Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Måling af mikrobielle Mutations rater med udsvings analysen

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60406
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 1, 4, 3
1School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2School of Science, University of Waikato, 3School of Natural Sciences, The University of Manchester, 4Department of Mathematics, Université du Québec à Montréal

Summary

Her præsenteres en protokol til at udføre en udsvings analyse og anslå mikrobiel mutation sats ved hjælp af fænotypiske markører. Denne protokol vil gøre det muligt for forskerne at foretage analyse af mutationer i forskellige mikrober og miljøer og bestemme, hvordan genotype og økologisk kontekst påvirker spontane Mutations rater.

Abstract

Udsvings assays anvendes i vid udstrækning til at anslå Mutations rater i mikrober, der vokser i flydende miljøer. Mange kulturer er hver inokuleret med et par tusinde celler, hver følsom over for en selektiv markør, der kan være analyseret phenotypisk. Disse parallelle kulturer vokser i mange generationer i fravær af fænotypiske markør. En delmængde af kulturer anvendes til at anslå det samlede antal celler med risiko for mutationer (dvs. befolkningsstørrelsen ved slutningen af vækstperioden eller Nt). De resterende kulturer er belagt på den selektive agar. Fordelingen af observerede resistente mutanter blandt parallelle kulturer bruges derefter til at anslå det forventede antal mutationale hændelser, m, ved hjælp af en matematisk model. Ved at dividere m med Nt gives skønnet for mutationsfrekvensen pr. Lokus pr. generation. Analysen har tre kritiske aspekter: den valgte fænotypiske markør, det valgte volumen af parallelle kulturer, og sikre, at overfladen på den selektive agar er helt tør før inkubationen. Analysen er relativt billig og kræver kun Standardlaboratorieudstyr. Det er også mindre omstændelig end alternative tilgange, såsom mutation ophobning og enkelt-celle assays. Analysen virker på organismer, der går gennem mange generationer hurtigt, og det afhænger af antagelser om konditions effekten af markører og celledød. Men nyligt udviklede værktøjer og teoretiske undersøgelser betyder, at disse spørgsmål nu kan håndteres analytisk. Analysen gør det muligt at anslå Mutations raten for forskellige fænotypiske markører i celler med forskellige genotyper, der vokser isoleret eller i et fællesskab. Ved at gennemføre flere assays parallelt, kan assays bruges til at studere, hvordan en organismes miljømæssige kontekst påvirker spontan mutation sats, som er afgørende for forståelsen af antimikrobiel resistens, carcinogenese, aldring, og Evolution.

Introduction

I 1901 har den hollandske botaniker Hugo de Vries opfundet udtrykket mutation1. Femogtyve år senere, da Hermann Joseph Muller opdagede den mutagene handling af røntgenstråler2, blev mutationer allerede opfattet som en af de drivende kræfter i Evolution. Men karakteren af mutationer var ikke klar. For at besvare det grundlæggende spørgsmål om, hvorvidt mutationer opstår spontant (dvs. en spontan mutation) eller som respons på udvælgelse (dvs. en induceret mutation), var en metode nødvendig for at observere mutationale hændelser. En sådan metode ville måle det forventede antal mutationer pr celle division eller hvad der allerede var kendt som en mutation sats3,4.

Figure 1
Figur 1: skematisk illustration af, hvordan udsvings analysen udføres med en mikrobiel belastning i en 96 dyb brønd plade. A) inokulere og akklimatisere celler i 50 ml-rør, der indeholder fem forskellige miljøer (' rød ', ' blå ', ' grøn ', ' lilla ' og ' orange ' assays). B) at forberede parallelle kulturer med et lille antal følsomme celler i en 96 dyb brønd plade. Den ' røde ' analyse har 20 parallelle kulturer, hvorimod den ' blå ', ' grønne ', ' lilla ' og ' orange ' assays alle har 19 parallelle kulturer. Positionerne af parallel kulturer på 96 dybe brønd plade er tilfældige. Randomisering kan gøres med det supplerende LayoutGenerator. R script eller et andet værktøj. Layoutet øverst til højre er det randomiseringsresultat. C) inkuber 96 Deep Well Plate, og lad cellerne dele og spontant Muere. Seks kulturer fra Deep Wells a1, B1, C1, E1, F1 og G1 viser, hvordan antallet af mutanter svinger: 4, 0, 2, 2, 1 og 4 røde celler efter henholdsvis den tredje celle division. Antallet af mutanter afviger ikke kun på grund af det forskellige antal spontane mutationer (0, 1 eller 2 som vist ved den første røde celle), men også fordi det er vigtigt, når der under en kultur cyklus spontant opstår en resistens mutation (celle Division 1, 2 eller 3). D) Efter inkubationen af den 96 dybe brønd plade bestemmes antallet af mutanter ved plating 81 parallel kulturer. På layoutet er disse cirkler uden fed kanter. Hele parallel kulturen er belagt på en brønd af en 6 brønd plade indeholdende en selektiv agar. E) de resterende 15 kulturer fortyndes og forzinket på den ikke-selektive agar for at bestemme det gennemsnitlige antal celler (Nt). På layoutet disse er mærket som Ntwells og har fed kanter. For hver analyse er Nt gennemsnitligt over tre parallelle kulturer. Nederst til højre er en Petri skål, der indeholder en ikke-selektiv agar plade med 25 CFUs af en fortyndet kultur dyrket i en dyb brønd D1 (del af en ' grøn ' assay). F) efter inkubation af de selektive 6 brønd plader blev antallet af observerede mutanter talt, og det forventede antal mutationale hændelser, m, blev anslået ved hjælp af en maksimal sandsynlighed for estimator. G) at kende både antallet af mutationer, mog antallet af celler pr. analyse, Nt, blev Mutations raten anslået som m/Nt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Salvador Luria og Max Delbrück i 1943 leverede en genial løsning på dette problem med udsvings analysen5 (Se figur 1). Analysen starter med flere populationer (med navnet parallel kulturer), der indledes med et lille antal mikrobielle celler (figur 1a, B). Efter vækst i et godartet, ikke-selektivt miljø (figur 1C), overføres parallelle kulturer på plader, der indeholder en selektiv markør (fager, antibiotika osv.), hvor kun celler med en modstands mutation overlevede og kan producere en koloni (figur 1D). Den største forventning var, at hvis resistens mutationer induceres, bør antallet af celler, der bærer en mutation, fordeles mellem forskellige populationer med middelværdien lig med variansen. Hvad Luria og Delbrück fandt med udsvings analysen er, at antallet af mutanter svingede drastisk, og at variansen i antallet af mutanter blandt forskellige populationer var betydeligt større end middelværdien. Luria og Delbrück påviste derved, at mutationer er spontane. De viste, at mutationer spontant opstår, når DNA replikeres, og antallet af mutanter afhænger af, hvornår mutationen opstår under væksten af befolkningen. Se figur 1C, hvor seks populationer, hver initieret med en mikrobiel celle (i blåt), oplever ingen, 1 eller 2 enkelt mutationer. Populationer a1, E1 og F1 oplevede en enkelt mutation (første røde celle), men fordi en enkelt mutation spontant opstår på forskellige tidspunkter i løbet af en kultur cyklus, populationer endte med et meget forskelligt antal observerede mutanter (fire, to, og en, hhv.). På den anden side endte populationer C1 og G1 med det samme antal observerede mutanter som E1 og a1, på trods af at de oplevede to mutationer i stedet for én. Udsvingene i observerede mutanter blandt populationer gav ikke blot analysen navnet, men viste også, at en mutant frekvens (dvs. andelen af mutante celler) er en utilstrækkelig indikator for mutationsfrekvensen.

Det overordnede mål med udsvings analysen er at estimere den spontane Mutations rate for en bestemt genotype af bakterier eller andre enkelt cellede organismer, der vokser i et bestemt flydende miljø. Udsvings analysen er fortsat det mest velegnede redskab til at studere den miljømæssige afhængighed af mikrobielle Mutations rater og muliggør en hurtig og billig vurdering af Mutations raten. Alternative tilgange til vurdering af mutation rate, såsom maksimal-dybde sekvens6, population sekvens7, mutation ophobning eksperimenter8, eller sammenligne genom sekvenser af et afkom til forældrene9 er langt mere omstændelig, og dermed dårligt egnet til potentielt afsløre miljømæssige afhængigheder. Men dynamiske aspekter af en mutation generation og reparation er stort set utilgængelige for en udsvings analyse eller nogen af metoderne til at bestemmelse en mutationsfrekvens, der er anført ovenfor. At studere, hvordan antallet af mutationer ændringer i tid, rum, eller blandt individuelle celler i en population, enkelt celle tilgange11,12 er nødvendige, som ud over at være mere besværlig end udsving assays, kræver højt specialiserede færdigheder og udstyr.

I praksis er en udsvings analyse at tælle celler, der opnår en fænotypisk markør på grund af en mutation, som opstår i et miljø, som mangler udvælgelse til den markør. Meta-analyse af hundredvis af offentliggjorte assays10 viser, at mindst 39 forskellige fænotypiske markører har været anvendt siden analysens begyndelse i 1943. Udsvings analysen kan bruges til at sammenligne gennemsnit og miljømæssig afhængighed af Mutations rater blandt laboratorie-, klinisk-, nonmutator-og Mutator-stammer, der vokser i undergivende miljøer. Analysen giver mulighed for mutation rate estimering i celler med forskellige genetiske baggrunde vokser i enten minimal eller rige miljøer. Analysen er egnet ikke kun for populationer vokser som en monokultur, men kan også bruges til at studere virkningerne af celle-celle interaktioner på mutation satser11. Når den stamme af interesse er cokuleret med en anden stamme, og en neutral markør bruges til at skelne de stammer, kan Mutations rater blive analyseret for to stammer i samme rør på samme tid.

Udsvings analyser har afsløret, at den spontane mutationsfrekvens afhænger af både en celles genotype og dens omgivelser12 og er et træk, der selv udvikler sig13. Når Mutations raten for en bestemt genotype ændres med miljøet, beskrives den som mutation-rate plasticitet11. Plast Mutations rater er blevet mest grundigt behandlet for stress-induceret mutagenese (SIM)14. Desuden er det for nylig blevet påvist, at den tæthed, som en population af celler vokser (typisk en batch kultur ved bæreevne), er tæt forbundet med Mutations rater på tværs af bakterier og unicellulære eukaryoter. Mutations raten pr. genom pr. generation falder i tætte populationer med så meget som 23 gange10,11. Denne tæthed-associeret mutation rate plasticitet (FUGTIG) kan afhænge af et quorum-sensing system15 og handle uafhængigt af SIM16.

Her præsenteres en detaljeret protokol for udsvings analysen, der anvendes til at studere Escherichia coli stamme K-12 opnå resistens over for antibiotika rifampicin i en glukose minimal mediemiljø. Men, denne protokol bør ses som en grundlæggende skabelon, der kan udnyttes til at studere en bred vifte af mikrober ved blot at ændre de kulturelle forhold og fænotypiske markører for mutation. Protokollen har udviklet sig fra starten5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 gennem dens anvendelse på en bred vifte af mikrober og endda kræftceller30 og er blevet modificeret til at øge Gennemløb, som var afgørende for korrekt afprøvning af miljømæssige afhængigheder af mikrobielle mutation satser10,11,16. Den protokol, der er beskrevet her, dækker ikke alle de metodologiske og analytiske spørgsmål vedrørende udsvings analysen, som allerede er godt diskuteret i litteraturen, især konditions effekter af resistente mutationer31, fænotypiske forsinkelser32, celledød33og egnetheden af forskellige algoritmer, der er tilgængelige til at estimere Mutations raterne26,34. Dette kan være vigtigt, for eksempel, når den miljømæssige afhængighed af fitness effekter kan give anledning til fejlagtige variation i Mutations raten estimater35. Vi bemærker dog, at de analytiske værktøjer, vi bruger her, kan håndtere variationen i mutant fitness og celledød. Som omtalt i noterne og diskussionen, anbefales det også, at flere fænotypiske markører, der er usandsynligt, at have de samme miljømæssigt afhængige fitness effekter overvejes. Denne protokol vil gøre det muligt for folk rutinemæssigt at assay miljømæssige afhængigheder af mutation satser i mangfoldigheden af mikrobielle stammer og miljøer. Assaying mutationer i forskellige miljøer er endnu ikke blevet grundigt afprøvet, og når befolkningstætheden er overvejet, kan udsvings analyser give et mere præcist estimat af mutationsfrekvensen10. Denne protokol vil gøre det muligt at gennemføre flere udsvings analyser, som er nødvendige for forståelsen af de mekanismer, der understøtter Mutations rater, hvilket igen er afgørende for forståelsen af evolution, carcinogenese, aldring og antimikrobiel resistens.

Protocol

1. dag 1: inokulation og Akkliation af kulturer

  1. Der inokuleres 3 mL flydende lysogeny bouillon (LB, se supplerende tabel 1) med en skrabe af is fra E. coli MG1655 glycerol bestanden (18% glycerol,-80 °c). LB-kulturen rystes ved 120 rpm i ~ 7 timer ved 37 °C.
    Bemærk: I dette eksperiment anvendes e. coli K12 MG1655, der vokser i lb, men denne analyse kan udføres med enhver E. coli -stamme eller andre bakterielige mikrobielle arter. Inkubationstemperatur, inkubationstider og vækst mediers næringsstofniveau kan alle være genstand for variation efter art eller stamme.
  2. Fortynd kulturen 2.000-fold ved hjælp af saltvands opløsningen. Tilsæt 100 μL af den fortyndede opløsning til 3 50 mL skruelåg koniske bund polymer rør (50 mL rør) med 10 mL flydende Davis minimal medium (DM, se supplerende tabel 1), henholdsvis indeholdende 80 mg/l, 125 mg/l, eller 250 mg/l glucose. Dette er det samme medium (dvs. miljø), hvor mutationsfrekvensen vil blive anslået. Ryst kulturerne ved 120 rpm natten over ved 37 °C.
    Bemærk: Valget af medier er genstand for variation efter art, stamme, eller forskning spørgsmål.

2. dag 2: generering af mutanter i parallelle kulturer

  1. Først forberede de miljøer, hvor bakterierne vil blive dyrket. Forbered altid 10% mere end nødvendigt (dvs. tyve 1 ml kulturer kræver 22 mL). Forbered 22 mL af 1) DM med 80 mg/L glucose, 2) DM med 125 mg/L glucose, 3) DM med 250 mg/L glucose, 4) DM med 80 mg/L glucose, og 5) DM med 250 mg/L glucose i 5 50 mL rør. Mærk dem som henholdsvis GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B og GLC-250B.
  2. Forbered inocula til omgivelserne. Sørg for, at inokulum for 1 mL af miljøet indeholder 1000 − 5000 celler. Gør dette ved at følge nedenstående trin.
    1. Mål den optiske tæthed (OD) af overnight kulturer (fra trin 1,2) ved 600 nm.
    2. Fortynd hver dag kultur for at nå en endelig densitet på 1000-5000 celler pr. mL DM med glucose. I vores hænder, hvis OD målt i 2.2.1 er 0,3, dette betyder at gøre en 100-fold fortynding (i saltopløsning) af overnight kultur, derefter tilføje 11μl af denne opløsning til 22 mL miljø.
  3. Forbered parallelle kulturer.
    Bemærk:     denne protokol er skrevet til 1 96 Deep Well Plate, der udfører fem udsving assays (det maksimale rimelige antal på 1 96 brønd plade), ved hjælp af tre miljøer. Med erfaring, kan flere Deep-Well plader køres parallelt.
    1. Opret et tilfældigt layout af parallelle kulturer for 1 96 Deep Well Plate. Den supplerende R script LayoutGenerator. R (Se layoutet i figur 1B) kan bruges til dette. Placer hver parallel kultur på 96 Deep Well Plate i henhold til layoutet.
      Bemærk: Kørsel af LayoutGenerator. R vil sikre, at den første analyse har 20 parallelle kulturer, og at den anden, tredje, fjerde og femte assays har 19 parallelle kulturer hver.
    2. Overfør 1 mL inokulerede medier til hver brønd i en 96 dyb brønd plade i henhold til det randomiserede layout.
    3. Fastgør låget på den dybe brønd plade med båndet. Fastgør ikke låget stramt, fordi kulturen vækst er følsom over for mængden af beluftning.
    4. Hele pladen afvejes med låget og tapen, og pladen rystes ved 250 rpm i 24 timer ved 37 °C. Placer 2 L destilleret vand i inkubator for at stabilisere mængden af fordampning blandt eksperimentelle sæt.
  4. Den inokulum størrelse bestemmes ved at belægningen 10 μL af hvert af de inocyerede medier på den ikke-selektive tetrazolium (TA) agar plade (Se supplerende tabel 1). Brug en steril L-formet sprederen, indtil agar-overfladen er tør. Incubate TA agar plader låg ned natten over ved 37 °C.
    Bemærk: TA agar er en rig agar, der indeholder sukker L-Arabinose og det vandopløselige farvestof 2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchlorid, som er farveløs i sin oxiderede form. Når bakterier reducere farvestof, det bliver rødt på grund af dannelsen af formazan. Kolonier på TA agar, der ikke kan udnytte L-Arabinose, er mørkerød. Andre stammer, såsom MG1655, er pinkish. Brug af TA agar snarere end standard LB agar anbefales, fordi farvede bakterielle kolonier er lettere at spotte, hvilket gør koloni tælle mere pålidelige og hurtigere.
  5. Forbered selektiv TA agar indeholdende rifampicin i 6 brønd plader. 5 mL af den selektive TA-agar afpipetteres i hver brønd på de 6 brønd plader. Klargøre antibiotika rifampicin lige før det tilsættes til TA agar.
    Bemærk:     når cycloserin bruges som markør, skal du bruge Davis minimal medium med 250 mg/L glucose suppleret med agar og L-Arabinose og 2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchlorid som en selektiv agar. Nemlig, ta agar vælger ikke kun celler, der er resistente over for cycloserin, fordi trypton og gær ekstrakt (begge de væsentlige komponenter i TA agar) indeholder aminosyren D-alanin. Denne aminosyre antagonerer den antimikrobielle virkning af cycloserin og giver alle celler til at gøre en koloni.
    1. Efterlad de selektive og resterende ikke-selektive plader i mørke (f. eks. i en æske) ved stuetemperatur.

3. dag 3: overfladebelægning på selektive og ikke-selektive agarplader

  1. Tæl kolonidannende enheder (CFU) på de ikke-selektive agar plader og bestemme størrelsen af inocula ved at multiplicere CFU ved 100. Dette er et forhold mellem et volumen af parallel kulturen (1 mL = 1.000 μL) og den belagte volumen (10 μL).
    Bemærk: Hvis ikke-selektive plader opbevares nedkølet, kan CFU tælles senere.
  2. Efter 24 h inkubation, vejer hele dybe brønd pladen for at bestemme mængden af fordampning. Dette vil sandsynligvis være omkring 10%.
  3. Den gennemsnitlige mængde af en parallel kultur beregnes efter 24 timers inkubation (V[24h]) i mikroliter ved hjælp af en startvolumen V[0h] = 1.000 μl, og pladens vægt omdannes til mikroliter, hvor tætheden af vækstmediet måles i mg/μl. Denne undersøgelse anvender en densitet på 1 mg/μl:
  4. Overfør de tre tilfældigt valgte kulturer pr. analyse (15 i alt, fremhævet med en sort cirkel i layoutet i figur 1B) i mærkede mikrocentrifuge glas. Lad dem være på bænken, der skal bruges senere (Se trin 3,6) til bestemmelse af den endelige populationsstørrelse (eller Nt).
  5. De resterende 81 parallel kulturer fra den dybe brønd plade på den selektive TA agar indeholdende rifampicin. Pipetten en hel parallel kultur fra 96 Deep Well Plate i en brønd af en 6-brønd plade. Sørg for, at en 6-brønd plade indeholder parallelle kulturer fra mere end én udsvings analyse.
    1. Fjern lågene fra de selektive agarplader, og Efterlad udækkede under sterile forhold. Tør al væsken ud på overfladen af den selektive TA-agar.
      Bemærk: Agar er helt tør er kritisk. Du må dog ikke over tørre den selektive TA-agar, da den ikke skal kunne knække.
  6. Mens de selektive TA-agarplader tørrer, hvilket kan tage op til flere timer, bestemmes Nt af de 15 kulturer, der er fremstillet i trin 3,4 ved hjælp af KOLONIDANNENDE enheder (CFU).
    1. CFU bestemmes ved fortynding af kulturerne fra mikrocentrifuge rørene. Brug 5 10-fold fortyndings trin, blanding og vortexning 900 μL saltopløsning med 100 μL af kulturen på hvert trin. Plade 40 μL af den sidste fortynding (med en fortyndingsfaktor på 105) på den ikke-selektive ta agar og inkubatplader låg ned natten over ved 37 °c.
      Bemærk: Fortyndings serien i 96 brønd plader kan udføres med en multikanals pipette, som kan øge hastigheden på dette trin.
  7. Når alle brønde på en 6 brønd plade er fri for kulturen væske, sætte låget tilbage på og placere 6 brønd pladen med låget ned på bænken, indtil alle 6 brønd plader er tørre. Når alle er tørre, inkubatér pladerne låget ned ved 37 °C for 44-48 h.
    Bemærk: For andre markører (nalidixic Acid, cycloserin, hygromycin B, eller 5-FOA) inkuberes pladerne i 68-72 timer. Sørg for, at luftfugtigheden i inkubator er høj. Det er afgørende, at de selektive agarplader ikke tørrer ud i inkubationsperioden.

4. dag 4: bestemmelse af antallet af celler i kulturerne

  1. CFU tælles på de ikke-selektive agarplader. Beregn antallet af levedygtige celler i kulturen ved at multiplicere CFU med fortyndingsfaktoren (105) og forholdet mellem den beregnede gennemsnitlige volumen V[24h] i mikroliter (Se trin 3,3) og forgyldt volumen (40 μl):
  2. Nt af en bestemt genotype, der vokser i et bestemt miljø, er middelværdien af disse værdier fra de tre kulturer.

5. dag 5: vurdering af mutationsfrekvensen

  1. Antallet af kolonier, der er modstandsdygtige over for antibiotika på de selektive TA-agarplader (dvs. antallet af resistente celler, som opstod gennem spontan mutation i Deep-Well-pladen på dag 2 − 3). Registrer fordelingen mellem parallelle kulturer af det observerede antal mutanter for en bestemt analyse (f. eks. 16 eller 17 værdier, inklusive nultal).
    Bemærk:     hvis selektive plader opbevares nedkølet, kan kolonier, der er resistente over for antibiotika, tælles senere.
    1. Brug hver fordeling til at estimere antallet af mutationale hændelser, m, ved hjælp af R-pakken flan36.
      Bemærk: Der er også R-pakke rSalvador med lignende funktionalitet29.
    2. Gem fordelingen af de observerede mutanter til en analyse i en tekstfil som en enkelt kolonne.
  2. Brug Shinyflan software (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) til at anslå m som beskrevet nedenfor.
    1. I fane hypotesen test forlader værdier som standard (dvs. Ukendt fitness afkrydset, estimeringsmetode = maksimal sandsynlighed (ml), fordeling af mutant levetid = eksponentiel (LD model) , Winsor parameter = 1.024, Mutation Number og fitness = 1, konfidensniveau = 0,95, antal klasse og maksimal værdi = 100).
    2. Klik på Gennemse , og vælg tekstfilen med fordelingen af observerede mutanter. Prøv først med den supplerende datafil.
    3. Efter upload af filen, klik på Udfør test. På højre side under resultatet af testen, under den ene prøve ml-test (LD model), finde mutation nummer. Dette er m, det forventede antal af mutationale hændelser.
    4. Under 95 procent konfidensintervallet for Mutations tallet finder du den øvre og nedre grænse for m.
  3. Når m og Nt (bestemt af CFU) er tilgængelige, estimerer du mutationsfrekvensen for en bestemt genotype i et bestemt miljø som. Opdel de øvre og nedre grænser på m ved nt på samme måde for at generere konfidensintervaller på mutationsfrekvensen (NB. Dette er ikke i betragtning af usikkerheden i nt).
    Bemærk: Resultaterne præsenteres som mutationsfrekvensen pr. Rpob -locus pr. generation. Mutationsfrekvensen pr. basispar genereres ved at dividere Mutations raten pr. rpob locus med 79, hvilket er vores nuværende viden om, hvor mange punktmutationer i et rpob -gen, der giver resistens over for rifampicin37. Multiplicere Mutations raten pr. nukleotid med størrelsen af kromosom (E. coli K-12 MG1655 = 4.639.675 BP), giver Mutations raten pr. genom.
  4. Gentag trin 5.1 − 5.3 med de resterende fire udsvings analyser.

Representative Results

Resultaterne blev samlet med den rapporterede protokol i fire forskellige uger af tre forskellige individuelle forskere, hvor hver uge en 96 dyb brønd plade blev brugt til at generere fem Mutations rate estimater. I alt 3 96 dybe brønd plader genereret 15 Mutations rate estimater (± 95% konfidensinterval, CI) i e. coli k-12 MG1655 (figur 2A, som anvendt i protokollen), mens 1 96 Deep Well Plate blev anvendt til fem estimater (± 95% CI) af e. coli k-12 BW25113 ΔMutt mutant (figur 2B). I figur 2 er median præcisionen med interkvartil intervallet for estimering m 17,5% (1,00% − 28,9%, n = 20). Præcision er en koefficient for variationen af det forventede antal mutationale hændelser (m) beregnet som σm / m x 100% (hvor σ er beregnet som vist tidligere38). Rå data for figur 2 findes i den supplerende datafil "Krasovec_etal_JoVE_data. csv". Den supplerende datafil ledsages af et R-script til at generere figur 2. Se også supplerende tabel 2 for yderligere oplysninger om bakteriestammer og supplerende tabel 3, hvor kolonnerne i datafilen forklares. Data punkter erhvervet med rifampicin og nalidixinsyre syre blev tidligere offentliggjort i krašovec et al.10 og har de samme id'er her, som da de blev offentliggjort første.

I figur 2A præsenteres MG1655-Mutations raten for tre forskellige fænotypiske markører, cycloserin, rifampicin og nalidixinsyre. Her blev Mutations raterne vurderet i Davis minimal medium med 80, 125 og 250 mg/L glucose, som forklaret i protokollen. I et tilfælde blev 1.000 mg/L glucose anvendt (figur 1B). I praksis kan enhver Initial glukose koncentration anvendes. Som forventet var mutationsfrekvensen højere for cycloserinresistens, lavest for nalidixinsyre resistens, og satsen for rifampicin resistens var i midten. Dette er i overensstemmelse med de kendte mål størrelser for disse tre modstande, hvor den største er for cycloserin og den mindste for nalidixinsyre syre. Diskussionen og figur 3 giver oplysninger om, hvordan man udnytter målstørrelserne, mængderne af parallelle kulturer og niveauet af næringsstoffer i miljøet for at optimere målingen af mikrobielle Mutations rater med udsvings analysen.

Udsvings analysen viser tydeligt, hvilken stamme der er en konstitutiv Mutator, og som har normale Mutations rater. ΔMutt -stammen havde en ca. 50x højere Mutations rate til nalidixinsyre resistens (figur 2B) som MG1655 (figur 2A). For at bestemme mutationsfrekvensen for en bestemt genotype i forskellige miljøer anbefales det dog at udføre mindst fem replikater pr. genotype pr. miljø med kun én fænotypisk markør. For en detaljeret beskrivelse af de statistiske metoder, der tidligere er anvendt til at analysere denne type eksperiment, se de supplerende oplysninger i Krašovec et al.10.

Figure 2
Figur 2: repræsentativt tal for Mutations rater anslået ved udsvings analysen i Escherichia coli -populationer. A) Mutations raten som bestemt af den rapporterede protokol i vildtype MG1655 (cirkler). Figuren viser Mutations raterne i nærværelse af rifampicin (lyseblå cirkler), nalidixinsyre (røde cirkler), og cycloserin (mørkeblå cirkler) modstand. For nalidixinsyre blev der anvendt større dyrknings mængder på 10 mL (Se supplerende datafil). Data for rifampicin og nalidixinsyre er replotteret fra figur 2a i krašovec et al.10. B) mutationsfrekvensen for nalidixinsyre resistens i Keio39 ΔMutt mutant (røde trekanter). Bemærk den logaritmiske skala på Mutations sats aksen. Fejllinjer = 95% konfidensintervaller beregnet som forklaret i protokollen. Data er replotteret fra figur 4a i krašovec et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: et rutediagram til fejlfinding af udsvings analysen. Rutediagrammet skal følges fra toppen, adressere de tre spørgsmål i de gule diamanter til gengæld, justering af protokollen i henhold til indholdet af de resulterende grønne bokse, og gennemførelse af protokollen som angivet i de røde ovals. Se de første tre afsnit i diskussionen for at få flere oplysninger om, hvordan du foretager fejlfinding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: formler for de medier, der anvendes i protokollen. Venligst klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Supplerende tabel 2: bakteriestammer. Venligst klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Supplerende tabel 3: detaljeret beskrivelse af kolonnerne i RAW-datafilen Krasovec_etal_JoVE_data. csv. Venligst klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Supplerende data filer. Venligst klik her for at downloade disse filer.

Discussion

Ethvert estimat af en Mutations hastighed skal maksimere den opnåede præcision for at sikre repeterbarhed og reproducerbarhed i og mellem studierne34. For en udsvings analyse er der tre kritiske overvejelser. De første to er blevet sat i den givne protokol, men vil have brug for fejlfinding (Se figur 3), hvis protokollen er tilpasset til at arbejde med forskellige stammer eller miljøer. Først er at vælge den relevante fænotypiske markør. For bakterier anbefales det at anslå satser ved en af to markør loci, rpob eller Gyra, hvilket giver resistens over for antibiotika rifampicin og nalidixinsyre syre. Målet størrelse for mutationer til antibiotikaresistens på disse to loci er anderledes. Der er 79 og 20 unikke mutationer, som giver resistens over for rifampicin37 og nalidixinsyre40 hhv. I praksis betyder det, at i gennemsnit, rifampicin resistente mutanter er hyppigere observeret. Så det første spørgsmål (Q1 i figur 3), der skal besvares, er, om stammen er en Mutator. Når konstitutiv mutatorer er undersøgt, hvor mange observerede mutant kolonier forventes, er det bedre at bruge en markør med en mindre Målstørrelse (f. eks. nalidixinsyre). Se figur 2B, hvor mutationsfrekvensen for den konstitutive Mutator E. coli K-12 BW25113 ΔMutt blev anslået ved hjælp af nalidixinsyre som markør. Ved arbejde med nonmutator bakteriestammer, der har en vildtype (dvs. normal) mutation sats, rifampicin er et bedre valg (Se figur 2a). Hvis der af en eller anden grund er behov for mere observerede mutanter, er en relevant markør resistens over for en cycloserin. Til denne markør kan resistens mutationer dukke op i mere end ti gener41, hvilket betyder, at målstørrelsen er endnu større end for rifampicin. Når man studerer gær og archaea anbefales det at estimere Mutations rater i 25S ribosomale proteiner og URA3, hvilket giver resistens over for hygromycin B og 5-fluoro-orotic Acid (5-FOA) hhv.

Den anden kritiske overvejelse er mængden af parallelle kulturer. Hvilken mængde, der skal bruges, afhænger af det faktiske antal observerede mutanter. Det forventede antal observerede mutanter påvirkes af målstørrelsen for den valgte fænotypiske markør, stammens evne til at reparere og undgå mutationer (den gennemsnitlige Mutations Rate) og miljøets bæreevne, som påvirkes både af de anvendte medier og kultur volumenet. Hvis ingen parallel kulturer indeholder mutant kolonier, der er resistente over for rifampicin, skal cycloserin anvendes, eller antallet af belagte celler bør øges. Dette kan opnås ved at tilføje mere glukose til et minimalt medium eller ved at dyrke celler i et rigere (eller komplet) miljø. Men i mange tilfælde er en sådan stigning i befolkningstætheden forbundet med en reduktion i mutationsfrekvensen, hvilket resulterer i begrænset, om nogen, stigning i antallet af mutante kolonier observeret10. Hvis stigende næringsstoffer ikke er en løsning, så øge antallet af celler ved at øge mængden af hver parallel kultur er en mulighed. Når miljøet omfatter minimale salte med sukker som den eneste kilde til kulstof og energi (dvs. svaret på Q2 i figur 3 er "minimal medium"), bør der anvendes mængder mellem 0,5 og 1,5 ml. Hvis miljøet er rigt, skal mængderne af parallelle kulturer være mellem 0,35 − 1 mL. Det sidste spørgsmål vedrører median antallet af resistente kolonier. Hvis der observeres for få mutante kolonier (dvs. svaret på Q3 i figur 3 er 0), og miljøet ikke skal ændres, bør mængden af parallelle kulturer øges, eller antibiotika med en større Målstørrelse (f. eks. cycloserin) bør anvendes. Hvis der på den anden side observeres mange mutante kolonier på alle selektive plader (mere end ~ 150 pr. plade, se figur 3), bør antallet af belagte celler nedsættes, hvilket normalt betyder, at der anvendes et lavere volumen eller skiftes til et antibiotikum med en mindre Målstørrelse (f. eks. nalidixinsyre).

Når lydstyrken er valgt, er det bedst, at alle parallelle kulturer på 1 96 Deep Well Plate har samme volumen. Det giver mulighed for en mere præcis bestemmelse af den faktiske mængde af parallel kulturer fra vægten af pladen. Når Mutations rater for en bestemt genotype sammenlignes mellem forskellige miljøer, er det igen bedst at bruge det samme volumen af parallelle kulturer i alle miljøer. Hvis nalidixinsyre anvendes til estimering af vildtype (dvs. normale) Mutations rater, eller der anvendes en anden fænotypisk markør, som har en endnu mindre Målstørrelse end nalidixinsyre, skal volumenet øges endnu mere. En mulighed er at gøre parallel kulturer i 50 mL rør med volumener på op til 15 mL. For eksempel blev 10 mL parallel kulturer fremstillet i 50 mL rør ved estimering af E. coli K-12 MG1655-Mutations raten til nalidixinsyre (Se figur 2A). De parallelle 10 mL kulturer blev derefter belagt på den selektive TA agar og hældes i store 150 mm plader i stedet for standard 90 mm Petri skåle. Ulempen ved at forberede parallelle kulturer i 50 ml rør er, at gennemstrømningen er betydeligt lavere sammenlignet med bestemmelse mutation satser i en 96 dyb brønd plade. En løsning er at mindske antallet af parallelle kulturer. Dette vil dog påvirke præcisionen for estimatet af m, som afhænger af det forventede antal mutationelle hændelser og antallet af parallelle kulturer26. Opnåelse af en fordeling af observerede mutanter med 14 − 17 parallelle kulturer (som det blev gjort i figur 2), er en god balance mellem en solid gennemløb og et acceptabelt præcisionsniveau26 på 20%. Et median præcisionsniveau på 17,5% svarer til median præcisionen med et interkvartil område på 16,4% (5,7% − 38.9%, n = 580) beregnet ud fra et meget større datasæt10. Det anbefales således, at når man forbereder parallelle kulturer i 96 dybe brønd plader eller 50 mL rør, opnås fordelingen af observerede mutanter med mindst 14 parallelle kulturer. Når Mutations rater anslås i forskellige miljøer, anbefales det at teste præcisionsniveauerne ved at lave et multiplate eksperiment, hvor alle 96 parallelle kulturer på én plade dyrkes i samme miljø. Hertil kommer, når man forbereder parallelle kulturer, det er vigtigt, at inocula indeholder et lavt antal celler, fordi det reducerer chancerne for eventuelle resistente celler er til stede i inoculum. Allerede eksisterende resistente mutanter er ikke ønsket i inoculum, fordi de vil stige i antal og skabe en græsplæne på selektive plader og vurdering af mutation sats vil ikke være muligt. For eksempel, i de fleste nonmutator E. coli populationer, mutation sats til rifampicin resistens er i rækkefølgen ~ 10-8. For at undgå at inokulere kulturen med en allerede eksisterende resistent mutant skal man således inokuleres med færre end 108 celler (f. eks. 103− 104 celler). Det sidste kritiske trin er at sikre, at overfladen på den selektive agar er helt tør, før selektive agar-plader inkuberet. Spredere kan ikke anvendes, hvis der anvendes 6-brønd plader, og den oprindelige volumen af en parallel kultur er 1 mL f. eks. Pladerne skal være udækkede under sterile forhold for at lade overflade væsken tørre ud. Den tid, det tager, kan være meget varierende, afhængig af omgivende forhold og tilstanden af pladerne. Denne gang bør minimeres, men kan være op til flere timer.

Udsvings analysen har iboende begrænsninger. Det assays fænotypiske markører for mutation kun i en lille delmængde af genomet. Analysen kræver derfor store populationer, der går gennem et tilstrækkeligt antal generationer til at observere nok mutationer til at estimere en sats på alle. Det betyder, at udsving assays kun kan anvendes på organismer, der er i stand til at gå gennem et stort antal generationer hurtigt, ligesom bakterier, bager gær42, eller flydende-kultur pattedyrceller30. Også, mutationer er sjældne hændelser, der forekommer i de specifikke biokemiske forhold i en bestemt celle. Det forhold, at udsvings analyser ser ud på tværs af store populationer af celler over tid, betyder, at disse omstændigheder kan variere betydeligt. Ved hjælp af denne analyse er det derfor vanskeligt at studere progressionen af Mutations rater for en bestemt population fra lag-fasen til tidlig og sen eksponentiel fase og endelig til en stationær fase. Enhver differentiering af Mutations rater blandt enkeltceller i populationen er fuldstændig skjult for udsvings analysen. Single-celle mutation dynamik kan undersøgt med en enkelt-molekyle sporing af DNA reparation protein MutS43 eller ved at tælle Foci af akkumulerede mutl proteiner44. De seneste fremskridt i sekvensering med høj gennemløb har også gjort det muligt direkte at estimere Mutations rater fra Trios9,45 og multigene rations Stam fra moder-afkom46. Sådanne metodologiske fremskridt er begyndt at tillade direkte optælling af mutationer, der forekommer i en enkelt generation. Men denne direkte tilgang har brug for dyre og state-of-the-art teknologier som Fluorescens mikroskopi, microfluidics eller hel-genomsekvensering. På den anden side er udsvings analysen relativt billig, og der er kun behov for Standardlaboratorieudstyr. At gøre flere udsving assays vil også lette generering af nye hypoteser, der kan testes med mere direkte enkelt celle tilgange.

Der er en langvarig interesse i studiet af mutationer, så udsvings analysen vil sandsynligvis forblive en meget anvendt metode. Antallet af citater af det skelsættende papir af Luria og Delbrück5 i de sidste 4 år (2015-2018) har alle været blandt de fem bedste for citater af dette papir. Men på grund af en stor mængde af præcise manuelle arbejde, der er nødvendige for korrekt udførelse af en udsvings analyse, de fleste undersøgelser kun foretage en håndfuld udsving assays. Dette er imidlertid utilstrækkeligt til at afsløre de miljømæssige afhængigheder af mutationsfrekvensen. Ved at strømline udsvings assays ved hjælp af multiwell Plates, som forklaret i dette papir, er den nuværende maksimale gennemløb mulig 11 dybe brønd plader (55 udsving assays) parallelt, som beskrevet her. Kørsel af to sæt udsvingingassays forskudt af en dag parallelt, gør det muligt at udføre op til 110 assays pr. uge. En anden trin ændring i gennemløb kan endnu være muligt ved at automatisere forskellige trin i udsvings assays fra den rent manuelle protokol givet. For at studere de miljømæssige afhængigheder af mutationsfrekvensen skal der også tages hensyn til befolkningstætheden. Tidligere resultater10 viser, at når kendte faktorer, der påvirker mutationsfrekvensen, bogføres, kan kontrol af befolkningstætheden reducere variationerne i beregningerne af Mutations raten med mere end 90%. For at kontrollere tætheden anbefaler vi, at Nt (anvendes til estimering af Mutations raten) bestemmes uafhængigt af den metode, der anvendes til at bestemme befolkningstætheden. I bakterier kan Nt bestemmes af CFU og tæthed, for eksempel med en ATP-baseret luminescens analyse10.

Høj gennemløb og kontrol tæthed er begge vigtige, når man studerer, hvordan en organismes økologiske kontekst påvirker spontan mutationsfrekvens. Kendskab til forekomsten af mutation sats plasticitet er vigtig, men forståelse af dens årsager og virkninger er centrale udfordringer, der skal opfyldes, hvis mutation sats plasticitet skal inkorporeres i en bredere biologisk kontekst. Udsvings analysen er et fantastisk værktøj, der kan bruges til at teste mange hypoteser, fordi resultaterne opnås hurtigt, og assays er billige i forhold til andre metoder. Scenen er sat, for eksempel, at studere miljømæssige afhængigheder af mutation sats i bakteriel samfund og mikrobiomer. Tilpasning af udsvings analysen til cocultures kan teste hypotesen om, at stammer påvirker hinandens Mutations rater via små molekyler. At gøre tusindvis af udsving assays med cocultures kan afgøre, om stammer varierer både i deres evne til at ændre hinandens mutation satser og i deres modtagelighed for at have deres mutation sats modificeret af andre. Måske kan variationer blandt stammer i modtagelighed over for mutation rate manipulation tilskrives specifik genetisk variation. Dette kan ændre vores syn på, hvordan Evolution fungerer i komplekse samfund, ikke mindst i eksempler af stor betydning, såsom hvordan antimikrobiel resistens opstår.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

RK blev støttet af BB/M020975/1 og University of Manchester School of Biological Sciences. HR blev støttet af BB/J014478/1. GG blev støttet af BBSRC ph. d.-UDDANNELSESPARTNERSKAB BB/M011208/1. DRG blev støttet af UKRI Award nummer MR/R024936/1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge tubes Starlab International GmbH S1615-5550
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877-10g
6-well plates Greiner Bio-One REF 657102
90 mm Petri Dishes Triple Vented ThermoFisher Scientific REF 120189
96 deep-well plate (Masterblock 2 mL) Greiner Bio-One REF 780270
Ammonium sulfate Fisher Chemical A/6440/53
Bacto Agar Becton, Dickinson and Company REF 214010
Bacto yeast extract Becton, Dickinson and Company REF 212750
Cycloserine Sigma-Aldrich 1158005-250MG Only for assaying an alternative phenotypic marker
D-Glucose anhydrous Fisher Chemical G/0500/61
50 mL Centrifuge Tube Corning REF 430828
L-(+)-Arabinose Sigma-Aldrich A3256-500g
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Chemical M/1050/53
Nalidixic acid Sigma-Aldrich N8878-5G Only for assaying an alternative phenotypic marker
Potassium phosphate dibasic trihydrate Sigma-Aldrich P5504-500g
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662-500g
Rifampicin EMD Millipore Corp, USA 557303-1GM
Sodium chloride Fisher Chemical S/3160/60
Spectophotometer Jenway 6320D
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625-25g
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804-500g
Tryptone Fisher Chemical 1278-7099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Vries, H. Die mutationstheorie. Versuche und beobachtungen über die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, Leipzig, Veit. (1901).
  2. Muller, H. J. Artificial transmutation of the gene. Science. 66 (1699), (1927).
  3. Muller, H. J. The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature. Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).
  4. Sturtevant, A. H. Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate. The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).
  5. Luria, S. E., Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).
  6. Jee, J., et al. Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing. Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).
  7. Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbrück experiments. Nature Communications. 7, (2016).
  8. Halligan, D. L., Keightley, P. D. Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).
  9. Jónsson, H., et al. Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland. Nature. 549, (2017).
  10. Krašovec, R., et al. Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life. PLoS Biology. 15 (8), (2017).
  11. Krašovec, R., et al. Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions. Nature Communications. 5, 3742 (2014).
  12. Massey, R. C., Buckling, A. Environmental regulation of mutation rates at specific sites. Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).
  13. Lynch, M., et al. Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate. Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).
  14. Foster, P. L. Stress-induced mutagenesis in bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).
  15. Krašovec, R., et al. Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing. Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).
  16. Krašovec, R., et al. Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate. The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).
  17. Lea, D., Coulson, C. The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations. Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).
  18. Armitage, P. The statistical theory of bacterial populations subject to mutation. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).
  19. Koch, A. L. Mutation and growth rates from Luria-Delbrück fluctuation tests). Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).
  20. Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. The origin of mutants. Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).
  21. Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions. Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).
  22. Drake, J. W. A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).
  23. Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. Analysis of the Luria-Delbrück distribution using discrete convolution powers. Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).
  24. Shapiro, J. A. Adaptive mutation - Who's really in the garden. Science. 268 (5209), 373-374 (1995).
  25. Matic, I., et al. Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli. Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).
  26. Rosche, W. A., Foster, P. L. Determining mutation rates in bacterial populations. Methods. 20 (1), 4-17 (2000).
  27. Rosenberg, S. M. Evolving responsively: Adaptive mutation. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).
  28. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).
  29. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbrück protocol. Mutation Research. 781, 7-13 (2015).
  30. Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells. Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).
  31. Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. The fitness costs of antibiotic resistance mutations. Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).
  32. Sun, L., et al. Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability. PLoS Biology. 16 (2), (2018).
  33. Frenoy, A., Bonhoeffer, S. Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria. PLoS Biology. 16 (5), (2018).
  34. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).
  35. Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. Accumulation of mutants in "aging" bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).
  36. Adrien, M., Rémy, D., Stéphane, D., Bernard, Y. flan: An R package for inference on mutation models. The R Journal. 9. 334, (2017).
  37. Garibyan, L., et al. Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome. DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).
  38. Stewart, F. M. Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates? Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).
  39. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).
  40. Yamagishi, J. -I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli. Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).
  41. Chen, J., et al. Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).
  42. Lang, G. I., Murray, A. W. Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).
  43. Uphoff, S., et al. Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation. Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).
  44. Robert, L., et al. Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells. Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).
  45. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father/'s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
  46. Narasimhan, V. M., et al. Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes. Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).

Tags

Genetik spontane mutationer mutation rate plasticitet stress-induceret mutagenese Luria-Delbrück fordeling maksimal sandsynlighed estimator celle-celle interaktioner antimikrobiel resistens bakterier
Måling af mikrobielle Mutations rater med udsvings analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krašovec, R., Richards, H.,… More

Krašovec, R., Richards, H., Gomez, G., Gifford, D. R., Mazoyer, A., Knight, C. G. Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay. J. Vis. Exp. (153), e60406, doi:10.3791/60406 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter