여기서, 프로토콜은 현상형 마커를 사용하여 변동 분석 및 미생물 돌연변이 율을 추정하기 위해 제시된다. 이 프로토콜은 연구원이 다양한 미생물 및 환경에서 돌연변이를 분석하여 유전자형과 생태학적 맥락이 자발적인 돌연변이 율에 미치는 영향을 결정할 수 있게 합니다.
변동 성 검사에서는 액체 환경에서 성장하는 미생물의 돌연변이 비율을 추정하는 데 널리 사용됩니다. 많은 배양체는 각각 수천 개의 세포로 접종되고, 각각은 현상상으로 분석될 수 있는 선택적 마커에 민감하다. 이러한 병렬 문화는 자형표의 부재에서 많은 세대에 대 한 성장. 배양의 서브세트는 돌연변이의 위험에 처한 세포의 총 수를 추정하는 데 사용된다(즉, 성장 기간의 끝에 있는 집단 크기, 또는 Nt). 나머지 문화는 선택적 한천에 도금됩니다. 병렬 배양물 들 사이에서 관찰된 저항하는 돌연변이의 분포는 그 때 수학 모형을 사용하여 돌연변이 사건의 예상된 수를 추정하기 위하여, m,이용됩니다. m을 Nt로 나누어 세대당 궤적당 돌연변이율의 추정치를 제공한다. 이 분석에는 세 가지 중요한 측면이 있습니다: 선택된 표현형 마커, 선택한 병렬 배양 부피, 및 선택적 한천의 표면이 배양 전에 완전히 건조되도록 하는 것입니다. 이 분석은 비교적 저렴하며 표준 실험실 장비만 필요합니다. It is also less laborious than alternative approaches, such as mutation accumulation and single-cell assays. 이 분석은 여러 세대를 거치면서 빠르게 작용하는 유기체에서 작동하며 마커와 세포 사멸의 적합성 효과에 대한 가정에 달려 있습니다. 그러나 최근에 개발된 도구와 이론적 연구는 이러한 문제를 이제 는 타있게 해결할 수 있다는 것을 의미합니다. 분석법은 격리에서 또는 지역 사회에서 성장하는 다른 유전자형을 가진 세포에 있는 다른 표현형 마커의 돌연변이 비율 추정을 허용합니다. 여러 분석법을 병렬로 수행함으로써, 분석은 유기체의 환경 적 맥락이 항균 저항, 발암, 노화 및 진화를 이해하는 데 중요한 자발적인 돌연변이 속도에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
1901년 네덜란드식물학자 휴고 드 브리스는 돌연변이1이라는용어를 만들어 내었다. 26년 후, 헤르만 조셉 뮬러가 X선2의돌연변이 작용을 발견했을 때, 돌연변이는 이미 진화의 원동력 중 하나로 인식되었다. 그러나, 돌연변이의 본질은 명확하지 않았습니다. 돌연변이가 자발적으로 나타나는지 (즉, 자발적 돌연변이) 또는 선택 (즉, 유도 된 돌연변이)에 대한 근본적인 질문에 대답하기 위해 돌연변이 이벤트를 관찰하는 방법이 필요했습니다. 이러한 방법은 세포 분열당 예상 돌연변이 수를 측정하거나 이미 돌연변이율3,4로알려진 것을 측정할 것이다.
도 1: 96개의 깊은 웰 플레이트에서 미생물 균주를 갖는 변동 분석법을 수행하는 방법에 대한 개략적 예례. (A)5개의 다른 환경(‘빨강’, ‘파랑’, ‘녹색’, ‘보라색’, 및 ‘주황색’ assays)을 포함하는 50 mL 튜브에서 세포를 접종하고 적응시킵니다. (B)96 개의 깊은 웰 플레이트에 소수의 민감한 세포로 병렬 배양을 준비합니다. ‘빨강’ 분석기는 20개의 병렬 배양을 가지는 반면, ‘파란색’, ‘녹색’, ‘보라색’, ‘주황색’ 분석은 모두 19개의 병렬 배양어가 있습니다. 96 개의 깊은 웰 플레이트에 평행 배양의 위치는 무작위이다. 무작위화는 보조 LayoutGenerator.R 스크립트 또는 다른 도구로 수행할 수 있습니다. 오른쪽 상단의 레이아웃은 무작위화 결과입니다. (C)96개의 깊은 웰 플레이트를 인큐베이션하고 세포가 분열시키고 자발적으로 돌연변이할 수 있도록 한다. 깊은 우물 A1, B1, C1, E1, F1 및 G1로부터의 6개의 배양체는 돌연변이체의 수가 어떻게 변동하는지 를 보여준다: 각각 제3 세포 분열 후 4, 0, 2, 2, 1, 및 4적혈구. 돌연변이체의 수는 자발적인 돌연변이의 상이한 수(제1 적혈구에 의해 도시된 바와 같이 0, 1, 또는 2)뿐만 아니라, 또한 배양 주기 동안 저항 돌연변이가 자발적으로 나올 때 중요하기 때문에(세포 분열 1, 2, 또는 3). (D)96개의 딥 웰 플레이트의 배양 후 돌연변이의 수는 81개의 병렬 배양액을 도금하여 결정된다. 레이아웃에서 굵은 가장자리가 없는 원입니다. 전체 병렬 배양은 선택적 한천을 포함하는 6개의 웰 플레이트 중 하나의 웰에 도금된다. (e)나머지 15개의 배양체는 비선택적 한천상에서 희석 및 도금되어 평균 세포수(Nt)를결정한다. 레이아웃에서 이러한 Ntwells로 레이블이 지정 되 고 굵게 가장자리가 있습니다. 각각의 분석결과 Nt는 3개의 병렬 배양물 이상평균화된다. 오른쪽 하단에는 깊은 우물 D1 (녹색’분석의 일부)에서 자란 희석 된 배양액 25 CFUs가있는 비 선택적 한천 접시가 들어있는 페트리 접시가 있습니다. (f)선택적 6웰 플레이트의 배양 후 관찰된 돌연변이체의 수를 카운트하고 돌연변이 사건의 예상 횟수를 계산하였고, m,최대 우도 추정기를 사용하여 추정하였다. (g)돌연변이의 수를 모두 알고, m,및 분석당 세포 수, Nt,돌연변이 율은 m/Nt로추정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1943년 살바도르 루리아와 막스 델브뤼크는 변동 분석5(그림 1참조)와 함께 이 문제에 대한 독창적인 해결책을 제공했습니다. 분석은 미생물 세포의 소수로 시작되는 다중 인구 (명명된 병렬 배양)로 시작됩니다(그림 1A,B). 양성, 비선택적 환경에서 성장한후(도 1C),병렬 배양액은 선택적 마커(파지, 항생제 등)를 함유하는 플레이트 상에 전달되며, 여기서 저항돌연변이를 가진 세포만이 생존하고 콜로니를 생성할 수 있다(도1D). 주요 기대는 저항 돌연변이가 유도되는 경우에, 돌연변이를 전송하는 세포의 수는 분산과 같은 평균을 가진 다른 인구 사이에서 분배되어야 한다는 것이었습니다. 루리아와 델브뤼크가 변동 분석으로 발견한 것은 돌연변이의 수가 급격히 변동하고 다른 집단 간의 돌연변이 체의 차이가 평균보다 상당히 크다는 것입니다. 루리아와 델브뤼크는 돌연변이가 자발적임을 입증했다. 그(것)들은 DNA가 복제될 때마다 돌연변이가 자발적으로 나타난다는 것을 보여주었습니다, 돌연변이의 수는 돌연변이가 인구의 성장 도중 생기는 때에 달려 있습니다. 도 1C를참조하십시오, 여기서 6개의 집단은 각각 미생물 세포(파란색)로 시작되고, 없음, 1 또는 2개의 단일 돌연변이를 경험한다. 인구 A1, E1 및 F1은 하나의 단일 돌연변이(첫 번째 적혈구)를 경험했지만, 배양 주기 동안 다양한 시점에서 단일 돌연변이가 자발적으로 나타나기 때문에, 집단은 관찰된 돌연변이의 매우 다른 수(각각 4개, 2개 및 1개)로 끝났다. 다른 한편으로는, 인구 C1및 G1은 1보다는 오히려 2개의 돌연변이 사건을 경험했음에도 불구하고 E1및 A1로 관찰된 돌연변이의 동일 수로 끝났습니다. 집단 중 관찰 된 돌연변이의 변동은 분석법이름을 주었을뿐만 아니라 돌연변이 빈도 (즉, 돌연변이 세포의 비율)가 돌연변이 율의 부적절한 지표임을 보여주었습니다.
변동 분석법의 전반적인 목표는 특정 액체 환경에서 성장하는 박테리아 또는 다른 단세포 유기체의 특정 유전자형의 자발적인 돌연변이 율을 추정하는 것입니다. 변동 분석법은 미생물 돌연변이 비율의 환경 의존성을 연구하기위한 가장 적합한 도구로 남아 있으며 신속하고 저렴한 돌연변이 속도 추정을 허용합니다. 최대 깊이 시퀀싱6,인구 시퀀싱7,돌연변이 축적 실험8,또는 부모9의 자손의 게놈 서열을 비교하는 것과 같은 돌연변이 속도 추정에 대한 대체 접근법은 훨씬 더 힘들고, 따라서 잠재적으로 환경 의존성을 검출하는 데 적합하지 않다. 그러나, 돌연변이의 생성 및 수리의 동적 양상은 변동 분석또는 위에 열거된 돌연변이 비율을 분석하는 방법 중 어느 것에도 크게 접근할 수 없습니다. 시간, 공간, 또는 인구 내의 개별 적인 세포 중 돌연변이의 수가 어떻게 변경되는지 연구하기 위하여는, 단세포 접근11,12는, 변동 측정법 보다는 더 힘든 이외에, 고도로 전문화된 기술 및 장비가 필요합니다.
실제로, 변동 분석은 그 마커에 대한 선택이 부족한 환경에서 발생하는 돌연변이로 인해 현상형 마커를 얻는 세포를 계수하는 것입니다. 수백 개의 출판된 분석결과10개는 적어도 39개의 상이한 현상형 마커가 1943년에 분석이 시작된 이래로 사용되었음을 보여준다. 변동 분석실험은 허용 환경에서 성장하는 실험실, 임상, 비돌연변이및 돌연변이균주 간의 돌연변이율의 평균및 환경의존성을 비교하는데 사용될 수 있다. 분석은 최소 또는 부유한 환경에서 성장하는 다른 유전 배경을 가진 세포에 있는 돌연변이 비율 추정을 허용합니다. 상기 분석은 단일배양으로 성장하는 집단뿐만 아니라 돌연변이율11에대한 세포-세포 상호작용의 효과를 연구하는데에도 사용될 수 있다. 관심균이 제2 균주와 배양되고 중립 마커가 균주를 구별하는 데 사용될 때, 돌연변이 속도는 동시에 동일한 튜브에서 두 개의 균주에 대해 분석될 수 있다.
변동 하는 검사 결과 자발적인 돌연변이 속도 세포의 유전자형과 그것의 환경 둘 다에 따라 달라 집니다12 그리고 그 자체가 진화 하는 특성13. 특정 유전자형의 돌연변이율이 환경에 따라 변할 때마다, 돌연변이율 가소성11로기술된다. 플라스틱 돌연변이 율은 스트레스 유발 돌연변이 발생(SIM)14에대해 가장 철저하게 다루어졌다. 또한, 변동 성 검사를 사용하여, 최근에 세포의 집단이 증가하는 밀도 (전형적으로 용량에서 배치 배양)가 박테리아 및 단세포 진핵생물에 걸쳐 돌연변이 속도와 밀접하게 연관되어 있음을 보여주었다. 세대당 게놈당 돌연변이율은 조밀한 집단에서 23배10,11만큼감소한다. 이러한 밀도 관련 돌연변이 율 가소성(DAMP)은 쿼럼 감지시스템(15)에 의존할 수 있으며 SIM16과독립적으로 작동할 수 있다.
여기서, 상세한 프로토콜은 글루코스 최소 미디어 환경에서 항생제 리팜피신에 대한 내성을 얻고 있는 대장균 균주 K-12를 연구하는 데 사용되는 변동 분석에 대해 제시된다. 그러나, 이 프로토콜은 단순히 돌연변이의 배양 조건 및 현상형 마커를 수정함으로써 다양한 미생물을 연구하는 데 이용될 수 있는 기본 템플릿으로 볼 수 있다. 이 프로토콜은 시작부터진화5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 다양한 미생물및 심지어 암세포30에 대한 사용을 통해 변형되어 증가하도록 수정되었습니다. 미생물 돌연변이율10,11,16의환경 의존성을 제대로 테스트하는 데 필수적이었다. 여기서 설명된 프로토콜은 문헌에서 이미 잘 논의되어 온 변동 분석의 모든 방법론 및 분석 문제를 다루지 않으며, 특히 내성 돌연변이의 적합성효과(31,표현형 지연32,세포 사멸33,및 돌연변이율26,34)를추정할 수 있는 다양한 알고리즘의 적합성을 다루지 않는다. 이는, 예를 들어, 피트니스 효과의 환경 의존성으로 인해 돌연변이율추정치35의잘못된 변동을 야기할 수 있는 중요한 일 수 있다. 그러나, 우리는 우리가 여기에서 사용하는 분석 공구가 돌연변이 적정및 세포 죽음에 있는 변이를 취급할 수 있다는 것을 주의합니다. 노트와 토론에서 언급 된 바와 같이, 그것은 또한 동일한 환경 의존적 인 피트니스 효과를 가질 가능성이 여러 phenotypic 마커를 고려하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 사람들이 미생물 균주 및 환경의 다양성에서 돌연변이 비율의 환경 의존성을 일상적으로 분석할 수 있게 합니다. 상이한 환경에서의 변이검사는 아직 철저히 시험되지 않았으며 일단 인구 밀도가 고려되면, 변동 성 실험은 돌연변이율10의보다 정확한 추정치를 제공할 수 있다. 이 프로토콜은 돌연변이 비율을 뒷받침하는 메커니즘을 이해하는 데 필요한 바와 같이 더 많은 변동 분석이 수행 될 수 있게 할 것이며, 이는 차례로 진화, 발암, 노화 및 항균 저항을 이해하는 데 필수적입니다.
돌연변이 속도의 임의의 추정은 연구34내및 사이에서 반복성 및 재현성을 보장하기 위하여 달성된 정밀도를 최대화할 필요가 있다. 변동 분석의 경우 세 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 처음 두 프로토콜은 주어진 프로토콜에서 설정되었지만 프로토콜이 다른 균주 또는 환경에서 작동하도록 조정된 경우 문제 해결이 필요합니다(그림 3참조). 먼저 적절한 자형표 마커를 선택하는 것입니다. 박테리아의 경우, 항생제 리팜피신과 날리딕산에 대한 내성을 각각 부여하는 두 마커 로시, rpoB 또는 gyrA중 하나에서 비율을 추정하는 것이 좋습니다. 이 2개의 층에서 항생 저항에 돌연변이를 위한 표적 크기는 다르다. 리팜피신(37)과 날리딕산(40)에 대한 내성을 각각 부여하는 79개 및20개의 독특한 돌연변이가 있다. 실제로, 이것은 평균적으로, 리팜피신 저항하는 돌연변이가 더 빈번히 관찰된다는 것을 의미합니다. 따라서 첫 번째 질문(그림 3의Q1)은 변형이 돌연변이체인지 여부입니다. 많은 관찰 된 돌연변이 콜로니가 예상되는 구성 돌연변이체가 연구 될 때, 더 작은 목표 크기 (예를 들어, nalidixic acid)를 가진 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 도 2B를참조하여, 구성 돌연변이체 대장균 의 돌연변이 율 인 대장균 K-12 BW25113 ΔmutT가 마커로서 nalidixic 산을 사용하여 추정하였다. 야생 유형 (즉, 정상) 돌연변이 율을 가진 비 돌연변이 균주와 함께 작업 할 때, 리팜피신은 더 나은 선택입니다 (그림 2A참조). 어떤 이유로 더 관찰 된 돌연변이가 필요한 경우, 관련 마커는 사이클로린에 대한 저항이다. 이 마커를 위해, 저항 돌연변이는 10개 이상의 유전자41에서나타날 수 있습니다, 표적 크기가 리팜피신을 위해 보다는 더 크다는 것을 의미하. 효모와 고고학을 공부할 때 각각 25S 리보소말 단백질과 URA3의 돌연변이 율을 추정하여, 히그로마이신 B와 5-플루오로 오로산(5-FOA)에 대한 내성을 부여하는 것이 좋습니다.
두 번째 중요한 고려 사항은 병렬 배권의 볼륨입니다. 사용할 부피는 관찰된 돌연변이의 실제 수에 따라 달라집니다. 관찰된 돌연변이의 예상 수는 선택된 자형표 마커에 대한 표적 크기, 돌연변이를 복구하고 피하는 균주의 능력(평균 돌연변이 율), 그리고 사용된 매체 및 배양 부피 모두에 의해 영향을 받는 환경의 운반 능력에 의해 영향을 받습니다. 병렬 배양이 리팜피신에 저항하는 돌연변이 식민지를 포함하지 않는 경우에, 그 때 cycloserine는 사용되어야 하거나 도금세포의 수를 증가시켜야 합니다. 이것은 최소한의 매체에 더 많은 포도당을 추가하거나 더 풍부하게 (또는 완전한) 환경에서 세포를 성장시킴으로써 달성될 수 있습니다. 그러나, 많은 경우에, 이러한 집단 밀도의 증가는 돌연변이 율의 감소와 연관되어, 그 결과 제한되고, 만약 에, 관찰된 돌연변이 콜로니의 수의 증가는10이다. 영양분을 증가시켜 용액이 아닌 경우, 각 병렬 배양의 부피를 증가시킴으로써 세포 수를 증가시키면 옵션이 있다. 환경이 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로 설탕을 가진 최소한의 염을 포함하는 경우(즉, 그림 3의 Q2에 대한 대답은 “최소 중간”) 0.5mL에서 1.5mL 사이의 부피를 사용해야 합니다. 환경이 풍부한 경우 병렬 배권의 볼륨은 0.35-1 mL 사이여야 합니다. 마지막 질문은 저항하는 식민지의 중앙값 수에 관한 것입니다. 너무 적은 돌연변이 콜로니가 관찰되는 경우(즉, 도 3의 Q3에 대한 대답은 0) 환경이 수정되지 않는 경우, 병렬 배양물의 부피가 증가되거나 더 큰 표적 크기(예를 들어, 사이클로린)를 가진 항생제를 사용해야 한다. 한편, 모든 선택적 플레이트에서 많은 돌연변이 콜로니가 관찰되는 경우(판당 ~150개 이상, 도 3참조), 도금된 세포의 수는 감소되어야 하며, 이는 일반적으로 더 낮은 부피를 사용하거나 더 작은 표적 크기(예를 들어, nalidixic acid)를 가진 항생제로 전환하는 것을 의미한다.
볼륨이 선택되면 하나의 96 딥 웰 플레이트의 모든 병렬 배양권이 동일한 볼륨을 가지는 것이 가장 좋습니다. 이를 통해 플레이트의 중량으로부터 병렬 배양의 실제 부피를 보다 정확하게 결정할 수 있습니다. 특정 유전자형의 돌연변이 율이 서로 다른 환경 간에 비교될 때, 모든 환경에서 동일한 양의 병렬 배양을 사용하는 것이 다시 가장 좋습니다. nalidixic acid가 야생 형 (즉, 정상) 돌연변이 속도 또는 다른 표현형 마커를 추정하는 데 사용되는 경우 nalidixic acid보다 훨씬 작은 표적 크기를 가지는 것이 사용되며, 부피는 더욱 증가되어야 합니다. 한 가지 옵션은 최대 15mL의 부피가 있는 50mL 튜브에서 병렬 배양을 만드는 것입니다. 예를 들어, 10 mL 병렬 배양체는 대장균 K-12 MG1655 돌연변이 율을 nalidixic acid로 추정할 때 50 mL 튜브에서 제조되었다(도 2A참조). 병렬 10 mL 배양물을 선택적 TA 한천에 도금하고 표준 90 mm 페트리 접시 대신 큰 150 mm 플레이트에 부었다. 50 mL 튜브에서 병렬 배양을 준비하는 단점은 처리량이 96 개의 깊은 웰 플레이트에서 돌연변이 율을 평가하는 것에 비해 상당히 낮다는 것입니다. 한 가지 해결책은 병렬 문화본의 수를 줄이는 것입니다. 그러나, 이것은 m의추정에 대한 정밀도에 영향을 미치며, 이는 돌연변이 이벤트의 예상 수 및 병렬 배양부수(26)에의존한다. 관찰된돌연변이를 14-17 병렬 배양물(그림 2에서 와 같이)으로 분포하는 것은 고체 처리량과 20%의 허용 가능한 정밀도수준 26 사이의 균형을 잘 유지합니다. 17.5%의 중간 정밀도 수준은 훨씬 더 큰 데이터 세트10에서계산된 16.4%(5.7%-38.9%, n = 580)의 수분 간 범위의 중간 정밀도와 유사합니다. 따라서, 96개의 딥 웰 플레이트 또는 50 mL 튜브에서 병렬 배양을 준비할 때 관찰된 돌연변이체의 분포가 적어도 14개의 병렬 배양물로 얻어지는 것이 좋습니다. 돌연변이 율이 다른 환경에서 추정될 때 한 판에 있는 모든 96개의 병렬 배양이 동일한 환경에서 성장되는 멀티플레이트 실험을 수행하여 정밀도 수준을 테스트하는 것이 좋습니다. 또한, 병렬 배양을 준비할 때, 접종기는 접종에 존재하는 내성 세포의 가능성을 감소시키기 때문에, 세포의 낮은 수를 포함하는 것이 중요하다. 기존의 내성 돌연변이는 접종에서 원하지 않으며, 숫자가 증가하고 선택적 플레이트에 잔디를 생성하고 돌연변이 율의 추정이 불가능하기 때문이다. 예를 들어, 대부분의 비돌연변이체 대장균 집단에서, 리팜피신 저항에 대한 돌연변이 속도는~10-8의순서로 이다. 따라서, 기존의 내성 돌연변이체로 배양을 접종하는 것을 피하기 위해, 10 개미만의 8 세포 (예를 들어, 103-104 세포)로 접종해야합니다. 마지막 중요한 단계는 선택적 한천 플레이트가 배양되기 전에 선택적 한천의 표면이 완전히 건조되도록하는 것입니다. 예를 들어 6웰 플레이트를 사용하고 병렬 배양의 초기 부피가 1mL인 경우 스프레더를 사용할 수 없습니다. 표면 액체가 마르도록 플레이트는 멸균 상태로 덮여 있어야 합니다. 이 걸리는 시간은 주변 조건과 플레이트의 상태에 따라 매우 가변적일 수 있습니다. 이 시간을 최소화해야 하지만 최대 몇 시간까지 가능합니다.
변동 분석에는 고유한 제약 조건이 있습니다. 그것은 게놈의 작은 부분 집합에서만 돌연변이의 현상형 마커를 해석합니다. 분석법은 이렇게 비율을 추정하기 위하여 충분한 돌연변이를 관찰하기 위하여 세대를 통과하는 큰 인구를 요구합니다. 이는 변동 분석은 박테리아,베이커효모(42)또는 액체 배양 포유류세포(30)와같이 많은 세대를 급속히 통과할 수 있는 유기체에만 사용될 수 있음을 의미한다. 또한, 돌연변이는 특정 세포의 특정 생화확적인 상황에서 발생하는 드문 사건이다. 변동 이 시제가 시간이 지남에 따라 세포의 큰 인구에 걸쳐 보이는 사실은 그 상황이 실질적으로 다를 수 있다는 것을 의미합니다. 이 분석을 사용하여, 따라서 지연 단계에서 초기 및 후기 지수 단계및 마지막으로 고정 단계에 특정 집단의 돌연변이 비율의 진행을 연구하는 것은 어렵다. 인구 내의 단 하나 세포 중 돌연변이 비율의 어떤 분화든지 변동 분석결과에서 완전히 숨겨져 있습니다. 단세포 돌연변이 역학은 DNA 복구 단백질 MutS43의 단일 분자 추적 또는 축적된 MutL 단백질44의초점을 계산하여 연구될 수 있다. 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 또한 부모 자손 트리오9,45 및 다세대 혈통46으로부터의돌연변이 비율을 직접 추정할 수 있게 하였다. 이러한 방법론적 진보는 단일 세대 내에서 발생하는 돌연변이의 직접적인 계수를 허용하기 시작했다. 그러나, 이 직접적인 접근은 형광 현미경 검사법, 미세 유체 공학, 또는 전체 게놈 순서와 같은 고가의 최첨단 기술을 요구합니다. 한편, 변동 분석은 상대적으로 저렴하고 표준 실험실 장비만 필요합니다. 더 많은 변동 검정을 하는 것은 또한 더 직접적인 단세포 접근으로 시험될 수 있는 새로운 가설의 생성을 촉진할 것입니다.
돌연변이의 연구 결과에 있는 오랜 관심사가 있습니다, 그래서 변동 분석결과는 확률이 널리 이용되는 방법 남아 있을 것입니다. 지난 4년(2015-2018년)에 루리아와 델브뤼크5가 인용한 정액 논문의 인용 건수는 모두 이 논문의 인용 상위 5위 안에 들였습니다. 그러나, 변동 분석기를 제대로 수행하기 위해 필요한 많은 양의 정확한 수동 작업으로 인해 대부분의 연구는 소수의 변동 분석만 수행합니다. 그러나 이것은 돌연변이 율의 환경 적 의존성을 밝히기에는 충분하지 않습니다. 이 백서에 설명된 바와 같이, 멀티웰 플레이트를 사용하여 변동 률 을 간소화함으로써, 가능한 현재 최대 처리량은 여기에 설명된 바와 같이 병렬로 11개의 딥 웰 플레이트(55 변동 성 매시스)이다. 하루에 두 세트의 변동 을 동시에 실행하면 주당 최대 110 개의 assays를 수행 할 수 있습니다. 처리량의 또 다른 단계 변화는 주어진 순전히 수동 프로토콜로부터 변동 분석의 다양한 단계를 자동화함으로써 아직 가능할 수 있다. 또한, 돌연변이 비율의 환경 의존성을 공부하기 위해, 인구 밀도는 고려될 필요가 있습니다. 이전 결과10 은 돌연변이 비율에 영향을 미치는 알려진 요인이 고려될 때, 인구 밀도를 통제하는 것은 돌연변이 비율 추정에 있는 변이를 90% 이상 감소시킬 수 있다는 것을 보여줍니다. 밀도를 제어하려면 N t(돌연변이 비율 추정에 사용)가 인구 밀도를 결정하는 데 사용되는 방법과 독립적으로 결정되는 것이 좋습니다. 박테리아에서, Nt는 CFU 및 밀도에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, ATP 기반 발광 분석분석(10).
높은 처리량과 밀도 조절은 유기체의 생태학적 맥락이 자발적인 돌연변이 율에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 때 필수적입니다. 돌연변이 비율 가소성의 존재를 아는 것은 중요하지만, 돌연변이 비율 가소성이 더 넓은 생물학적 맥락으로 통합될 경우 그 원인과 효과를 이해하는 것이 중요합니다. 변동 분석법은 결과가 급속히 얻어지고, 분석실험은 다른 방법에 비해 저렴하기 때문에 많은 가설을 테스트하는 데 사용할 수있는 훌륭한 도구입니다. 단계는, 예를 들면, 세균성 지역 사회 및 microbiomes에 있는 돌연변이 비율의 환경 의존성을 공부하기 위하여 설정됩니다. 동문화에 변동 분석실험을 적응하는 것은 긴장이 작은 분자를 통해 서로의 돌연변이 비율에 영향을 미친다는 가설을 시험할 수 있습니다. 동문화에 의하여 변동 하는 해석의 수천을 하는 것은 긴장이 서로의 돌연변이 비율을 수정하는 그들의 능력에서 그리고 그들의 감수성에서 그 외에 의해 수정된 그들의 감수성 둘 다 변화하는지 결정할 수 있습니다. 돌연변이 비율 조작에 감수성에 있는 긴장 중 아마 변이는 특정 유전 변이에 기인합니다. 이것은 항균 저항이 어떻게 나타나는지와 같은 넓은 중요성의 예에서, 복잡한 지역 사회에서 진화가 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 견해를 바꿀 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
RK는 BB /M020975/1 및 생물 과학의 맨체스터 대학 대학에 의해 지원되었다. HR은 BB/J014478/1에 의해 지원되었습니다. GG는 BBSRC 박사 교육 파트너십 BB / M011208 / 1에 의해 지원되었다. DRG는 UKRI 수상 번호 MR / R024936 /1에 의해 지원되었다.
1.5 ml Microcentrifuge tubes | Starlab International GmbH | S1615-5550 | |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | T8877-10g | |
6-well plates | Greiner Bio-One | REF 657102 | |
90mm Petri Dishes Triple Vented | ThermoFisher Scientific | REF 120189 | |
96 deep-well plate (Masterblock 2 ml) | Greiner Bio-One | REF 780270 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A/6440/53 | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | REF 214010 | |
Bacto yeast extract | Becton, Dickinson and Company | REF 212750 | |
Cycloserine | Sigma-Aldrich | 1158005-250MG | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
D-Glucose anhydrous | Fisher Chemical | G/0500/61 | |
50 ml Centrifuge Tube | Corning | REF 430828 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256-500g | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Chemical | M/1050/53 | |
Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878-5G | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
Potassium phosphate dibasic trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504-500g | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500g | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp, USA | 557303-1GM | |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
Spectophotometer | Jenway | 6320D | |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625-25g | |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-500g | |
Tryptone | Fisher Chemical | 1278-7099 |