Summary
Wir präsentieren ein Mikroinjektionssystem für die Elektrophysiologie und die unterstützte Lieferung von experimentellen Sonden (d. h. Nanosensoren, Mikroelektroden) mit optionaler Medikamenteninfusion. Weit verbreitete mikrofluidische Komponenten sind mit einer Kanüle gekoppelt, die die Sonde enthält. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Mikroinjektionskonstruktion ist enthalten, mit Ergebnissen während der Muscimol-Infusion in Makaken-Kortex.
Abstract
Dieses Mikroinjektionssystem ist für die Arzneimittelinfusion, Elektrophysiologie sowie die Abgabe und Dasabfuhr von experimentellen Sonden wie Mikroelektroden und Nanosensoren konzipiert, die für den wiederholten Einsatz bei wachen, verhaltenserhaltenden Tieren optimiert sind. Das Mikroinjektionssystem kann für mehrere Zwecke konfiguriert werden: (1) einfache Anordnung der Kanüle für die Platzierung einer experimentellen Sonde, die sonst zu zerbrechlich wäre, um in die Dura mater einzudringen, (2) mikrofluidische Infusion eines Arzneimittels, entweder unabhängig oder gekoppelt mit einer Kanüle, die eine experimentelle Sonde (d. h. Mikroelektrode, Nanosensor) enthält. In diesem Protokoll erklären wir die Schritt-für-Schritt-Konstruktion der Mikroinjektion, ihre Kopplung an mikrofluidische Komponenten und das Protokoll für die Verwendung des Systems in vivo. Die mikrofluidischen Komponenten dieses Systems ermöglichen die Abgabe von Volumen im Nanoliter-Maßstab mit minimalen Penetrationsschäden. Die Arzneimittelinfusion kann unabhängig oder gleichzeitig mit experimentellen Sonden wie Mikroelektroden oder Nanosensoren in einem wachen, sich verhaltenden Tier durchgeführt werden. Die Anwendungen dieses Systems reichen von der Messung der Auswirkungen eines Medikaments auf die kortikale elektrische Aktivität und das Verhalten bis hin zum Verständnis der Funktion einer bestimmten Kortexregion im Kontext der Verhaltensleistung auf Deronson- oder Nanosensormessungen. Um einige der Fähigkeiten dieses Systems zu demonstrieren, präsentieren wir ein Beispiel für Muscimol-Infusion zur reversiblen Inaktivierung des frontalen Augenfeldes (FEF) in rhesus makaken während einer Arbeitsgedächtnisaufgabe.
Introduction
Elektrophysiologie und Arzneimittelinjektionsmethoden werden in der Neurowissenschaft häufig verwendet, um neuronale Aktivität und Verhalten in vivo bei Nagetieren und Primaten zu untersuchen. In den letzten drei Jahrzehnten ermöglichten Verbesserungen der frühen Injectrode-Modelle eine präzisere und weniger invasive Technik sowie gleichzeitige Aufzeichnung und Medikamenteninjektion an bestimmten Hirnstellen1,2,3. Insbesondere für Primaten ist die Fähigkeit, kleine Volumina mit minimalen Gewebeschäden präzise zu liefern, entscheidend, wenn die Technik für die Untersuchung fortgeschrittener kognitiver Funktionen eingesetzt werden soll, die gut ausgebildete Tiere erfordern. Jüngste Fortschritte umfassen chronische elektrophysiologische und chemische Messungen in Kombination mit Stimulation mit implantierten Sonden4, und kombinierte Aufzeichnung und mikrofluidische Medikamentenabgabe wurde vor kurzem bei Nagetieren5 pilotiert. Das hier beschriebene Injectrode-System ermöglicht elektrophysiologische Aufzeichnung, Stimulation und präzise Medikamentenabgabe und wurde bereits erfolgreich in mehreren Primatenlaboren6,7,8umgesetzt.
Die zunehmende Verfügbarkeit von empfindlichen, spezialisierten Sensoren, wie Nanosensoren9,10 mit neurowissenschaftlichen Anwendungen, erfordert eine zuverlässige Methode, um die Sonde durch die Dura mater zu bringen, ohne die fragilen Nano-Geräte oder Mikroelektrodenspitzen zu beschädigen.
Wir haben ein Mikroinjektionssystem entwickelt, das die technischen Herausforderungen der Kombination dieser Methoden mit leicht verfügbaren, kostengünstigen Komponenten überwindet und zwei Hauptfunktionen erleichtert: (i) Die Fähigkeit, eine zerbrechliche Versuchssonde, wie z. B. eine Mikroelektrode oder Nanosensor, durch die Dura mater und Neuronalgewebe, vor Schäden geschützt. Diese Funktionalität ermöglicht die Platzierung der experimentellen Sonde an zielgerichteten Stellen, die durch die Verwendung der Kanüle als Leitfaden durch das Neuralgewebe geliefert wird. ii) die Fähigkeit, eine Mikroelektrode zu verwenden, um Experimente durchzuführen, die elektrophysiologische Aufnahmen und elektrische Stimulation mit Einer Injektion von Medikamenten kombinieren.
Unser System verwendet ein Führungsrohr, um die Dura zu durchdringen, zusammen mit einer Kanüle, die sowohl für die Medikamentenabgabe (bei Verwendung des Systems für die Mikroinfusion) funktioniert und zusätzlichen Schutz für die Mikroelektrode oder den Nanosensor bietet (sowohl beim Durchlaufen der Dura als auch bei Neuronalgewebe). Dieses System kann einfach mit weithin handelsüblichen Komponenten konstruiert werden, die kostengünstig und leicht zu finden sind. Wir minimieren Penetrationsschäden durch Verwendung einer Kanüle mit kleinem Durchmesser (Außendurchmesser OD = 235 m, Innendurchmesser ID = 108 m).
Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Mikroinjektionskonstruktion und Konfiguration des mikrofluidischen Systems vor. Wir erklären die Schritte, die für die Verwendung der Mikroinjektion benötigt werden, entweder unabhängig oder gekoppelt mit dem mikrofluidischen System für die Arzneimittelinjektion. Ein ähnlicher Ansatz kann mit jeder fragilen experimentellen Sonde angewendet werden, wie z. B. einem Nanosensor9,10. Die Sonde kann (je nach Design) vor- oder rückbelastet in die Kanüle geladen werden und wird beim Eindringen in Dura und Nervengewebe vor Beschädigungen geschützt. Wir liefern Beispieldaten aus einem In-vivo-Experiment mit nicht-menschlichen Primaten, bei dem wir eine Wolfram-Mikroelektrode zur Durchführung elektrischer Stimulation verwendeten und anschließend Muscimol in das frontale Augenfeld (FEF) injizierten, während das Tier eine speichergeführte Saccade(MGS)-Aufgabe durchführte.
Protocol
Experimentelle Verfahren folgten dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und der Society for Neuroscience Guidelines and Policies. Protokolle für experimentelle und verhaltensbezogene Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Utah genehmigt.
1. Bau der Microinjectrode zur Stimulation und Aufzeichnung (Abbildung 1a)
- Messen Sie die Länge der Kanüle und der Sonde (in diesem Beispiel ein Nanosensor). Die Sonde muss um die Länge, die sie aus der Kanülenspitze (je nach Sondendesign) herausragen soll, länger sein als die Kanüle plus ca. 2 cm.
- Laden Sie die Sonde unter einer Lupe oder einem Mikroskop (ca. 10-fache Vergrößerung) in die Kanüle; wenn möglich, ist eine Rückladung vorzuziehen, um die Spitze der Sonde zu schützen.
HINWEIS: Dieser Schritt, der manuell ausgeführt wird, ist eine Herausforderung. Es wird empfohlen, mit einer Mikroelektrode unter einer Lupe zu üben, bevor Sie es mit einer tatsächlichen experimentellen Sonde versuchen. -
Passieren Sie die Kanüle (die die Sonde enthält) durch die obere Ferrule, T-Kreuzung und untere Ferrule.
- Wenn es sich bei der Sonde nur um einen einzigen Draht ohne Befestigungen handelt, laden Sie sie wieder in die Kanüle und legen Sie die Baugruppe von der unteren Ferrule in die T-Verbindung ein. Die Oberseite der Kanüle (flache Seite) sollte in der Mitte der T-Kreuzung, innerhalb der Unterseite, aber nicht in der oberen Ferrule positioniert werden. Die versuchsssonde oder der Biosensor sollte über die Oberseite der oberen Ferrule ragen.
HINWEIS: Maßgeschneiderte Ferrules können auch durch Bohren eines Lochs in die Ferrule-Stecker mit Mikrobohrern hergestellt werden, wobei die Größe des Lochs auf dem Durchmesser basiert, der für das Anziehen der Kanüle an der T-Kreuzung benötigt wird.
- Wenn es sich bei der Sonde nur um einen einzigen Draht ohne Befestigungen handelt, laden Sie sie wieder in die Kanüle und legen Sie die Baugruppe von der unteren Ferrule in die T-Verbindung ein. Die Oberseite der Kanüle (flache Seite) sollte in der Mitte der T-Kreuzung, innerhalb der Unterseite, aber nicht in der oberen Ferrule positioniert werden. Die versuchsssonde oder der Biosensor sollte über die Oberseite der oberen Ferrule ragen.
- Verwenden Sie den Ferrule-Schraubenschlüssel, um die Ferrules an der Ober- und Unterseite der T-Kreuzung zu straffen. Nicht überziehen. Ein kleines Stück Schläuche kann hinzugefügt werden, um die Elektrodenunterstützung innerhalb der oberen Ferrule zu stärken.
- Lötgoldstifte an jeder der Sondenklemmen (Signal, Masse, etc.), entsprechend den Spezifikationen der Sonde.
- Passen Sie die relative Position von Sonde und Kanüle an. Messen Sie den Abstand, den die Sonde unter Vergrößerung aus der Kanüle herausragt, und passen Sie ihn manuell vom oberen Ende an (Sonde kann frei innerhalb von Ferrules gleiten).
- Fügen Sie Epoxidkleber zwischen den Goldstiften und der oberen Ferrule hinzu, um die Sonde an der Ferrule zu befestigen.
- Lösen Sie die obere Ferrule, um die Sonde in der Kanüle zurückzuziehen. Bestätigen Sie visuell, dass sich die Sonde vollständig innerhalb der Kanüle unter Vergrößerung befindet.
- Befestigen Sie die Injectrode am Microdrive.
2. Bau der Mikroinjektionsrode zur Arzneimittelinfusion (Abbildung 1b)
- Befestigen Sie das "nicht abgeschrägte" oder flache Ende der Kanüle mit einer Ferrule an der Unterseite der T-Kreuzung. Verwenden Sie den Ferrule-Schlüssel, um die Ferrule zu straffen.
- Befestigen Sie ein kleines Stück Kapillarschläuche (ca. 1,5 cm) an der Oberseite der T-Kreuzung, indem Sie es durch die Standardferrule passieren. Mit einem Ferrule-Schlüssel anziehen.
- Die Mikroelektrode durch kapillare Schläuche, T-Kreuzungen, Kanülen und entsprechende Ferrules zurückladen.
- Stellen Sie sicher, dass das Hinterende der Elektrode weniger als 1 cm von der Rückseite des Kapillarschlauchs ragt und die Spitze der Elektrode im gewünschten Abstand auf der Unterseite aus der Kanüle ragt. Die Elektrodenposition kann manuell vom oberen Ende aus eingestellt werden.
- Löten Sie einen Goldstift an die Mikroelektrodenklemme.
- Fügen Sie Epoxidkleber zwischen dem Goldstift und der oberen Ferrule hinzu, um die Mikroelektrode an der Ferrule zu befestigen.
- Lösen Sie die obere Ferrule, um die Sonde in der Kanüle zurückzuziehen. Bestätigen Sie visuell, dass die Mikroelektrode vollständig in die Kanüle eingezogen ist.
3. Bau des Mikrofluidischen Kreislaufs (Abbildung 2)
- Legen Sie ein Brotbrett auf eine stabile Oberfläche. Platzieren Sie die beiden Drei-Wege-Ventile parallel zu den längsten Seiten des Brotbretts, ca. 6 in. auseinander mit einem Port (der immer offen ist) einander gegenüber. Verwenden Sie Schrauben, um die Ventile an der Steckplatine zu befestigen.
- Legen Sie ein Lineal neben die Ventile (um die Bewegung von Flüssigkeiten im Kapillarrohr zu messen und zu verfolgen).
- Eine Mischung aus 1:1 Niedrigviskositätsöl und Lebensmittelfärbung (Marker) in die gasdichte Spritze geben und in die Markerpumpe geben. Schneiden Sie ein Stück Kapillarschläuche, und verwenden Sie Standard-Ferrules und Luer-Lock-Steckverbinder, um die Spritze an einen der Anschlüsse am Eingangsventil anzuschließen. Dies ist die "Markerlinie".
- Schneiden Sie ein kurzes Stück Kapillarschläuche für die "Lineallinie". Verwenden Sie Standard-Ferrules, um die verkleidungsöffnungen der Ventile zu straffen.
- Schneiden Sie zwei längere Kapillarschläuche, um das Ausgangsventil an die Mikroinjektionsrode anzuschließen und die Arzneimittelpumpe mit dem Eingangsventil zu verbinden (verwenden Sie Standard-Ferrules).
HINWEIS: Die Länge dieser beiden Linien hängt vom Versuchsaufbau ab, eine muss lang genug sein, um vom Infusionsapparat zum Tier zu gelangen, und die andere von der Medikamentenpumpe zum Eingangsventil. Verwenden Sie einen Kleben Stein, um die Kapillarschläuche zu schneiden.
4. Montage der Microinjectrode am Microdrive (Abbildung 3)
- Stellen Sie sicher, dass die Mikroelektroden-/Experimentalsonde vor der Montage in der Kanüle eingefahren wird.
HINWEIS: Das Führungsrohr sollte in Microdrive in Position sein. - Befestigen Sie einen maßgeschneiderten Adapter an der Microinjectrode.
- Laden Sie die Mikroinjektion durch das Führungsrohr und befestigen Sie sie mit Schrauben am Adapter.
- Messen Sie die Mikroantriebsposition (Tiefe), bei der die Mikroinjektionausragung aus dem Führungsrohr ragt, und ziehen Sie sie dann um 1 cm zurück, um sich auf das Einführen vorzubereiten.
- Für Mikroinfusionsexperimente verbinden Sie die "Gehirnlinie" mit der ungenutzten T-Kreuzungsöffnung der Mikroinjektion. Verwenden Sie eine Standard-Ferrule und ziehen Sie mit dem Ferrule-Schraubenschlüssel.
5. Spülen und Vorbereiten des Mikrofluidsystems
- Positionieren Sie den Mikroantrieb mit der Microinjectrode über einem Abfallbecher.
- Chlorhexidin (z.B. Nolvasan; bei 20 g/L gelöst) in die 1 ml gasdichte Spritze geben und in die Arzneimittelpumpe geben. Drehen Sie die Strömungsrichtung der Ventile so, dass Flüssigkeit von der Medikamentenpumpe durch das Ventil zur Ventilleitung und aus der "Gehirnleitung" fließt.
- Spülen Sie den Kreislauf mit Chlorhexidin mit einer niedrigen Durchflussrate (50-200 l/min) für mindestens 10 min. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis 5.3 mit steriler Salzsäure und dann Luft.
HINWEIS: Es ist wichtig, in dieser Phase auf Lecks zu überprüfen. Tragen Sie an den Kreuzungen vorsichtig fusselfreie Tücher auf, um Flüssigkeitslecks durch die Ferrules zu enthüllen. - Laden Sie das Medikament in die gasdichte Spritze von 500 l, komprimieren Sie die Luft und legen Sie es dann in die Arzneimittelpumpe. Durchfluss bei 50 l/min, bis ein paar Tropfen aus der Mikroinjektionsrode fließen.
- Das Führungsrohr in Chlorhexidin (bei 20 g/L gelöst) 15 min einweichen.
- Drehen Sie die Richtung des Ausgangsventils in Richtung der "Spülleitung". Fördern Sie die Markerpumpe, bis eine klare Kante von Farbe und Öl auf der Lineallinie beobachtet wird. Stellen Sie sicher, dass es immer Öl zwischen dem Medikament und der Farbe gibt, um die beiden wasserlöslichen Materialien nicht zu mischen und die scharfe Kante zwischen ihnen zu verlieren. Markieren Sie die Ausgangsposition dieser Öl-/Farbstofflinie (mit einem Stück Klebeband oder Marker).
- Drehen Sie die Richtung des Ausgangsventils in Richtung der Hirnlinie.
6. Durchführung von Aufnahmen oder einem Infusionsexperiment
HINWEIS: Die Schritte zur Handhabung von Tieren variieren je nach Labor und Experiment. Die folgenden Schritte sind durchzuführen, nachdem die notwendige chirurgische Einrichtung und Vorbereitung durchgeführt wurde, um die Dura zu belichten. Nach dem Versuch müssen alle erforderlichen Nachverfahrensschritte in Übereinstimmung mit institutionell zugelassenen Protokollen durchgeführt werden.
- Befestigen Sie den Microdrive an der Aufnahmekammer. Senken Sie das Führungsrohr, um die Dura zu durchdringen.
HINWEIS: Das Führungsrohr sollte nicht weiter als die Dura eindringen, um eine Beschädigung des Kortex zu vermeiden. - Senken Sie die Mikroinjektionrode auf ca. 2 mm über der Stelle für die Aufnahme/Injektion im Gehirn.
- Ziehen Sie die obere Ferrule (protrudierende Mikroelektrode/Biosensor) fest und schließen Sie die Goldstifte an das Aufnahmesystem an. Weiter bringen Sie die Mikroinjektion rode zum Zielort vor.
HINWEIS: Denken Sie daran, die Entfernung, die die Mikroelektrode über die Kanüle hinaus in die Berechnungen erstreckt, einzubeziehen. - Für Infusionsexperimente verwenden Sie die manuelle Mikrospritzenpumpe, um die Ölsäule alle 3 minuten um 1 cm zu bewegen( 60 nL/min). Sobald das gewünschte Volumen infundiert ist, schalten Sie das Ausgangsventil in Richtung der Spülleitung.
HINWEIS: Das infundierte Volumen variiert je nach Modellart und Zielbereich des Gehirns. Schnellere Durchflussraten können das Neuronalgewebe schädigen. - Wenn die Experimente abgeschlossen sind, ziehen Sie die Mikroinjektionsrode innerhalb des Führungsrohres zurück (lassen Sie die Sonde herausragend). Entfernen Sie dann den Microdrive zum Spülen. Spülen Sie das mikrofluidische System, wie in den Schritten 5.1-5.5 beschrieben. , um sich auf die Wiederverwendung vorzubereiten.
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung wird die Mikroinjektion für mehrere Anwendungen dauern, wenn die richtige Pflege getroffen wird. Die elektrophysiologische Aufnahmequalität sinkt schneller als die Injektionsfähigkeit.
Representative Results
Wir führten Injektion eines GABAa-Agonisten (Muscimol) zur reversiblen Inaktivierung des frontalen Augenfeldes (FEF) durch, während das Tier eine speichergeführte Saccade-Aufgabe11durchführte. Bei dieser Aufgabe werden die Tierfixate und ein peripheres visuelles Ziel dargestellt. Das Tier behält die Fixierung bei, während es sich an den Zielort erinnert, und sobald der Fixationspunkt verschwindet, führt es eine sakkadische Augenbewegung an den erinnerten Ort aus, um eine Belohnung zu erhalten. Die Mikroinjektion wurde gemäß den Anweisungen in Abbildung 1bgebaut. Das Infusionsvolumen für das Beispielexperiment betrug 850 nL. Die Verhaltensleistung bei der speichergesteuerten Saccade(MGS)-Aufgabe an verschiedenen Stellen und Zeiten relativ zur Muscimol-Infusion ist in Abbildung 4dargestellt. Die größten Leistungsdefizite wurden bei 2 bis 3 h nach der Infusion beobachtet.
Abbildung 1: Schrittweise Herstellung von Mikroinjektionsrode. (a) Konfiguration für die Verwendung unabhängig von mikrofluidischem System. Kanülen und Sonde werden gemessen, um zu bestätigen, dass die Spitze der Sonde in der gewünschten Länge (z.B. 150 m) hervorragen kann. Die Sonde wird frontal in die Kanüle geladen. Die Kanüle wird durch die T-Kreuzung geführt und an der Unterseite befestigt, mit dem flachen Ende in der Mitte der T-Kreuzung; das hintere Ende der Sonde wird durch die obere Ferrule fortgesetzt. Die Mikroinjektion wird durch DasLöten von Goldstiften an jedem der Sondenklemmen und das Hinzufügen von Kleber zwischen ihnen und der oberen Ferrule für Stabilität abgeschlossen. Die Verbindung zum Erfassungssystem hängt vom Entwurf der Sonde ab. In diesem Beispiel ist unsere Sonde ein Nanosensor mit drei Leitungen. (b) Konfiguration für die Verwendung mit mikrofluidischem System. Um die Mikroinjektion mit dem mikrofluidischen System zu koppeln, wird ein Stück Kapillarschlauch für die Oberseite der T-Kreuzung verwendet. Die Sonde kann vorn oder hinten geladen werden. Die mikrofluidische Leitung wird dann an die dritte T-Kreuzungsöffnung angeschlossen. In diesem Beispiel haben wir eine Mikroelektrode verwendet. Sehen Sie sich das gezoomte Bild der Spitze einer Kanüle an, in der die Mikroelektrode durch Anziehen der oberen Ferrule hervorragt wurde. Eine Liste der in der Konstruktion verwendeten Artikel finden Sie in der Materialtabelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mikrofluidisches System. Die Konfiguration mit zwei Ventilen ermöglicht die Steuerung der Strömungsrichtung zur Mikroinjektion oder zur Spülleitung zur Fehlerbehebung. Die Schaltung basiert auf zwei 3-Port-Ventilen, die über Kapillarrohre und Standard-Ferrules angeschlossen sind. Gasdichte Spritzen werden verwendet, um das Infusionsmedikament und den Marker zu tragen und zu injizieren. Eine programmierbare Spritzenpumpe ermöglicht eine automatische Spülung des Systems und die Beladung des Arzneimittels. Eine manuelle Mikrospritzpumpe ermöglicht eine kontrollierte Einspritzung und Visualisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Montage von Mikroinjektionsantrieb an einem hydraulischen Mikroantrieb mit und ohne Einspritzkapazität. Schritt 4.1: Ein maßgeschneiderter Adapter ermöglicht die Befestigung der Microinjectrode am Microdrive. Eine einzelne Schraube befestigt den Adapter am Microdrive; zwei Schrauben sichern Microinjectrode am Adapter. Die obere Ferrule sollte mindestens 2 Umdrehungen abgeschraubt werden, um die Spitze der Mikroelektroden-/Experimentalsonde beim Laden der Mikroinjektion in das Führungsrohr des Mikroantriebs zu schützen. Schritt 4.3: Mikroinjektion von oben in das Führungsrohr einfügen. Schritt 4.4: Wenn Sie eine Mikroinfusion durchführen, schließen Sie die Wirkstofflinie mit einer Kunststoffferrule an die dritte T-Kreuzungsöffnung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Speichergesteuerte Saccade-Aufgabe während der Muscimol-Infusion in FEF. (a) Die Mikroinjektion wurde in der rechten Hemisphäre, FEF Bereich platziert. (b) Verhaltensleistung während einer MGS-Aufgabe, bei der acht Ziele peripher platziert werden. Wir haben 4 Blöcke der MGS-Aufgabe ausgeführt, vor und dreimal nach der Injektion. Polardiagramm zeigt Leistung (Exzentrizität) zu jeder dieser Zeiten (Farbe), für verschiedene Positionen relativ zum Fixierungspunkt (Winkel auf Polardiagramm). Die Leistung verringerte sich im linken visuellen Halbfeld 2 h nach der Injektion deutlich (blaue Spur, linke Hälfte der Polarfläche). (c) Saccade-Spuren für 8 periphere Speicherstandorte vor (links) und nach der Muscimol-Injektion in die FEF (rechts, 1 und 3 h nach der Infusion). Die Saccade-Genauigkeit im linken visuellen Halbfeld (linke Hälfte der Polarplots) verringerte sich nach der Muscimol-Injektion. Skala in Grad des visuellen Winkels (dva). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Derzeit stehen mehrere Methoden zur Gleichzeitigkeit der Medikamentenabgabe und Elektrophysiologie zur Verfügung. Unser System soll die Flexibilität haben, für Aufnahmen unabhängig oder in Kombination mit einer Arzneimittelinjektion verwendet zu werden, und die Fähigkeit haben, jede empfindliche experimentelle Sonde, wie einen Nanosensor oder eine Mikroelektrode, die durch die Dura mater und das Neuronalgewebe vor Beschädigungen geschützt ist, präzise zu platzieren. Das System ermöglicht eine präzise Kontrolle der Wirkstoffinfusionsvolumina mit bloßem Auge (17 nL Präzision in früheren Studien in unserem Laborgezeigt 3).
Es gibt spezialisiertere Systeme für die Druckeinspritzung mit kleineren Durchmessern12. Diese Systeme ermöglichen mehrere Aufzeichnungsstandorte, aber die komplexe Einrichtung von Software und Hardware, die für die Steuerung des Systems erforderlich ist, verursacht höhere Kosten für jede der Komponenten und hat weniger Flexibilität bei der Schnittstelle mit experimentellen Sonden, die noch nicht in großem Maßstab kommerzialisiert sind. Darüber hinaus erfordert unsere Injektionkein chronisches Implantat und bietet ein hohes Maß an Flexibilität: kompatibel mit Biosensoren zur Messung chemischer und elektrophysiologischer Signale und auch in der Lage, Medikamente zu infusionieren, mit dem Potenzial, die Wirkung lokalisierter Arzneimittelinfusionen auf diese Reaktionen zu messen.
Das Design ermöglicht es, die Versuchssonde nach dem Eindringen von Dura zu protrugelten, um Schäden an der Struktur der Sonde zu vermeiden. Diese Funktion ermöglicht die Multifunktionalität des Geräts, um die Dura zu durchdringen, ohne Schäden an experimentellen Sonden wie Nanosensoren im Nanometer-Maßstab zu riskieren10. Es gibt jedoch eine Begrenzung der Länge, die protrudiert werden kann, begrenzt durch die Anzahl der Umdrehungen der Ferrule, begrenzt auf 1 mm für die Standard-Ferrules. Durch den kleinen Kanülendurchmesser (228 m) gibt es nur minimale Gewebeschäden.
In dem Experiment, das wir zeigten, wurde das System verwendet, um eine kontrollierte Lieferung von Muscimol zur reversiblen Inaktivierung von FEF durchzuführen, gleichzeitig mit elektrischer Stimulation oder extrazellulärer Aufzeichnung (einzelnes Neuron, lokales Feldpotential) mit einem Mikroelektrode. Dieses Experiment in FEF erfordert Mikrostimulation der FEF, um Sakkadenvektoren vor der Inaktivierung zu bestätigen, und das Medikament wurde infundiert, um Arbeitsgedächtnis während der reversiblen FEF-Inaktivierung zu studieren. Es ist unwahrscheinlich, dass eine Aufnahme aus dem gleichen isolierten Einzelneuron vor und nach der Injektion des Arzneimittels aufrechterhalten werden kann; Wir konnten jedoch lokale Feldpotenziale vor und nach der Infusion erfassen. Hier zeigen wir ein Experiment, das Injektion, Aufnahme und elektrische Stimulation kombiniert.
Sobald die Methode eingerichtet ist, ist sie sehr zuverlässig und robust. Aufgrund der Ausfällung kleiner Moleküle (z.B. Salz) in den kleinen Rohren und Anschlüssen ist jedoch nach jedem Experiment eine gründliche Spülung erforderlich, um die Mikrofluidika frei von Hindernissen und Leckagen zu halten. Aufgrund der Einfachheit der gesamten Schaltung kann jede Komponente unabhängig voneinander ausgetauscht werden, um eine einfache Fehlerbehebung zu ermöglichen.
Obwohl die Methode im FEF-Bereich bei einem nicht-menschlichen Primaten nachgewiesen wurde, kann das Prinzip auf jeden anderen Hirnbereich angewendet werden, in dem eine Kombination aus elektrischer Stimulation, Aufzeichnung und Medikamenteninjektion gewünscht wird, bei Nagetierarten oder größer.
Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Institutes of Health (NIH) unterstützt, die EY026924 und EY014800 (an B.N.), einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY an das Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University und die Start-up-Mittel, die R.E. von der Henry Samueli School of Engineering und dem Department of Electrical Engineering der University of California, Irvine zur Verfügung gestellt wurden. Diese Methode basiert auf einem früheren Bericht über eine ähnliche Methode, die in Dr. Tirin Moores Labor entwickelt wurde und in Noudoost & Moore 2011, Journal of Neuroscience Methods, veröffentlicht wurde. Die Autoren danken Dr. Kelsey Clark für ihre Kommentare zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
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