Summary
我们提出了一个显微注射系统，用于电生理学和辅助交付实验探头（即纳米传感器，微电极），可选配药物输注。广泛可用的微流体成分与包含探头的导管耦合。包括一个微注射的分步协议，在猴皮层中注入木糖醇时的结果。
Abstract
这种显微注射系统设计用于药物输注、电生理学以及实验探头（如微电极和纳米传感器）的输送和检索，经过优化，可在清醒、有行为的动物中重复使用。显微注射系统可配置为多种用途：（1） 管路的简单排列，用于放置实验探头，否则该探头太脆弱，无法穿透杜拉母体;（2） 药物的微流体注入，或者独立或耦合到包含实验探头（即微电极、纳米传感器）的导管上。在该协议中，我们解释了微喷剂的逐步构造、微流体成分的耦合以及系统在体内的使用方案。该系统的微流体组件允许在纳米升尺度上输送体积，渗透伤害最小。药物输注可以独立进行，也可以与实验探针同时进行，如在醒着、行为动物中的微电极或纳米传感器。该系统的应用范围从测量药物对皮质电活动和行为的影响，到根据探头或纳米传感器测量在行为表现中了解特定皮层区域的功能。为了演示该系统的一些功能，我们提供了一个在工作记忆任务期间为恒河猴前眼场（FEF）可逆失活而输液的粘液输液的例子。
Introduction
电生理学和药物注射方法在神经科学中广泛用于研究神经元活动和行为，在体内，在啮齿动物和灵长类动物中。在过去的三十年里，早期注射模型的改进使得一种更精确和侵入性更少的技术，同时在特定的大脑部位1，2，3同时记录和药物注射。尤其对于灵长类动物来说，如果这项技术用于研究需要训练有素的动物的高级认知功能，则精确提供小体积且组织损伤最小的能力至关重要。最近的进展包括慢性电生理和化学测量结合刺激使用植入探针4，和联合记录和微流体药物交付最近在啮齿动物5试验。这里描述的注射系统允许电生理记录，刺激和精确的药物输送，并已成功地在多个灵长类实验室6，7，8。
具有神经科学应用的精密专用传感器（如纳米传感器9、10）的可得性日益普及，需要一种可靠的方法，在不损坏脆弱的纳米级器件或微电极尖端的情况下，使探测器通过杜拉体。
我们设计了一个显微注入系统，克服了使用现成的低成本组件组合这些方法的技术挑战，并便于实现两个主要功能：（一） 能够放置脆弱的实验探头，例如微电极或纳米传感器，通过杜拉母体和神经组织，防止任何损坏。此功能允许将实验探针放置在目标位置，通过使用导管作为穿过神经组织的指南来传递。（二） 使用微电极进行电生理记录和电刺激与药物注射相结合的实验的能力。
我们的系统使用导管穿透杜拉，以及一个管状功能，用于药物输送（当使用系统进行微输液）和提供额外的保护微电极或纳米传感器（当通过杜拉和神经组织）。该系统易于构建，具有广泛的商业可用组件，价格低廉且易于查找。我们使用小直径的导管（外径 OD = 235 μm，内径 ID = 108 μm），将穿透损伤降至最低。
在这里，我们提出了微喷液结构及微流体系统的配置的分步说明。我们解释使用微注射所需的步骤，无论是独立或耦合到药物注射的微流体系统。类似的方法可以应用于任何脆弱的实验探头，如纳米传感器9，10。探头可以正面或背面加载到管中（取决于设计），在穿透杜拉和神经组织时可防止损坏。我们提供来自非人类灵长类动物体内实验的示例数据，其中我们使用钨微电极进行电刺激，随后在前眼场（FEF）中注射粘膜醇，而动物则执行记忆引导囊（MGS）任务。
Protocol
实验程序遵循了《国家卫生研究院关于护理和使用实验室动物的指南》和神经科学指南和政策协会。实验和行为程序协议由犹他大学动物护理和使用委员会批准。
1. 用于刺激和记录的显微注射剂的构造 （图 1a）
- 测量导管和探头的长度（在此示例中为纳米传感器）。探头的长度必须比从导管尖伸出的长度（取决于探头设计）加约 2 厘米。
- 在放大镜或显微镜下（+10倍放大倍率），将探头装入导管中;如果可能，最好进行回载以保护探头尖端。
注：手动执行此步骤具有挑战性。建议在尝试使用实际实验探头之前，先在放大镜下用微电极进行练习。 -
将管圈（包含探头）穿过顶部套圈、T 型结和底部套圈。
- 如果探头只是一根没有附件的单根导线，则将其回装到卡内，然后将组件从底部套圈插入 T 型接头中。套管顶部（平端侧）应位于 T 型接头的中间，底部，而不是顶部套圈内。实验探头或生物传感器应突出于顶部套圈的顶部。
注：定制套圈也可以通过在用微型钻头在套圈塞上钻一个孔来制造，孔的大小取决于将管扣拧紧到 T 型结块所需的直径。
- 如果探头只是一根没有附件的单根导线，则将其回装到卡内，然后将组件从底部套圈插入 T 型接头中。套管顶部（平端侧）应位于 T 型接头的中间，底部，而不是顶部套圈内。实验探头或生物传感器应突出于顶部套圈的顶部。
- 使用套圈扳手拧紧 T 型接头顶部和底部的套圈。不要过度拧紧。可以添加一小块油管，以加强顶部套圈内的电极支撑。
- 根据探头的规格，将金针焊接到每个探头端子（信号、接地等）。
- 调整探头和导管的相对位置。测量探头在放大倍率下从导管突出的距离，并从顶部手动调整（探头可以在套圈内自由滑动）。
- 在金针和顶部套圈之间添加环氧胶，将探头连接到套圈。
- 拧下顶部套圈以缩回导管内的探头。目视确认探头在放大倍率下完全在导管内。
- 将喷油器连接到微驱。
2. 药物输液的显微注射剂的建造（图1b）
- 使用套管将管的"非下角"或平端连接到 T 型结体的底部。使用套圈扳手拧紧套圈。
- 通过标准套圈，将一小块毛细管（±1.5 厘米）连接到 T 结的顶部。用套圈扳手拧紧。
- 通过毛细管、T 结、管和相应的套管回载微电极。
- 确保电极的后端从毛细管背面突出不到 1 厘米，电极尖端从导管伸出，底部达到所需距离。电极位置可以从顶部手动调整。
- 将金针焊接到微电极端子上。
- 在金销和顶部套圈之间添加环氧胶，将微电极连接到套圈。
- 拧下顶部套圈以缩回导管内的探头。目视确认微电极已完全缩回导管。
3. 微流体电路的构造 （图 2）
- 将面包板放在稳定的表面上。将两个三向阀平行于面包板最长两侧，约 6 in，一个端口（始终打开的）彼此朝向。使用螺钉将阀门固定到面包板上。
- 在阀门旁边放置一把尺子（测量和跟踪毛细管内液体的运动）。
- 将 1：1 低粘度油和食品着色（标记）的混合物装入气密注射器，并放入标记泵中。切割一根毛细管，并使用标准套管和 Luer 锁接头将注射器连接到输入阀上的一个端口。这是"标记线"。
- 为"标尺线"剪一小段毛细管。使用标准套圈拧紧到阀门的朝向端口。
- 切割两根较长的毛细管，将输出阀连接到显微注射器，并将药物泵连接到输入阀（使用标准套圈）。
注：这两条线路的长度取决于实验设置，一条必须足够长，才能从输注装置到达动物，另一条从药物泵到达输入阀。使用切块石切割毛细管。
4. 将微喷器安装到微驱上（图3）
- 在安装之前，请确保微电极/实验探头缩回导管中。
注：导管应位于微驱中。 - 将定制的适配器连接到显微注射器上。
- 将微喷器顶入导管，并用螺钉将其固定到适配器上。
- 测量微驱位置（深度），使微喷剂从导管中突出，然后缩回±1厘米，准备插入。
- 对于微输液实验，将"脑线"连接到显微注射液未使用的 T 结开口。使用标准套圈，用套圈扳手拧紧。
5. 微流体系统的冲洗与制备
- 将微驱与微喷器放在废烧杯上。
- 将氯西丁（例如，诺尔瓦桑;溶解在20克/升）装入1mL气密注射器中，并将其放入药物泵中。转动阀门的流动方向，使液体从药物泵通过阀流向阀管路，并流出"脑管"。
- 使用低流量（50-200 μL/min）冲洗电路至少10分钟。
注：在此阶段检查泄漏非常重要。在接头处轻轻涂抹无绒湿巾，以帮助揭示通过套圈的任何液体泄漏。 - 将药物装入 500 μL 气密注射器中，压缩空气，然后放入药物泵中。以50μL/min流动，直到从微注射液中滴下几滴。
- 将导管浸泡在氯西丁中（溶解在20克/升）15分钟。
- 将输出阀的方向转向"冲洗管路"。前进标记泵，直到在标尺线上观察到明显的颜色和机油边缘。确保药物和颜色之间始终有油，以免混合两种水溶性材料，失去它们之间的锋利边缘。标记此油/染料线的起始位置（用一块胶带或标记）。
- 将输出阀的方向转向脑线。
6. 执行录音或输液实验
注：动物处理步骤因实验室和实验而异。以下步骤将在必要的手术设置和准备后执行，以暴露杜拉。试验结束后，必须按照机构批准的协议执行所有必要的程序后步骤。
- 将微驱连接到录音室。放下导管穿透杜拉。
注：引导管不应穿透任何比杜拉更远，以避免损坏皮层。 - 将显微注射液降至约2毫米以上的部位，以记录/注射在大脑中。
- 拧紧顶部套圈（突出的微电极/生物传感器），并将金针连接到记录系统。继续推进显微注射到目标部位。
注：请记住在计算中包括微电极超出导管的距离。 - 对于输注实验，使用手动微注射器泵每 3 分钟移动油柱 1 厘米（±60 nL/min）。注入所需体积后，将输出阀切换到冲洗管路。
注：注入的体积会因模型物种和目标大脑区域而异。更快的流速可能会损害神经组织。 - 实验完成后，缩回导管内的显微注射剂（使探头伸出）。然后拆下微驱进行冲洗。如步骤 5.1-5.5 所述，冲洗微流体系统。准备重用。
注：根据我们的经验，如果采取适当的护理，微注射将持续几个用途。电生理记录质量下降快于注射能力。
Representative Results
我们注射了GABAa激动剂（粘液），用于前眼场（FEF）的可逆失活，而动物则执行记忆引导的囊虫任务11。在这项任务中，提出了动物固定和外围视觉目标。动物在记住目标位置时保持固定，一旦固定点消失，就会对记忆的位置执行一个saccadic眼睛运动，以获得奖励。显微注射剂是按照图1b中的说明建造的。该示例实验的输注量为 850 nL。与粘液输液相关的不同位置和时间，记忆引导囊（MGS）任务的行为表现如图4所示。输液后2至3小时观察到最大的性能缺陷。
图1：一步一步地制造显微注射。（a） 配置，适用于独立于微流体系统的配置.测量环状和探头，以确认探头尖端可以以所需长度（例如 150 μm）突出。探头正面装载到套管中。管状通过 T 型结，并附在底部，平端位于 T 型结的中间;探头的后端通过顶部套圈继续。显微注射通过在每个探头端子上焊接金针，并在它们和顶部套圈之间添加胶水来稳定。与采集系统的连接取决于探头的设计。在此示例中，我们的探头是具有三引线的纳米传感器。（b） 用于微流体系统的配置。为了将显微注射液与微流体系统耦合，T 结的顶部使用一块毛细管。探头可以正面或背面加载。然后，微流体管路插入第三个 T 形接头开口。在此示例中，我们使用微电极。查看通过拧紧顶部套圈突出微电极的圆管尖端的缩放图片。有关施工中使用的物料列表，请参阅物料表。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：微流体系统。双阀配置允许控制流向显微喷油或冲洗管路的流量方向，以便进行故障排除。该电路依靠两个使用毛细管和标准套管连接的 3 端口阀。气密注射器用于携带和注射输液药物和标记物。可编程注射器泵允许自动冲洗系统和装载药物。手动微注射器泵允许控制喷射和可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：将显微注射剂安装到具有或无喷射能力的液压微驱上。步骤 4.1： 定制适配器允许将微喷剂连接到微驱。单个螺钉将适配器连接到微驱动器;两个螺钉将微喷器固定到适配器上。顶部套圈应拧下至少 2 圈，以便在微驱导管中装载微喷剂时保护微电极/实验探头的尖端。步骤4.3：从顶部将显微注射剂插入导管中。步骤 4.4：如果执行微输液，请使用塑料套管将药物线插入第三个 T 形结开口。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在FEF中注入粘液液期间，记忆引导囊虫任务。（a） 微注射剂被放置在右半球，FEF区域。（b） MGS 任务期间的行为表现，其中八个目标被放置在外围。我们运行了4个块的MGS任务，注射之前和之后三次。极坐标图显示相对于固定点（极图上的角度）不同位置的性能（偏心度）。注射后2小时左视半场的性能明显下降（蓝色痕迹，极图左半部分）。（c） 在FEF（右侧、输注后1小时和3小时）注射粘液之前（左）和之后，对8个外设存储器位置的Saccade跟踪。注入粘液后，左视半场（极图左半部）的萨克卡精度降低。以视角 （dva） 度缩放。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
目前有几种方法可用于同时进行药物输送和电生理学。我们的系统旨在具有独立或与药物注射相结合进行录音的灵活性，并能够通过 dura 母体和神经组织精确放置任何脆弱的实验探头，如纳米传感器或微电极，防止任何损坏。该系统允许用肉眼精确控制药物输注量（17 nL 精度，如我们实验室3中先前的研究所示）。
有更专门的系统压力注入较小的直径12。这些系统允许多个录制站点，但控制系统所需的软件和硬件的复杂设置为每个组件带来了更高的成本，并且与尚未大规模商业化的实验探头接口的灵活性较低。此外，我们的注射剂不需要慢性植入物，并提供很大的灵活性：与生物传感器兼容，以测量化学和电生理信号，并能够注入药物，以及有可能测量局部药物输注对这些反应的影响。
该设计允许实验探头在杜拉穿透后突出，以避免损坏探头的结构。此功能允许设备的多功能性，穿透杜拉，而不会有损坏任何实验探头的风险，如纳米级纳米传感器10。但是，有一个长度的限制，可以突出，限制圈的圈数，限于±1毫米的标准套圈。由于小管状直径（228 μm），组织损伤最小。
在实验中，我们展示，该系统用于执行控制性细胞的传递，以可逆的FEF失活，同时与电刺激或细胞外记录（单个神经元，局部场势）使用微 电极。在FEF的这个实验要求对FEF进行微刺激，以确认失活前的囊肿载体，并且药物被注入来研究可逆FEF失活期间的工作记忆。在药物注射前后，不可能保持来自同一分离的单神经元的记录;然而，我们能够在输液前后记录当地的现场潜力。在这里，我们展示了一个结合注射、记录和电刺激的实验。
一旦设置，该方法是非常可靠和可靠的。然而，由于小管和端口内小分子（如盐）的沉淀，每次实验后需要彻底冲洗，以保持微流体无障碍物和泄漏。由于整个电路简单，每个组件都可以独立更换，以便进行故障排除。
虽然该方法在非人类灵长类动物的FEF区域得到证明，但该原理可以应用于任何其他需要电刺激、记录和药物注射组合的脑区，在啮齿动物大小或更大的物种中。
Disclosures
没有。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院（NIH）的资助，向纽约大学眼科和视觉科学系提供EY026924和EY014800（资助B.N.），这是一项来自研究预防失明的无限制赠款。犹他州，以及亨利·萨缪里工程学院和加州大学欧文分校电气工程系向R.E.提供的启动资金。这种方法基于蒂林·摩尔博士实验室开发的类似方法的先前报告，发表在《2011年神经科学方法杂志》上。作者感谢凯尔西·克拉克博士对手稿的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
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