיישן. כדי להדגים חלק מהיכולות של מערכת זו, אנו מציגים דוגמה של אינפוזיה של מוסמול להפעלה הפיכה של שדה העין החזיתי (FEF) ברזוס קוק במהלך משימת זיכרון עבודה.
Introduction
אלקטרופיזיולוגיה ושיטות הזרקת סמים נמצאים בשימוש נרחב במדעי המוח כדי ללמוד פעילות עצבית והתנהגות, ב vivo, מכרסמים ופרימטים. בשלושת העשורים האחרונים, שיפורים של מודלים הזרקה מוקדם התיר טכניקה מדויקת יותר פולשנית פחות, הקלטה סימולטני והזרקת סמים באתרי המוח הספציפיים1,2,3. עבור פרימטים בפרט, את היכולת לספק באופן מדויק כרכים קטנים עם נזק רקמות מינימלי הוא קריטי אם הטכניקה היא לשמש למחקר של פונקציות קוגניטיביות מתקדמות הדורשות חיות מיומן מאוד. ההתקדמות האחרונה כוללת אלקטרופיזיולוגיה כרונית מדידות כימיות בשילוב עם גירוי באמצעות בדיקה מושתל4, והקלטה משולבת משלוח תרופות microfluidic היתה לאחרונה הנווט מכרסמים5. מערכת הinjectrode המתוארת כאן מאפשרת הקלטה אלקטרופיסיולוגית, גירוי, ומסירת סמים מדויקת, והיא כבר יושמה בהצלחה במעבדות פרימטים מרובים6,7,8.
הזמינות הגוברת של חיישנים עדינים, מיוחדים, כגון ננו חיישנים9,10 עם יישומי מדעי המוח, דורש שיטה אמינה להשגת החללית דרך מאטר דורא מבלי לפגוע התקנים ננו שברירי או טיפים מיקרואלקטרודה.
עיצבנו מערכת microinjectrode הגוברת על האתגרים הטכניים של שילוב שיטות אלה באמצעות רכיבים זמינים ובעלות נמוכה, ומקלה על שתי פונקציות עיקריות: (i) היכולת להציב בדיקה ניסיונית שברירית, כגון מיקרואלקטרודה או ננו-חיישן, דרך מאטר דורא ורקמות עצביות, מוגן מכל נזק. פונקציונליות זו מאפשרת מיקום של הגשוש ניסיוני במיקומים ייעודיים, נמסר באמצעות צינורית כמדריך דרך הרקמה העצבית. (ii) היכולת להשתמש במיקרואלקטרודה לביצוע ניסויים המשלבים הקלטות אלקטרופיזיולוגיה וגירוי חשמלי עם הזרקת סמים.
המערכת שלנו משתמשת בצינור מדריך כדי לחדור את הדורא, יחד עם צינורית הפונקציות הן עבור משלוח התרופה (בעת שימוש במערכת עבור microinfusion) ומספק הגנה נוספת עבור המיקרואלקטרודה או ננוחיישן (הן בעת העברת דרך הדורא ו רקמה עצבית). מערכת זו ניתן לבנות בקלות עם רכיבים רבים זמינים מסחרית, אשר זולים וקל למצוא. אנו מצמצמים את הנזק לחדירה באמצעות צינורית בקוטר קטן (OD בקוטר החיצוני = 235 μm, מזהה הקוטר הפנימי = 108 μm).
כאן אנו מציגים הוראות שלב אחר צעד עבור הבנייה microinjectrode וקביעת התצורה של מערכת microfluאידיc. אנו מסבירים את הצעדים הדרושים לשימוש במיקרו-הזרקה, באופן עצמאי או משולב למערכת המיקרופלואידיג להזרקת סמים. גישה דומה יכולה להיות מיושמת עם כל בדיקה ניסיונית שברירית, כגון ננוחיישן9,10. הגשוש יכול להיות מלפנים או מועמס לתוך הצינורית (בהתאם לעיצוב), והיא תהיה מוגנת מפגיעה כאשר היא חודרת לרקמות השכבה והרקמה העצבית. אנו מספקים נתונים למשל מתוך ניסוי vivo עם פרימטים שאינם אנושיים, שבו השתמשנו מיקרואלקטרודה טונגסטן לבצע גירוי חשמלי, ולאחר מכן הוזרק מוסקימול בשדה העין הקדמית (FEF) בעוד בעלי החיים ביצע זיכרון מונחה saccade (MGS) משימה.
Protocol
הליכים ניסיוניים בעקבות המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ובחברה להנחיות ומדיניות מדעי המוח. פרוטוקולים להליכים ניסיוניים והתנהגותיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת יוטה.
1. בניית מיקרואינזידה לגירוי והקלטה (איור 1א)
- למדוד את אורך הצינורית ואת הגשוש (בדוגמה זו ננו חיישן). הבדיקה צריכה להיות ארוכה יותר מהצינורית באורך זה כדי לבלוט באמצעות הצינורית (בהתאם לעיצוב החללית) ועוד כ 2 ס מ.
- תחת מגדיל או מיקרוסקופ (~ 10x הגדלה), לטעון את המקדח לתוך הצינורית; אם אפשר לטעון גיבוי עדיף להגן על קצה הגשוש.
הערה: שלב זה, המתבצע באופן ידני, מאתגר. מומלץ לתרגל עם מיקרואלקטרודה תחת זכוכית מגדלת לפני הניסיון עם המחקר ניסיוני בפועל. -
העבר את הצינורית (המכילה את המקדח) דרך החלק העליון, צומת T, והתחתון ferrule.
- אם הגשוש הוא רק חוט בודד ללא כל ההחזקות, לטעון אותו בחזרה לתוך צינורית ולהכניס את ההרכבה לתוך הצומת T מהחלק התחתון של ferrule. החלק העליון של צינורית (בצד השטוח) צריך להיות ממוקם באמצע הצומת T, בתוך החלק התחתון, אך לא העליון ferrule. הבדיקה הניסיונית או ביוסנסור צריך לבלוט מעל החלק העליון של ferrule העליון.
הערה: מותאם אישית ferrules יכול להתבצע גם על ידי קידוח חור התקעים ferrules באמצעות מיקרו מקדחה, גודל החור המבוסס על הקוטר הדרוש כדי להדק את הצינורית ל-T-הצומת.
- אם הגשוש הוא רק חוט בודד ללא כל ההחזקות, לטעון אותו בחזרה לתוך צינורית ולהכניס את ההרכבה לתוך הצומת T מהחלק התחתון של ferrule. החלק העליון של צינורית (בצד השטוח) צריך להיות ממוקם באמצע הצומת T, בתוך החלק התחתון, אך לא העליון ferrule. הבדיקה הניסיונית או ביוסנסור צריך לבלוט מעל החלק העליון של ferrule העליון.
- השתמש במפתח הברגים כדי להדק את הכללים בחלק העליון והתחתון של צומת ה-T. . אל תהדק יותר מדי חתיכה קטנה של אבובים ניתן להוסיף כדי לחזק את תמיכת האלקטרודה בתוך ferrule העליון.
- סיכות זהב הלחמה לכל מסופי בדיקה (אות, הקרקע, וכו '), על פי המפרט של הגשוש.
- התאימו את המיקום היחסי. של הגשוש והצינורית למדוד את המרחק כי החללית בולטת מתוך צינורית תחת הגדלה, ולהתאים באופן ידני מהקצה העליון (בדיקה יכול להחליק בחופשיות בתוך ferrules).
- הוסף דבק אפוקסי בין סיכות זהב לבין חזיות העליון כדי לצרף את הגשוש כדי חזיות.
- . לבטל את הבדיקה בתוך צינורית ודא באופן חזותי כי הגשוש נמצא בתוך הצינורית תחת הגדלה.
- . חברו את היינאקוייד למיקרו-כונן
2. בניית מיקרואינזידה לעירוי תרופות (איור 1ב)
- הצמד את ה-"לא משופע" או הקצה השטוח של הצינורית לחלק התחתון של צומת ה-T באמצעות שלטון ferrule. השתמש במפתח הברגים כדי להדק את הפרכלל.
- לצרף חתיכה קטנה של צינורות קפילר (~ 1.5 ס מ) לחלק העליון של הצומת T על ידי העברת אותו דרך ferrule רגיל. . להדק עם מפתח ברגים
- האחורי לטעון את המיקרואלקטרודה דרך אבובים נימי, T-הצומת, צינורית וכללי המתאים.
- ודא שהחלק האחורי של האלקטרודה בולט פחות מ-1 ס מ מהחלק האחורי של צינורות הקפילר, וקצהו של האלקטרודה בולט מהצינורית במרחק הרצוי בצד התחתון. ניתן לכוונן באופן ידני את מיקום האלקטרודה מהקצה העליון.
- הלחמה סיכת זהב לטרמינל המיקרואלקטרודה.
- הוסף דבק אפוקסי בין סיכת הזהב לבין חזיות העליון כדי לצרף את המיקרואלקטרודה אל חזיות.
- . לבטל את הגשוש בתוך צינורית לוודא באופן חזותי כי המיקרואלקטרודה הוא הוכנס לגמרי לתוך הצינורית.
3. הקמת מעגל מיקרופלואידיג (איור 2)
- הניחו קרש הלחם על משטח יציב. הניחו את השסתומים ה2 3 בצורה מקבילה לצדדים הארוכים ביותר של קרש הלחם, כ-6 מטרים בנפרד עם יציאה אחת (האחת שתמיד פתוחה) הניצבת מול זו. השתמש בברגים כדי לתקן את השסתומים לקרש הלחם.
- מניחים סרגל ליד השסתומים (כדי למדוד ולעקוב אחר תנועת נוזלים בתוך צינורות קפילר).
- לטעון תערובת של 1:1 שמן צמיגות נמוכה וצביעת מזון (סמן) לתוך מזרק הגתוח ומקום במשאבה סמן. חותכים חתיכת צינורות קפילר, ומשתמשים בסרגלים סטנדרטיים ובמחברי Luer-lock כדי לחבר את המזרק לאחת היציאות בשסתום הקלט. . זה קו הסימון
- חותכים חלק קצר של צינורות קפילר עבור "קו הסרגל". השתמש בכללים סטנדרטיים כדי להדק את היציאות הניצבות בפני השסתומים.
- חותכים שתי פיסות של צינורות קפילר כדי לחבר את שסתום פלט כדי microinjectrode, וכדי לחבר את משאבת התרופה לשסתום הקלט (השימוש ferrules רגיל).
הערה: אורך שתי השורות האלה תלוי בכיוונון הניסיוני, צריך להיות מספיק זמן כדי להגיע ממנגנון האינפוזיה לבעל החיים, והשני ממשאבת הסמים לשסתום הקלט. השתמש אבן לעזוב כדי לחתוך את אבובים קפילר.
4. הרכבה המיקרו-הזרקה למיקרו-כונן (איור 3)
- ודאו שמכשיר הבדיקה המיקרואלקטרודה/ניסיוני מתבצע בצינורית לפני ההרכבה.
הערה: השפופרת מדריך צריך להיות בעמדה microdrive. - חבר מתאם המותאם בהתאמה אישית למיקרו-האינפקייד.
- למעלה לטעון את microinjectrode דרך שפופרת המדריך ולאבטח אותו למתאם באמצעות ברגים.
- למדוד את מיקום המיקרו-כונן (עומק) שבו microinjectrode בולט מתוך השפופרת מדריך, ואז למשוך אותו ~ 1 ס מ כדי להתכונן להוספה.
- לניסויים במיקרואינפוזיה, יש לחבר את "קו המוח" לפתיחת ה-T בצומת המיקרו-שימוש של הmicroinjectrode. השתמש בכלל בסיסי והדק אותו במפתח הברגים.
5. שטיפה והכנת מערכת מיקרופלואידיג
- הצב את המיקרו-כונן עם המיקרו-הזרקה מעל גביע פסולת.
- טען כלורהקאינין (למשל, nolvasan; הומס 20 g/L) לתוך מזרק 1 mL ומניחים אותו במשאבה התרופה. להפוך את כיוון הזרימה של השסתומים כגון נוזל הולך משאבת התרופה דרך השסתום לקו שסתום את "קו המוח".
- ריקון המעגל עם כלורהקאיטין באמצעות שיעור זרימה נמוך (50-200 μL/min) למינימום של 10 דקות. חזור על שלבים 5.2 דרך 5.3 עם תמיסת מלח סטרילית ולאחר מכן אוויר.
הערה: חשוב לבדוק אם יש דליפות בשלב זה. החילו בעדינות מגבונים ללא סיבים בצמתים כדי לסייע בחשיפת דליפות נוזלים באמצעות הסרגלים. - לטעון את הסם 500 μL מזרק צר, לדחוס את האוויר ולאחר מכן למקם את המשאבה תרופה. זרימה ב-50 μL/min עד שמספר טיפות זורמות מהמיקרו-מטרודה.
- להשרות את צינור מדריך ב כלורהקאדנין (מומס 20 g/L) עבור 15 דקות.
- להפוך את הכיוון של שסתום פלט לכיוון "קו הריקון". מראש את משאבת סמן עד קצה ברור של צבע ושמן נצפתה על קו הסרגל. ודא שתמיד יש נפט בין התרופה לצבע כדי לא לערבב את שני חומרים מסיסים במים ולאבד את הקצה החד ביניהם. סמן את המיקום ההתחלתי של קו השמן/צבע הזה (עם חתיכת סרט או סמן).
- הפוך את הכיוון של שסתום פלט לכיוון קו המוח.
6. ביצוע הקלטה או ניסוי אינפוזיה
הערה: שלבי הטיפול בבעלי חיים ישתנו בהתאם למעבדה ולהתנסות. את הצעדים הבאים יש לבצע לאחר להגדיר את הניתוח הנדרש ההכנה לחשוף את הדורה. בעקבות הניסוי, יש לבצע את כל הצעדים הדרושים לאחר ההליך בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על-ידי המכון.
- חברו את המיקרו-כונן לתא ההקלטה. הורידו את צינור ההנחיה כדי לחדור את הדורא.
הערה: הצינור המנחה לא צריך לחדור רחוק יותר מדורא כדי למנוע פגיעה בקליפת המוח. - הנמך את המיקרו-הזרקה עד כ -2 מ"מ מעל האתר להקלטה/הזרקה במוח.
- הדק את החלק העליון (מיקרואלקטרודה בולטת/biosensor) וחבר את סיכות הזהב למערכת ההקלטה. . תמשיך לקדם את המיקרואינפקדה לאתר המטרה
הערה: זכור לכלול את המרחק שהמיקרואלקטרודה משתרעת מעבר לצינורית בחישובים. - עבור ניסויים אינפוזיה, להשתמש במשאבה מיקרומזרק ידני כדי להזיז את העמודה של שמן על ידי 1 ס מ כל 3 דקות (~ 60 nL/min). לאחר הכרך הרצוי היתה החדרת, להחליף את שסתום פלט לכיוון קו הריקון.
הערה: אמצעי האחסון יהיה משתנה בהתאם למין הדגם ולאזור המוח המיועד. קצב זרימה מהיר עלול לגרום נזק לרקמות העצביות. - כאשר הניסויים הושלמו, למשוך את המיקרו הזרקה בתוך צינור המדריך (להשאיר את בליטה החללית). לאחר מכן הסר את המיקרו-כונן עבור שטיפה. ריקון מערכת microflu, כמתואר בשלבים 5.1-5.5. כדי להתכונן לשימוש חוזר.
הערה: בניסיון שלנו, המיקרו-הזרקה יימשך עבור מספר שימושים אם הטיפול הנכון נלקח. הקלטה אלקטרופיזיולוגית באיכות טיפות מהר יותר מהיכולת של הזרקה.
Representative Results
ביצעת הזרקה של אגוניסט GABAa (מוסקימול) עבור הפעלה הפיכה של שדה העין הקדמית (FEF), בעוד בעלי החיים ביצע זיכרון מונחה משימה מודרכת11. במשימה זו, מוצג בעלי החיים את התיקונים ומטרה חזותית היקפית. החיה שומרת על הקיבעון בזמן שנזכר במיקום המטרה, וברגע שנקודת הקיבוע נעלמת, מבצעת תנועת עיניים מחפירה למיקום הנזכר כדי לקבל תגמול. המיקרואינפקדה נבנה בהתאם להוראות באיור 1ב. נפח העירוי לניסוי הדוגמה היה 850 nL. ביצועים התנהגותיים על משימת הזיכרון (MGS) מונחה במיקומים שונים ובזמנים יחסית לעירוי מוסקימול מוצג באיור 4. ביצועי הביצועים הגדולים ביותר נצפו ב -2 עד 3 שעות לאחר העירוי.
איור 1: צעד אחר צעד הייצור של microinjectrode. (א) קביעת תצורה לשימוש בלתי תלוי במערכת מיקרופלואידיג. צינורית ובדיקה נמדדים על מנת לוודא כי הקצה של החללית יכול להיות בליטה באורך הרצוי (למשל, 150 μm). . המקדח טעון לתוך הצינורית הצינורית עוברת דרך צומת ה-T ומצורפת בחלק התחתון, עם הקצה השטוח באמצע צומת ה-T; החלק האחורי של המקדח ממשיך דרך החלק העליון. המיקרו-הזרקה מתבצע על ידי הלחמה סיכות זהב על כל מסופי בדיקה והוספת דבק ביניהם לבין חזיות העליון ליציבות. הקשר למערכת הרכישה תלוי בעיצוב של הגשוש. בדוגמה זו, הגשוש שלנו הוא ננו-חיישן עם שלושה כיוונים. (ב) הגדרה לשימוש עם מערכת microfluidic. כדי לזוג את המיקרו-הזרקה למערכת מיקרופלואידיג, פיסת צינורות קפילר משמשת לצידו העליון של צומת T. הגשוש יכול להיות מלפנים או מאחור טעון. לאחר מכן, הקו המיקרו-פלואידיסי מחובר לפתח ה-T-ג'אנקשן השלישי. בדוגמה זו השתמשנו במיקרואלקטרודה. ראה תמונה מוגדלת של הקצה של צינורית שבה המיקרואלקטרודה בולטת על ידי הידוק העליון בולט. עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של פריטים המשמשים בבנייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערכת מיקרופלואידיג. תצורת שני שסתומים מאפשר שליטה של כיוון הזרימה לכיוון microinjectrode או לכיוון קו הריקון לפתרון בעיות. המעגל מסתמך על שני שסתומים 3-port המחוברים באמצעות צינורות קפילר ו ferrules סטנדרטי. מזרקים גדוקים משמשים לנשיאת והזרקת סם האינפוזיה והסמן. משאבת מזרק לתכנות מאפשר ריקון אוטומטי של המערכת וטעינת התרופה. משאבת מיקרו-מזרק ידנית מאפשרת הזרקה והדמיה מבוקרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הרכבה של microinjectrode למיקרו כונן הידראולי עם קיבולת ההזרקה. שלב 4.1: מתאם מותאם אישית מאפשר חיבור של המיקרו-הזרקה למיקרו-כונן. בורג אחד מצרף את המתאם למיקרו-כונן; שני ברגים מאובטחים מיקרואינפלייד למתאם. חזיות העליון צריך להיות בלתי נדפקה לפחות 2 הפניות כדי להגן על הקצה של מיקרואלקטרודה/ניסוי ניסיוני בעת טעינת microinjectrode בשפופרת המדריך של microelectrode. שלב 4.3: הוספת microinjectrode לתוך שפופרת מדריך מלמעלה. שלב 4.4: אם ביצוע מיקרואינפוזיה, חבר את קו התרופה לפתיחת הצומת T השלישי באמצעות שלטון פלסטיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הזיכרון המודרך משימה במהלך עירוי מוסמול ב FEF. (א) הmicroinjectrode הוצב באונה הימנית, אזור fef. (ב) ביצוע התנהגותי במהלך משימה MGS שבה שמונה מטרות ממוקמות מעניינת. רצנו 4 בלוקים של המשימה MGS, לפני ובתוך שלוש פעמים לאחר ההזרקה. העלילה הקוטב מראה ביצועים (אקסצנטריות) בכל אחת מהפעמים האלה (צבע), עבור מיקומים שונים ביחס לנקודת הקיבוע (זווית על העלילה הקוטב). ביצועים הצטמצמה באופן ברור בתוך שדה האונה השמאלי 2 h לאחר ההזרקה (סימן כחול, מחצית שמאל של העלילה קוטבי). (ג) שאריות עקבות של 8 מיקומי זיכרון היקפי לפני (משמאל) ואחרי הזרקת מוסמול ב-fef (ימין, 1 ו-3 h אחרי אינפוזיה). הדיוק saccade בשדה ויזואלי השמאלי (חצי השמאלי של מגרשים קוטבי) ירד לאחר הזרקת מוסקימול. קנה מידה במעלות של זווית חזותית (dva). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מספר שיטות הינן זמינות כעת לביצוע מסירת תרופות בו, אלקטרופיזיולוגיה. המערכת שלנו מיועדת לקבל את הגמישות לשמש הקלטות או באופן עצמאי או בשילוב עם הזרקת סמים, ולקבל את היכולת למקום בדיוק כל בדיקה ניסיונית שברירית, כגון ננוחיישן או מיקרואלקטרודה, מוגן מכל נזק, דרך מאטר דורא רקמה עצבית. המערכת מאפשרת שליטה מדויקת באמצעי העירוי של הסמים בעין בולטת (17 בדיוק המוצג במחקרים קודמים במעבדה3).
יש מערכות מיוחדות יותר להזרקת לחץ עם קטרים קטנים יותר12. מערכות אלה מאפשרות מספר אתרי הקלטה, אך ההתקנה המורכבת של התוכנה והחומרה הנדרשת לשליטה במערכת מבצעת עלויות גבוהות יותר עבור כל אחד מהרכיבים, והיא בעלת גמישות פחותה לממשק עם הבדיקות הנסיוניות שעדיין לא ממוסחר בקנה מידה גדול. יתר על כן, הinjectrode שלנו אינו דורש שתל כרוני ומספק מידה רבה של גמישות: תואם עם חיישנים ביולוגיים למדוד אותות כימיים ואלקטרולוגיים, ומסוגל לספק תרופות גם, עם הפוטנציאל למדוד את ההשפעה של התרופה מקומי חליטות על תגובות אלה.
העיצוב מאפשר למכשיר הניסיוני להיות בליטה לאחר חדירת דורא כדי למנוע נזק למבנה הגשוש. תכונה זו מאפשרת ריבוי פונקציונליות של המכשיר, כדי לחדור את הדורה מבלי לסכן נזק של כל מכשיר ניסיוני כגון ננומטר בקנה מידה של ננו10. עם זאת, יש הגבלה של אורך זה יכול להיות בולט, מוגבל על ידי מספר תורות של ferrule, מוגבל ~ 1 מ"מ עבור ferrule סטנדרטי. יש נזק רקמות מינימלי בשל בקוטר קטן של צינורית (228 μm).
בניסוי שראינו, המערכת שימש לביצוע מסירה מבוקרת של מוסמול עבור הפעלה הפיכה של FEF, בו זמנית עם גירוי חשמלי או הקלטה מסירה (תא עצב יחיד, פוטנציאל שדה מקומי) באמצעות מיקרואלקטרודה. הניסוי הזה ב-FEF דורש מיקרוגירוי של FEF כדי לאשר וקטורים מסוימים לפני ההפעלה, והתרופה היתה מוחדרת ללמוד זיכרון עבודה במהלך ההפעלה הפיכה של FEF. לא סביר כי הקלטה מאותו תא העצב בודד ניתן לשמור לפני ואחרי הזרקת התרופה; עם זאת, הצלחנו להקליט פוטנציאל השדה המקומי לפני ואחרי אינפוזיה. כאן, אנו מציגים ניסוי המשלב הזרקה, הקלטה, וגירוי חשמלי.
ברגע שהיא מוגדרת, השיטה היא מאוד אמינה ואיתנה. עם זאת, בשל משקעים של מולקולות קטנות (למשל, מלח) בתוך צינור קטן ונמלים, שטיפה יסודית נדרש לאחר כל ניסוי כדי לשמור על מיקרופלואידיקה ללא חסימות ודליפות. בשל הפשטות של המעגל כולו, ניתן להחליף כל אחד מהרכיבים באופן עצמאי לפתרון בעיות בקלות.
למרות שהשיטה הוכיחה באזור FEF בפרימטים לא אנושיים, העיקרון יכול להיות מיושם על כל אזור מוח אחר שבו יש שילוב של גירוי חשמלי, הקלטה, הזרקת סמים רצוי, במינים של גודל מכרסם או גדול יותר.
Disclosures
לא.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון המכון הלאומי לבריאות (NIH), מענקים EY026924 ו EY014800 (כדי B.N.), מענק בלתי מוגבל מן המחקר כדי למנוע עיוורון, Inc., ניו יורק, NY למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה, אוניברסיטת של יוטה, וכספי הסטארט-up שסופקו ל-R.E. על ידי בית הספר הנרי סמואלי להנדסה והמחלקה להנדסת חשמל באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. שיטה זו מבוססת על דו ח קודם של שיטה דומה שפותחה במעבדה של ד ר טירין מור, שפורסם ב Noudoost & מור 2011, היומן של שיטות מדעי המוח. המחברים מודים לד ר קלסי קלארק על הערותיו בכתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson's disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
