Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل المجموعة الرابعة SSHHPS الفيروسية باستخدام في المختبر وأساليب Silico

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60421
Automatic Translation
1, 2, 2
1National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, 2United States Naval Research Laboratory

Summary

نقدم بروتوكولا عاما لتحديد فترات قصيرة من متواليات بروتين المضيف المسبب للمرض (SSHHPS) المضمنة في بوليبروتين الفيروسي. يتم التعرف علي SSHHPS من قبل بروتينيه الفيروسية وتوجيه التدمير المستهدف من البروتينات المضيفة محدده من قبل العديد من الفيروسات المجموعة الرابع.

Abstract

يتم توليف الانزيمات الفيروسية في ببتيد واحد. يتم معالجه بوليبروتين غير الهيكلية (nsP) بواسطة البروتياز nsP2 السيستين لإنتاج الانزيمات النشطة الضرورية للنسخ المتماثل الفيروسية. بروتينيه الفيروسية هي محدده للغاية والاعتراف المحفوظة الانقسام عزر موقع التسلسل (~ 6-8 الأحماض الامينيه). في العديد من الفيروسات في المجموعة الرابعة ، يمكن العثور علي متواليات الموقع الانشقاق البروتيني nsP في البروتينات المضيفة المحددة المشاركة في توليد الاستجابات المناعية الفطرية ، وفي بعض الحالات ، يبدو ان البروتينات المستهدفة مرتبطة بالنمط الظاهري المستحث بالفيروس. تستخدم هذه الفيروسات مسافات قصيرة من متواليات بروتين المضيف المسبب للمرض (SSHHPS) للتدمير المستهدف للبروتينات المضيفة. لتحديد SSHHPS الفيروسية البروتيني الانقسام عزر الموقع يمكن إدخالها في الانفجار والجينوم المضيف (ق) يمكن البحث. الانقسام في البداية يمكن اختبارها باستخدام nsP المنقي الفيروسية والفلورية الرنين نقل الطاقة (الحنق) ركائز المحرز في e. القولونية. وتحتوي ركائز التاكل علي بروتين فلوري ازرق سماوي واصفر وتسلسل موقع الانشقاق (التسلسل الرقمي المتسلسل-YFP). ويمكن استخدام هذا الفحص البروتيني بشكل مستمر في قارئ لوحه أو بشكل متقطع في الهلام SDS-PAGE. ويمكن توليد نماذج من ركائز الببتيد ملزمه في سيليكو لتوجيه اختيار الركيزة والدراسات الطفرات. وقد استخدمت أيضا ركائز الباسيفيكي/YFP لتحديد مثبطات الانزيم البروتيني. ويمكن استخدام هذه في المختبر وأساليب سيليكو في تركيبه مع الاختبارات القائمة علي الخلايا لتحديد ما إذا كان البروتين المضيف المستهدفة يؤثر علي النسخ المتماثل الفيروسية.

Introduction

دليل علي نقل الجينات الأفقي من الفيروس إلى المضيف ، أو المضيف للفيروس ، يمكن العثور عليها في مجموعه متنوعة من الجينوم1،2،3،4. أمثله من اندوجينوشن الفيروسية هي سلاسل الفاصل CRISPR وجدت في الجينوم المضيف البكتيرية4. في الاونه الاخيره ، وجدنا أدله علي تسلسل البروتين المضيف جزءا لا يتجزا من البروتينات المتعددة غير الهيكلية من (+) الفيروسات المجموعة الرابعة أسا نا. ويمكن نشر هذه المتواليات داخل مناطق الترميز من الجينوم الفيروسي بصفه عامه. يتم العثور علي امتدادات قصيرة من متواليات بروتين المضيف الذاتية (sshhps) في الفيروس والمضيف5,6. Sshhps هي تسلسل عزر موقع الانقسام المحفوظة المعترف بها من قبل بروتينيه الفيروسية التي لديها التنادد للبروتينات المضيف محدده. هذه المتواليات مباشره تدمير البروتينات المضيفة المحددة.

في المنشور السابق6، قمنا بتجميع قائمه بجميع البروتينات المضيفة التي استهدفتها البرواسات الفيروسية ووجدت ان قائمه الأهداف كانت غير عشوائية (الجدول 1). وقد ظهر اتجاهان. أولا ، ان غالبيه البروبروتياسات الفيروسية التي قطعت البروتينات المضيفة تنتمي إلى فيروسات المجموعة الرابعة (24 من 25 حاله تتعلق بالمجموعة الرابعة من البرواسات الفيروسية) ، وينتمي أحد البروتياز إلى فيروس العوز المناعي البشري (+) المجموعة السادسة للفيروسات الرجعية (HIV). ثانيا ، كانت أهداف البروتين المضيف التي يتم قطعها بواسطة البرواسات الفيروسية تشارك عموما في توليد الاستجابات المناعية الفطرية مما يوحي بان الانقسامات كانت تهدف إلى معاداه الاستجابات المناعية للمضيف. وكان نصف البروتينات المضيفة التي تستهدفها البرواسات الفيروسية مكونات معروفه من السلاسل التعاقبية التي تولد مضادات الفيروسات (IFN) والخلوية التهابيه (الجدول 1). وشاركآخرون فينسخ الخليةالمضيفة8أو9أو10 أو الترجمة11. ومن المثير للاهتمام, وقد أظهرت شماكوف et al.4 ان العديد من المتواليات protospacer كريسبر تتوافق مع الجينات المشاركة في الاقتران البلازميد أو النسخ المتماثل4.

وتشمل المجموعة الرابعة ، من بين أمور أخرى ، فلافيريداي ، وبيكورنافريداي ، والكورونا التاجية ، والكالسيفيريد ، والتوافيريداي. وينتمي العديد من مسببات الامراض الجديدة والناشئة إلى المجموعة الرابعة مثل فيروس زيكا ، وغرب النيل ، وشيكونغونيا (CHIKV) ، وفيروس المتلازمة التنفسية الحاده الوخيمة (سارس) ، وفيروس متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS). (+) الجينوم أسا نا هو أساسا قطعه من mRNA. لإنتاج الانزيمات اللازمة للنسخ المتماثل الجينوم ، يجب ان تترجم (+) الجينوم أسانا أولا. في الفيروسات الفا وغيرها من الفيروسات المجموعة الرابعة ، يتم إنتاج الانزيمات اللازمة للنسخ المتماثل في بوليبروتين واحد (اي ، nsP1234 ل VEEV). والبروتينات غير الهيكلية (nsP) هي معالجه بروتينيه (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) من قبل الانزيم البروتيني nsP2 لإنتاج نشطه12 (الشكل 1). انشقاق بوليبروتين من قبل البروتياز nsP2 ضروري للنسخ المتماثل الفيروسية. وقد ثبت هذا عن طريق الحذف والطفرات الموجهة إلى الموقع من السيستين الموقع النشط من nsP2 البروتياز13,14. وعلي وجه الخصوص ، فان ترجمه البروتينات الفيروسية تسبق احداث النسخ المتماثل الجينوم. علي سبيل المثال ، يحتوي nsP4 علي البوليميجين الRNA التابع للجيش الريبي النيبالي الذي يحتاج إلى تكرار (+) جينوم أسا نا. يمكن ان تنتج النسخ المتماثل الجينوم وسيطه dsRNA; هذه الوسيطة يمكن ان تؤدي إلى الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف. وهكذا, هذه الفيروسات قد يلتصق المضيف البروتينات استجابه المناعية الفطرية في وقت مبكر من العدوى من أجل قمع اثارها15,16,17.

يمكن ان يحدث إسكات علي مستوي الحمض النووي ، RNA ، والبروتين. ما هو شائع لكل من أليات إسكات المبينة في الشكل 1 هو ان الحمض النووي الأجنبي قصيرة ، RNA ، أو تسلسل البروتين تستخدم لتوجيه تدمير أهداف محدده لمعاداه وظيفتها. وتتشابه أليات إسكات الأصوات في برامج "البحث والحذف" التي كتبت بثلاث لغات مختلفه. يماثل تسلسل موقع الانشقاق القصير "الكلمة الرئيسية". يحتوي كل برنامج علي انزيم يتعرف علي التطابق بين التسلسل القصير ("الكلمة الرئيسية") وكلمه في "الملف" الذي سيتم حذفه. وبمجرد العثور علي المباراة ، والتخفيضات انزيم ("يحذف") تسلسل الهدف أكبر. وتستخدم أليات الثلاث المبينة في الشكل 1 للدفاع عن المضيف من الفيروسات ، أو للدفاع عن فيروس من الجهاز المناعي للمضيف.

بروتينيه الفيروسية الاعتراف قصيرة الانشقاق عزر الموقع بين ~ 2-11 الأحماض الامينيه; في [نوكليودس], يماثل هذا إلى 6-33 قواعد. للمقارنة, [كريبر] فاصل تسلسل [~ 26-72 [نوكليودس] و [رناي] ~ 20-22 [نوكليودس]18,19. وفي حين ان هذه التسلسلات قصيرة نسبيا ، فانه يمكن التعرف عليها علي وجه التحديد. ونظرا للتنوع العالي للأحماض الامينيه ، فان احتمال حدوث انشقاق عشوائي منخفض نسبيا بالنسبة للبروتيز الفيروسي الذي يميز بين تسلسل البروتين من الأحماض الامينيه 6-8 أو أطول. التنبؤ SSHHPS في البروتينات المضيفة سوف تعتمد إلى حد كبير علي خصوصية الانزيم البروتيني الفيروسي يجري فحصها. إذا كان الانزيم البروتيني لديه متطلبات محدده تسلسل صارمة فرصه العثور علي تسلسل موقع الانشقاق هو 1/206 = 1 في 64,000,000 أو 1/208 = 1 في 25,600,000,000; ومع ذلك ، معظم بروتينيه لديها تفاوت التحمل الفرعي (علي سبيل المثال ، R أو K قد يكون التسامح في موقع S1). التالي ، لا يوجد شرط للهوية المتسلسلة بين التسلسلات الموجودة في المضيف مقابل الفيروس. للبروتينات الفيروسية التي لديها متطلبات تسلسل أكثر مرونة (مثل تلك التي تنتمي إلى Picornaviridae) احتمال العثور علي موقع الانشقاق في البروتين المضيف قد تكون اعلي. العديد من المدخلات في الجدول 1 هي من عائله Picornaviridae .

Schechter & بيرغر التدوين20 يستخدم عاده لوصف البقايا في الركيزة البروتيني والمواقع الفرعية التي تربط ، ونحن نستخدم هذا التدوين في جميع انحاء. ويشار إلى البقايا في الركيزة التي هي N-الطرفية للسندات سسيسيلي ك P3-P2-P1 في حين ان تلك التي هي C-الطرفية هي المشار اليها باسم P1'-P2'-P3 '. المواقع الفرعية المقابلة في البروتياز التي تربط هذه بقايا الأحماض الامينيه هي S3-S2-S1 و S1'-S2' ' ، علي التوالي.

لتحديد البروتينات المضيفة التي يتم استهدافها ، يمكننا تحديد SSHHPS في المواقع الفيروسية الانقسام بوليبروتين والبحث عن البروتينات المضيفة التي تحتوي عليها. هنا, نحن الخطوط العريضة لإجراءات لتحديد SSHHPS باستخدام المعروفة الفيروسية البروتيني الانقسام موقع تسلسل. والغرض من أساليب المعلوماتية الحيوية ، واختبارات الانزيم البروتيني ، وأساليب السيبيكو الموصوفة ، هو استخدامها بالاقتران مع الاختبارات القائمة علي الخلايا.

وقد كشفت محاذاة تسلسل البروتينات المضيفة التي تستهدفها البرواسات الفيروسية الاختلافات الخاصة بالأنواع داخل هذه التسلسلات القصيرة لموقع الانشقاق. علي سبيل المثال ، تم العثور علي فيروس التهاب الدماغ الفروسية الفنزويلي (VEEV) nsP2 البروتياز لخفض TRIM14 الإنسان ، وهو الثلاثي عزر (تريم) البروتين6. بعض البروتينات تريم هي عوامل التقييد الفيروسية (علي سبيل المثال ، TRIM5α21) ، ويعتقد معظم ان تكون اوبيكويتين E3 ligases. TRIM14 يفتقر إلى عصابه (الجينات الجديدة مثيره للاهتمام حقا) المجال ولا يعتقد ان يكون E3 يغاز22. وقد اقترح TRIM14 ليكون محول في signalosome المضادة للفيروسات الميتوكوندريا (مافس)22، ولكن قد يكون الوظائف المضادة للفيروسات الأخرى23. محاذاة تسلسل TRIM14 من الأنواع المختلفة يظهر ان الخيول تفتقر إلى موقع الانشقاق والميناء نسخه مقتطعه من TRIM14 التي تفتقد المجال C-الطرفية PRY/SPRY. يحتوي هذا المجال علي موقع polyubiاسكيتامييشن (الشكل 2). في الخيول ، وهذه الفيروسات هي قاتله للغاية (~ 20-80 ٪ وفيات) في حين ان في البشر فقط ~ 1 ٪ يموتون من العدوى VEEV24. قد انشقاق المجال حدق/SPRY عابره دائره قصيرة الإشارات MAVS تتالي. يمكن ان يتم تشغيل هذا التتالي من قبل dsRNA ويؤدي إلى إنتاج السايتوكينات مضاده للفيروسات والموالية للالتهابات. التالي ، قد يكون وجود SSHHPS مفيدا للتنبؤ بالأنواع التي لديها أنظمه دفاعيه ضد فيروسات معينه من المجموعة الرابعة.

في فيروسات المجموعة الرابعة ، ويعتقد ان أليات العداء IFN ان تتضاعف زائده25. قد يكون انشقاق البروتين المضيف عابرا اثناء العدوى وقد تتعافي التركيزات مع مرور الوقت. وجدنا في الخلايا التي يمكن الكشف عن المنتجات TRIM14 الانقسام في وقت مبكر جدا بعد الانتقال (6 ح) مع ترميز البلازميد البروتيني (مروج الفيروس المضخم للخلايا). ومع ذلك ، في فترات أطول ، لم يتم الكشف عن منتجات الانشقاق. في الخلايا المصابة بالفيروس ، كانت حركيه مختلفه ويمكن الكشف عن منتجات الانشقاق بين 6-48 ح6. وأفادت الآخرين ظهور المنتجات البروتين المضيف الانقسام في وقت مبكر كما 3-6 h آخر العدوى9,11.

وغالبا ما يكون من الصعب الإمساك بالنشاط البروتيني في الخلايا ؛ منتجات الانشقاق يمكن ان تختلف في الذوبان ، والتركيز ، والاستقرار ، والعمر. في الاختبارات المستندة إلى الخلايا ، لا يمكن افتراض ان المنتجات الانشقاق سوف تتراكم في خليه أو ان كثافة الفرقة من البروتين قطع وتقطيعه سوف تظهر زيادات التعويضية والانخفاضات كما البروتين قطع قد يكون المتدهورة بسرعة كبيره وقد لا تكون قابله للكشف في وصمه عار الغربية في الوزن الجزيئي المتوقع (ميغاواط) المنطقة التي تحتوي علي المربه يمكن ان تكون مشقوقة بواسطة البرواسات المضيفة الأخرى أو يمكن ان تكون اوبيتاميناتيد). إذا كانت ركيزة الانزيم البروتيني الفيروسي هو بروتين الاستجابة المناعية الفطرية ، قد يختلف تركيزه اثناء العدوى. علي سبيل المثال ، بعض بروتينات الاستجابة المناعية الفطرية موجودة قبل العدوى الفيروسية ويتم الحث عليها بشكل أكبر من قبل مضادات الفيروسات26. التالي قد تتذبذب تركيز البروتين المستهدف اثناء العدوى وقد يكون من الصعب تفسير المقارنة بين الخلايا المصابة. بالاضافه إلى ذلك ، قد لا يتم نقل جميع الخلايا بشكل موحد أو أصابه. في اختبارات البروتياز المختبر باستخدام البروتينات المنقية من e. كولاي من ناحية أخرى لديها اقل المتغيرات التي للسيطرة ويمكن القيام به مثل هذه المقايسات باستخدام SDS-PAGE بدلا من المناعية. تلوث بروتينيه يمكن ان تثبط في الخطوات المبكرة لتنقيه البروتين من الركيزة ف ب/س ، ويمكن تنقيه بروتينيه الفيروسية تحور واختبارها كضوابط لتحديد ما إذا كان الانقسام بسبب الانزيم البروتيني الفيروسي أو البروتينية البكتيرية الملوثة.

أحد القيود في اختبارات الانزيم البروتيني في المختبر هو انها تفتقر إلى تعقيد خليه الثدييات. لانزيم لقطع الركيزة ، يجب ان تكون مشتركه بين الاثنين. المجموعة الرابعة بروتينيه الفيروسية تختلف في البنية والتعريب. علي سبيل المثال ، يتم تضمين الانزيم البروتيني ZIKV في غشاء الشبكية الإندوبلازمي (ER) ويواجه cytosol ، في حين ان انزيم VEEV nsP2 هو بروتين قابل للذوبان في السيتوبلاسما والنواة27. وكانت بعض متواليات موقع الانشقاق الموجودة في تحليل زيكف SSHHPS في الببتيدات اشاره مما يوحي بان الانشقاق قد تحدث بالتناوب لبعض الأهداف. التالي ، فان موقع الانزيم البروتيني والركيزة في الخلية أيضا بحاجه إلى ان تؤخذ في الاعتبار في هذه التحليلات.

يمكن ان تكون الاختبارات المستندة إلى الخلايا قيمه لإنشاء دور للبروتين (البروتينات) المضيف المحدد في العدوى. الطرق التي تهدف إلى وقف الفيروسية البروتيني الانقسام من البروتينات المضيفة مثل أضافه مثبط الانزيم البروتيني6 أو طفرة في الهدف المضيف16 يمكن استخدامها لفحص اثارها علي النسخ المتماثل الفيروسية. وقد يؤثر الإفراط في التعبير عن البروتين المستهدف أيضا علي النسخ المتماثل الفيروسي28. يمكن استخدام اختبارات البلاك أو طرق أخرى لقياس النسخ المتماثل الفيروسي.

Protocol

1. المعلوماتية الحيوية: تحديد SSHHPS في الجينوم المضيف باستخدام الانفجار

ملاحظه: يمكن العثور علي البروتين الانفجار في blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. المدخلات ~ 20 الأحماض الامينيه المحيطة السندات سيسيل في بوليبروتين الفيروسية. حدد تسلسلات البروتين غير المكررة واكتب في الجينوم المضيف ليتم البحث فيها (علي سبيل المثال ، الإنسان العاقل).
    1. إذا لزم الأمر ، حدد PHI-الانفجار. اكتب في تسلسل نمط (علي سبيل المثال ، لبقايا 25 من V12 المبين أدناه ادخل نمط "AG" دون علامات الاقتباس).



      ملاحظه: في الانفجار فاي ، الأقواس المربعة [XY] تشير إلى ان الأحماض الامينيه س أو ص يمكن ان يكون في الموقع الفرعي (علي سبيل المثال ، AG [AC] [مثلي الجنس]).
    2. افحص نتائج الانفجار وحدد الفعاليات التي لها هويه متسلسلة عاليه للمخلفات التي يتم حفظها في مواقع الانشقاقات المتعددة البروتينات (علي سبيل المثال ، البروتين الثلاثي الحافز 14) (الشكل 3).
      ملاحظه: ل سيرين بروتياسيس الحفاظ علي اعلي من بقايا P1 ومن المتوقع ، في حين ان لسيستين بروتياسيس الحفاظ علي اعلي من بقايا P2 من المتوقع.
    3. لون البقايا التي تتطابق مع تسلسل موقع الانقسام وهي في ترتيب تسلسلي (بدون ثغرات). لون البقايا المسموح بها في الموقع الفرعي ، ولكنها موجودة في مكان انشقاق مختلف بلون ثان.
      ملاحظه: البقايا التي تمثل الاستبدالات المحافظة (علي سبيل المثال ، ليو vs. فال) التي ليست موجودة في موقع الانشقاق الفيروسي أيضا يمكن العثور عليها ، وربما أو لا يمكن التعرف عليها من قبل الانزيم البروتيني الفيروسي.
    4. ترتيب يضرب الانفجار استنادا إلى عدد من بقايا متطابقة أو التسامح المتعاقبة التي تتطابق مع تسلسل موقع الانشقاق. من القائمة ، حدد البروتينات التي تحتوي علي ≥ 6 بقايا متطابقة أو مماثله للتحليل في اختبارات البروتياز.
    5. كرر الاجراء لمواقع الانشقاق الأخرى (nsP2/3 ، nsP3/4 ، الخ) وتعزيز تدريجيا التنبؤ عن طريق أضافه المزيد من المخلفات المحفوظة بشكل كبير إلى نمط PHI-الانفجار.

2. في اختبارات المختبر: تصميم واعداد ركائز البروتياز

  1. بناء البلازميد ترميز البروتين الفلوري السماوي (الباسيفيكي) ، ≤ 25 الأحماض الامينيه من تسلسل موقع الانشقاق ، تليها البروتين الفلوري الأصفر (yfp ، المعروف أيضا باسم فينوس29).
    ملاحظه: ويمكن بناء البلازميد باستخدام تسلسل وربط الاستنساخ مستقله (slic)30 أو تخليق الجينات التجارية. وقد تم تصنيع pet15b البلازميد الذي يحتوي علي التسلسل المبين في الشكل 4 تجاريا واستخدم هنا.
    1. لتحسين طول الركيزة ، وبناء اضافيه متغيرة التاكل الطول الركائز التي تحتوي علي 12-25 الأحماض الامينيه الطبيعية الفيروسية الانقسامات موقع انشقاق باستخدام 2-قطعه رد فعل SLIC. تحليل الانقسام باستخدام الفحص القائم علي الهلام SDS أو عن طريق قياس المعلمات الحركية الثابتة للدولة باستخدام الأساليب أدناه.
      ملاحظه: في بعض الحالات ، يمكن تحديد مواقع الانشقاق من قبل الحمص إلى مواقع الانشقاق المعروفة31. إذا لم يلاحظ انشقاق الركائز التي تحتوي علي متواليات الوصلات متعددة البروتينات ، فقد يكون هناك حاجه لبقايا اضافيه أو عزر هيكلي (علي سبيل المثال ، الفا الحلزون32). بدلا من ذلك ، قد يكون البروتيني الفيروسي المنقي غير نشط. تاكيد انشقاق متواليات بوليبروتين الفيروسية قبل متابعه تحليل SSHHPS. وقد تم تحسين عدد البقايا في الركيزة لالبروتياز VEEV باستخدام ركائز متغيرة الطول (12 إلى 25 الأحماض الامينيه) تليها تحليل Vماكس و Km32،33. وقد نشرت مواقع الانشقاق ns2B/nsb البروتياز الفيروسية المستخدمة في الامثله34،35.
  2. اعداد ركائز الباسيفيكي/YFP عن طريق تحويل 8-20 μL الطازجة من BL-21 (DE3)E. coliالخلايا المختصة مع البلازما-V12-yfp البلازميد وفقا لاتجاات الشركة المصنعة ولوحه علي لوحات لوريا bertani (LB) أجار تحتوي علي 50 ميكروغرام/مل الامبيسلين (37 درجه مئوية).
    1. الاوتوكلاف أربعه قوارير L 4 تحتوي علي وسائل الاعلام LB (1.5 L وسائل الاعلام للزجاجة الواحدة) و 100 mL من LB في قارورة 250 mL. كاب كل قارورة مع رقائق ألومنيوم.
    2. تطعيم الثقافة 100 mL مع مستعمره من البكتيريا المتحولة حديثا وتنمو في 37 درجه مئوية مع الاهتزاز (200 دوره في الدقيقة) بين عشيه وضحيها.
    3. لجعل الركيزة بالفرنك الباسيفيكي/YFP ، تطعيم أربع قوارير L 4 مع 25 مل من ثقافة بين عشيه وضحيها. تبدا تهز الثقافات في 37 درجه مئوية ورصد النمو عن طريق الاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفي في 600 nm كل ساعة.
    4. عندما تصل البكتيريا امتصاص ~ 1.0 في 600 nm (تقريبا ~ 3-4 h من النمو) الحث علي التعبير عن البروتين عن طريق أضافه 0.5 مل من 1 م ايزوبروبيل-β-د-ثيوغالالاكتوسايد (IPTG) للزجاجة الواحدة. بعد أضافه IPTG ، وانخفاض درجه حرارة الحاضنة تهتز إلى 17 درجه مئوية والسماح التعبير لمواصله بين عشيه وضحيها ل 17-20 h.
    5. بيليه البكتيريا باستخدام جهاز الطرد المركزي عاليه السرعة في 7,000 x g لمده 10 دقيقه (4 °c) والاحتفاظ الكريات. أزاله الوسائط السائلة وتجاهلها. تخزين الكريات في-80 درجه مئوية أو lyse علي الفور.
    6. اعداد 100 mL من تحلل العازلة التي تحتوي علي 50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 500 mM كلوريد الصوديوم ، 35 مل من البروتين البكتيري استخراج الكاشف ، 30 ملغ من lysozyme ، 25 U من DNase ، و 1 قرص المثبط البروتيني. أعاده تعليق الكريات في تحلل العازلة مع ماصه ونقل ~ 25-35 mL في 50 mL أنابيب مخروطيه القابل للتصرف.
    7. وضع الأنابيب في كوب من البلاستيك التي تحتوي علي الماء المثلج. ادراج تلميح sonicator في الأنابيب بحيث غيض هو ~ 1 سم من الجزء السفلي من الأنبوب ويصوتون علي لست] 10-20 مرات علي مستوي 5 لفترات 15 ليالي حتى يصبح لست] السائل والمسيل.
      ملاحظه: استخدام حماية السمع اثناء سونيكيشن.
    8. نقل محلله إلى أنابيب الطرد المركزي عاليه السرعة وأجهزه الطرد المركزي في 20,500 x g لمده 30 دقيقه في 4 ° c. بعد تدور ، والاحتفاظ ماده طافي (~ 100 mL) ونقله إلى زجاجه نظيفه. تجاهل الكريات.
    9. اعداد 1 لتر من المخزن المؤقت A (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 500 mM NaCl). اعداد 300 مل من العازلة B (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 500 mM كلوريد الصوديوم ، 300 mM ايميدازول).
    10. تتوازن a 100 mL عمود النيكل باستخدام 3 مجلدات العمود من A العازلة ومعدل تدفق 5 مل/دقيقه.
    11. تحميل محلله علي عمود النيكل باستخدام معدل تدفق من 2 إلى 5 مل/دقيقه. اغسل العمود بحجم عمودين من المخزن المؤقت a ، متبوعا ب ~ 5 مجلدات أعمده من 20% من المخزن المؤقت B. خلال غسل العازلة ب 20 ٪ ، والامتصاص في 280 nm (A280) سوف تزيد كما الوت الملوثات من العمود اثناء الغسيل. استمر في غسل العمود حتىال280 A الذي تم إرجاعه إلى قيم الأساس.
    12. Elute البروتين مع حجم العمود 2-3 من 100% العازلة B باستخدام معدل تدفق 2-5 mL/min وجمع 10 مل الكسور. قياس A280 لكل كسر.
    13. الجمع بين وتركيز الكسور التي تحتوي علي280 > 0.1 باستخدام 15 مل الطرد المركزي الترشيح وحده. تدور وحدات الترشيح الفائق في 5,000 x g لمده 15 دقيقه والاستمرار في أضافه الكسور حتى تم تخفيض حجم إلى ~ 50-75 mL.
    14. قطع قطعه 14 بوصه من أنابيب غسيل الكلي مع الوزن الجزيئي قطع (MWCO) من 6-8 ده. هيدرات أنابيب غسيل الكلي عن طريق الغليان المغمورة بالبالكامل في 300 مل من الماء لمده 10 دقيقه. اربط عقده أمنه في نهاية واحده من الغشاء. ملء الحقيبة مع العازلة غسيل الكلي لضمان عدم وجود الشقوق أو التسريبات. أزاله العازلة من الحقيبة والحفاظ علي الحقيبة المغمورة في العازلة غسيل الكلي.
    15. نقل البروتين المركز من 2.2.13 إلى كيس غسيل الكلي مع ماصه بلاستيكية. أزاله اي فقاعات الهواء من الحقيبة. إغلاق الحقيبة مع عقده ثانيه أو مقطع غسيل الكلي. ديزه البروتين ضد 500 mL من 50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 5 مم أدتا (حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك) ، 250 mM كلوريد الصوديوم في 500 مل تخرج اسطوانه بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
    16. دييايز البروتين مره ثانيه ضد 500 مل من 50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.6 في 4 درجه مئوية ل 2 ح.
  3. لعمود تبادل انيون اعداد 500 مل من المخزن المؤقت A (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6) و 500 mL العازلة B (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 1.0 M NaCl). تتوازن 30 مل العمود تبادل انيون مع 3 مجلدات العمود من العازلة A (2-5 mL/min).
    1. أزاله البروتين من كيس غسيل الكلي ونقل إلى زجاجه. ابق القنينة علي الثلج تحميل البروتين ديزيد علي العمود (2-5 مل/دقيقه).
      ملاحظه: سوف البروتين الباسيفيكي/YFP ربط العمود وسوف تكون صفراء في المظهر.
    2. اغسل العمود بالمخزن المؤقت A حتى ترجع A280 إلى الأساس (5 مل/دقيقه). Elute البروتين باستخدام التدرج (0-50 ٪ العازلة B ، 100 mL) وجمع 10 مل الكسور.
    3. افحص كسور الاعمده باستخدام صفحه SDS. الجمع بين تلك التي هي > 95 ٪ نقيه.
    4. تركيز البروتين إلى A280 ~ 10-20 باستخدام وحده الترشيح الفائق الطرد المركزي 15 مل. تدور المكثف في 4,500 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c والاستمرار في أضافه البروتين حتى يتم الجمع بين جميع الكسور المحتوية علي البروتين.
  4. أزاله البروتين بعناية من المكثف مع ماصه. Aliquot البروتين إلى 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير وتجميد فلاش في النيتروجين السائل للتخزين علي المدى الطويل في-80 درجه مئوية. العازلة تبادل البروتين في درجه حرارة الغرفة باستخدام معايرتها عمود PD مع المخزن المؤقت المناسب الفحص قبل الاستخدام.
  5. باستخدام قانون البيره حساب تركيز البروتين باستخدام A280 ومعامل الانقراض محسوبة (علي سبيل المثال ، للركازه V12 ɛˈli = 47,790 M-1 سم-1).
    ملاحظه: ويمكن حساب معامل الانقراض (ɛˈli) من تسلسل البروتين في الشكل 4 باستخدام برنامج Expasy protparam (https://web.expasy.org/protparam/).

3. اعداد nsP2 السيستين الفيروسي البيهئين

  1. تصميم وبناء البلازميد ترميز الانزيم البروتيني. للبروتينات السيستين ، استخدم البلازميد pet32 لبناء البروتين الانصهار ثياوريدوكسين (trx).
    ملاحظه:Pet32 البلازميد الترميز موقع الانشقاق (lvprgs) لأزاله thioredoxin وصاحب العلامة (الشكل 5). سوف thioredoxin المساعدة في الحفاظ علي الموقع النشط السيستين في حاله انخفاض اثناء التعبير. للبروتينات سيرين ، لا حاجه إلى thioredoxin والخطوات التي تنطوي علي ازالته عن طريق الفك يمكن حذفها. تم دمج تسلسل nsP2 البروتيني veev في البلازميد pet32b التي تم اعدادها تجاريا لتجنب التعامل مع وكلاء تحديد.
    1. تحويل الحمض النووي البلازميد حديثا إلى BL21 (DE3) plyss e. القولونية وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. طبق البكتيريا علي لوحات أجار LB التي تحتوي علي الامبيسلين.
      ملاحظه: الكلورامفينيكول يستخدم فقط ل e. القولونية سلالات تحمل plyss البلازميد ويتم حذفها إذا تم استخدام BL21 (DE3) الخلايا. ليس من الضروري ان تشمل الكلورامفينيكول علي لوحه أجار LB في هذه الخطوة.
    2. الاوتوكلاف أربعه قوارير L 4 من 1.5 لتر من وسائل الاعلام LB (6 لتر الحجم الإجمالي) و 100 mL من LB في قارورة 250 mL. كاب كل قارورة مع رقائق ألومنيوم.
    3. تطعيم 100 mL الثقافة بين عشيه وضحيها من LB/Ampicillin مع مستعمره من لوحه وتنمو في حاضنه الاهتزاز (200 دوره في الدقيقة) في 37 درجه مئوية.
    4. تطعيم 4 لتر قوارير مع 25 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها وأضافه المضادات الحيوية المناسبة.
      ملاحظه: وسائل الاعلام لخلايا plyss BL21 (DE3) التي تحمل pet32 البلازميد يجب ان يكون لها تركيزات النهائية من 25 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 50 ميكروغرام/مل الامبيسلين.
    5. الحث علي التعبير عن البروتين عن طريق أضافه 0.5 mL من IPTG إلى الثقافة عندما يصل الامتصاص في 600 نانومتر 1.0. خفض درجه حرارة الحاضنة تهتز إلى 17 درجه مئوية. السماح باستمرار التعبير بين عشيه وضحيها (~ 17 h).
    6. بيليه الخلايا بواسطة طرد (7,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c). أزاله الوسائط السائلة وتجاهلها.
      ملاحظه: ويمكن تخزين الكريات في-80 درجه مئوية لعده أشهر أو تفكيك علي الفور.
    7. اعداد 100 mL من تحلل العازلة (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 500 مل كلوريد الصوديوم ، 2 مم بيتا mercaptoethanol (BME) ، 30 ملغ lysozyme ، 5 ٪ الجلسرين ، 25 U DNase ، 35 mL استخراج البروتين البكتيري الكاشف). فتح زجاجات BME في غطاء كيميائي عند أضافه. الحفاظ علي محلله البكتيرية علي الجليد أو في 4 درجه مئوية لهذا وجميع الخطوات اللاحقة.
      ملاحظه: للبروتينات السيستين ، يتم تضمين 2 مم BME للحفاظ علي السيستين الذي يتم تقليله. يمكن تشغيل الاعمده في درجه حرارة الغرفة باستخدام المخازن المؤقتة المبردة. يجب اجراء المخازن المؤقتة مع تبريد المياه الباردة منزوعة الأيونات إلى 4 درجه مئوية.
    8. أعاده تعليق الكريات البكتيرية في ~ 25 مل من تحلل العازلة ونقل ~ 25 مل من محلله إلى 4 × 50 مل أنابيب مخروطيه القابل للتصرف. ضع الأنابيب في أكواب بلاستيكية تحتوي علي الماء المثلج. سنونات المحللة 10 مرات علي المستوي 5 لفترات 15 ثانيه.
    9. نقل محلله إلى أنابيب الطرد المركزي عاليه السرعة. توضيح محلله بواسطة طرد (30 دقيقه ، 20,500 x g في 4 درجه مئوية).
    10. اعداد 0.5 L من العازلة A (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 500 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ٪ الجلسرين ، 2 مم BME) والبرد إلى 4 درجه مئوية.
    11. اعداد 250 مل من العازلة B (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 500 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ٪ الجلسرين ، 2 مم BME ، 300 mM ايميدازول) والبرد إلى 4 درجه مئوية.
    12. تتوازن a 50 ml عمود النيكل مع 3 مجلدات العمود من المخزن المؤقت ا. تحميل محلله الموضحة علي العمود في 2-5 mL/min وتجاهل الكريات.
    13. غسل العمود (2-5 مل/دقيقه) مع 2 مجلدات العمود من المخزن المؤقت A متبوعا ب 5 مجلدات العمود من المخزن المؤقت A التي تحتوي علي 20% العازلة B (60 mM ايميدازول). Elute البروتين (5 مل/دقيقه) مع 100 ٪ العازلة B وجمع 10 مل الكسور.
    14. الجمع بين والتركيز الكسور التي تحتوي علي الانزيم البروتيني التي لديها280 ≥ 0.1 باستخدام 15 مل الترشيح المركزية الفائقة وحده و 15 دقيقه يدور في 5,000 x ز في 4 ° c. بعد خفض حجم إلى ~ 5 مل ، تبادل العازلة البروتين في وحده التركيز عن طريق أضافه العازلة غسيل الكلي الطازجة إلى البروتين (50 mm تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 250 mm كلوريد الصوديوم ، 5 مم ديثيوثريتول (dtt) ، 1 مم أدتا ، 5 ٪ الجلسرين). تدور مره أخرى في 5,000 x ز في 4 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ؛ كرر الخطوة تبادل المخزن المؤقت 2-3 مرات. أضافه إلى البروتين (20 μL من 1 وحده/μL) قبل غسيل الكلي لأزاله ثياوريدوكسين وعلامته.
    15. نقل البروتين إلى كيس غسيل الكلي والديزه ضد 500 mL من العازلة غسيل الكلي (4 درجه مئوية) في 500 مل تخرج اسطوانه بين عشيه وضحيها.
      ملاحظه: FPLC (البروتين السريع اللوني السائل) وينبغي تنظيف العمود النيكل تماما مع تجريد العازلة (2 م NaCl ، 50 mM أدتا) قبل الانتقال إلى العمود التبادل انيون. اي النيكل المتبقية في خطوط FPLC سوف تتحول الحلول العازلة التي تحتوي علي DTT براون عندما مختلطة. غسل العمود النيكل ونظام FPLC مع 4 مجلدات العمود من الماء. مضخة غسل النظام FPLC تماما مع الماء. النيكل عمود يستطيع كنت جددت ب يتدفق 2 عمود حجوم من 0.2 [م] نيكل كبريتات علي الراتنج لتكبير لاحقه.
  2. لعمود تبادل انيون اعداد 1 لتر من المخزن المؤقت A (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 5 مم DTT ، 5 ٪ الجلسرين).
    1. اعداد 0.5 L من العازلة B (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.6 ، 5 مم DTT ، 5 ٪ الجلسرين ، 1.25 M NaCl).
    2. تتوازن 30 مل العمود تبادل انيون مع العازلة A (3 مجلدات العمود ، 2-5 mL/min). ضع الأنابيب في جامع الكسر لجمع التدفق من خلال.
      ملاحظه: الانزيم البروتيني VEEV لديه نقطه ايزوالكتريك محسوبة (pI) من 8.7 وسوف تربط الموجبة-تبادل الاعمده ولكن سوف تتدفق من خلال الاعمده تبادل انيون. يمكن حساب pI من تسلسل البروتين باستخدام برنامج Expasy بروبارام (https://web.expasy.org/protparam/).
    3. تمييع البروتين ديزيد 1:3 مع العازلة A ، ومن ثم تحميل البروتين (5 مل/دقيقه). جمع التدفق من خلال في 10 مل الكسور.
  3. أزاله العمود تبادل انيون من نظام FPLC. قم بتوصيل عمود تبادل الموجبة بنظام FPLC. تتوازن 30 مل من العمود تبادل الموجبة مع 3 مجلدات العمود من العازلة A (5 مل/دقيقه).
    1. تحميل التدفق من خلال العمود التبادل انيون علي العمود تبادل الموجبة في 2-5 mL/min. اغسل العمود بالمخزن المؤقت A حتى ترجع A280 إلى مستوي الأساس. Elute البروتين مع التدرج 100 mL (0-50 ٪ العازلة B) وجمع 10 مل الكسور.
      ملاحظه: سوف البروتيني veev الوت في حوالي 0.6 M nacl.
    2. افحص كسور الاعمده باستخدام صفحه SDS. الجمع بين الكسور التي هي > 95 ٪ نقيه والتركيز علي A280 ≈ 2 باستخدام وحدات الترشيح الفائق الطرد المركزي 15 مل. يمكن ان يكون الانزيم المجمدة فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في-80 درجه مئوية.

4. السلخ الانزيم باستمرار باستخدام قارئ لوحه

  1. اعداد 50 مل من العازلة المقايسة (50 mM HEPES pH 7.0).
    1. كما بروتينيه الفيروسية لها قيمالقط k منخفضه نسبيا ، تمييع الانزيم في العازلة المقايسة إلى 4.7 ΜM (وهذا سوف تتوافق تقريبا إلى A280 = 0.2 لل Veev البروتياز دون trx).
    2. لقياس نشاط الانزيم ، واعداد مخزون من الركيزة في العازلة المقايسة مع تركيز 185 μM ؛ هذا وسوف تتوافق تقريبا إلى A280 = 9. في 8 أنابيب الطرد المركزي ، واعداد خلطات التفاعل المبينة في الجدول 2 من خلال الجمع بين وحدات التخزين المناسبة من المخزون الركيزة 185 μM والعازلة. في اسود نصف المنطقة 96-بئر لوحه ماصه pipet-x 45 μL من التفاعل يمزج إلى 3 ابار (الاعمده 1, 2, 3). يجب ان يحتوي الصف A علي مزيج تفاعل [S] = 5 ميكرون ، ويجب ان يحتوي الصف H علي [S] = 140 ميكرون من مزيج التفاعل.
    3. تعيين قارئ لوحه للكشف في وقت واحد مضان في اثنين من أطوال موجية مع أنبوب مضخم ثابته (pmt) الاعداد (علي سبيل المثال ، منخفضه):
      الطول الموجي 1 الاثاره = 434 nm ، الانبعاثات = 527 nm
      الطول الموجي 2 الاثاره = 434 nm ، الانبعاثات = 470 nm
    4. تعيين وقت القراءة إلى 20 دقيقه (قياس 1 قراءه في الدقيقة الواحدة) وحدد الآبار التي يمكن قراءتها. ادراج لوحه في قارئ لوحه وقياس معدل عفويه من التحلل المائي لمده 20 دقيقه. رصد نسب الانبعاثات (الانبعاثات في 527/الانبعاثات في 470) مع مرور الوقت.
    5. تشغيل نقطه نهاية قراءه اللوحة التي تحتوي علي الركيزة "تقطيعه".
      ملاحظه: سيتم استخدام هذه القيم في حسابات البيانات اللاحقة. سيكون متوسط نسب الانبعاثات من 3 ابار هي قيم الركيزة "غير المصقولة" في t = 0 في الجدول 3.
    6. أزاله لوحه و ماصه pipet-x 5 μL من الانزيم في كل بئر. قراءه لوحه مره أخرى لمده 20 دقيقه مع 1 قراءه في الدقيقة الواحدة. تعيين قارئ لوحه لإخراج القيم المطلقة.
      ملاحظه: لهذا الفحص ، ستكون المنحدرات السلبية. كل بئر سوف تحتوي علي حجم إجمالي 50 μL.
    7. في نهاية القراءة ، ختم لوحه مع الفيلم لمنع التبخر. ترك لوحه في درجه حرارة الغرفة بين عشيه وضحيها للسماح لانزيم لقطع الركيزة تماما.
    8. بعد ~ 24 ساعة ، وأزاله الفيلم الختم وتنفيذ نقطه نهاية قراءه من لوحه باستخدام نفس PMT كما هو الحال في لوحات السابقة. متوسط نسب الانبعاثات هذه والمدخلات في الجدول 3 تحت "CUT". تاكيد انشقاق الركيزة باستخدام الفحص المتقطع SDS-PAGE الموصوفة أدناه (الخطوة 5.1.).
    9. تصدير البيانات إلى جدول بيانات. إخراج وحدات مضان في كل نقطه زمنيه لأطوال موجية 2 (الجدول 4).
    10. حساب نانومول من الركيزة التي تم قطعها في الوقت t باستخدام المعادلة (1) حيث X هي نسبه الانبعاثات (527 nm/470 نانومتر) في نقطه زمنيه معينه ، neg هي نسبه الانبعاثات من الركيزة "تقطيعه" في t = 0 ، ونقاط البيع هي نسبه الانبعاثات من الركيزة"cut" تماما تقاس بعد 24 ساعة



      ملاحظه: وتظهر البيانات فلوري ممثل لبئر واحد (جيد E7) التي تحتوي علي 80 μM الركيزة (4 نانومول من S في بئر) في الجدول 4. وأجريت الحسابات لكل بئر في اللوحة.
    11. لكل بئر ، مؤامرة نانومول مقابل الوقت (دقيقه) والحصول علي السرعات الاوليه (المنحدرات) عن طريق تركيب البيانات إلى y = mx + b. للبيانات التي تم جمعها في 4.1.5 ، مؤامرة نانومول مقابل الوقت (دقيقه) لكل بئر. الميل سوف يساوي المنتج نانومول تنتج في الدقيقة الواحدة. طرح المعدلات العفوية للتحلل المائي مقيسة بال4.1.5 من معدلات التفاعل المحفز لانزيم (الجدول 5).
      ملاحظه: يمكن قص القراءة الاولي من البيانات إذا كانت عاليه الوقائع بسبب حركه لوحه في قارئ لوحه.
    12. حساب كميه الانزيم في ملغ التي أضيفت إلى كل بئر (علي سبيل المثال ، 0.0009 ملغ). وتعرف الوحدة بأنها ميكرومول من المنتجات التي تنتج في الدقيقة الواحدة (ميكرومول/دقيقه). يقسم [نمول/مين] ب ال [مغ] من انزيم حاضره في البئر ان ينال [مو/مغ]; القسمة علي 1,000 للحصول علي U/mg.
    13. مؤامرة [S] μM علي محور x و U/mg علي محور ص وتناسب البيانات إلى المعادلة ميخاليس-Menten للحصول علي Vmax و Km. ويمكن ان يتم ذلك في البرنامج (علي سبيل المثال ، GraFit).

5. تهدئه الانزيم بشكل متقطع باستخدام SDS-تحليل الصفحة

  1. اعداد رد فعل 50 μL التي تحتوي علي 10 μM الركيزة والعازلة بدلا من الانزيم والتسمية باسم "غير المصقول".
    ملاحظه: وترد في الجدول 2مجلدات الركيزة والمخزن المؤقت. إذا تم تشغيل الفحص المستمر ، يمكن استخدام العينات مباشره من لوحه 96-حسنا.
    1. اعداد رد فعل 50 μL التي تحتوي علي 10 μM الركيزة و 5 μL الانزيم والتسمية باسم "CUT". بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت عند أضافه الانزيم إلى الركيزة.
      ملاحظه: يمكن أضافه مثبطات إلى أنابيب اضافيه تحتوي علي الانزيم والركيزة. ضبط حجم المخزن المؤقت المضافة للتعويض عن حجم المثبطة المضافة. يجب الا تتجاوز تركيزات DMSO 2%.
    2. احتضان ردود الفعل ل ~ 15-24 h في درجه حرارة الغرفة (22 ± 3 درجه مئوية). إيقاف ردود الفعل عن طريق أضافه 50 μL من 2x العازلة Laemelli. بعد وقف رد الفعل يغلي ، كل أنبوب لمده 3-10 دقيقه.
    3. تجميع خزان هلام وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. ادراج 17 بئر قبل الصب 12 ٪ بولياكريلاميد هلام كاسيت وسد العازلة علي الجانب الآخر. أملا الخزان الداخلي للخلية بالمخزن المؤقت الذي يشغل 1x SDS حتى يصل المخزن المؤقت إلى اعلي الدرج. أملا الخزان الخارجي بنصف ممتلئ بنفس المخزن المؤقت.
    4. لتحليل الانقسام باستخدام المقايسة المتقطعة ، حمل 5 μL من كل خليط من التفاعل إلى ممر من هلام SDS-PAGE بدءا من رد الفعل "غير المصقول". وتشمل علامة الوزن الجزيئي في المسار الأول أو الأخير.
    5. نعلق الأقطاب من خزان هلام لإمدادات الطاقة وفصل المنتجات في 110 V لمده 60 دقيقه. أزاله الهلام من الكاسيت عن طريق إدخال أداه تكسير بين اللوحات. ضع الهلام في صينية بلاستيكية وأدمج الجل في 5-10 مل من محلول تلطيخ الجل. وسوف تكون مرئية العصابات في غضون 30 دقيقه. بعد 1-24 ساعات أزاله وصمه عار الزائدة ، تحت دمج هلام في الماء واستخدام تصوير هلام للتقاط صوره من هلام.

6. التحام الركيزة الببتيدات ل VEEV-nsP2 السيستين البروتياز

  1. تحميل ملف احداثي لانزيم سيستين VEEV من PDB (https://www.rcsb.org/). رمز PDB هو 2HWK. حفظ الملف ك 2HWK. pdb.
    1. اعداد بنيه البروتين باستخدام وزاره التربية (https://www.chemcomp.com/). تحميل ملف PDB البروتين في وزاره التربية. انقر فوق تحديد والمذيبات علي شريط الجانب الأيمن وحذف المذيب.
    2. فتح لوحه اعداد بنيه من شريط القائمة الأعلى البروتين. تصحيح تلقائيا جميع العناصر الهيكلية عن طريق النقر علي الصحيح وبرونيت الهيكل من خلال النقر علي Protonate3D. أضافه الرسوم الجزئية إلى البروتين عن طريق فتح لوحه الرسوم الجزئية واختيار العنبر 99 وضبط الهيدروجين وأزواج لون كما هو مطلوب. وأخيرا ، حفظ ملف البنية ك "2HWK_dock. pdb".
  2. بناء هيكل الببتيدات الركيزة (nsP12 ، nsP23 ، nsP34) و TRIM14 باستخدام وزاره التربية. فتح لوحه منشئ البروتين ، ادخل تسلسل الركيزة ، وتعيين الهندسة كما الموسعة ، وانقر علي بناء. سيتم عرض الهيكل في نافذه وزاره التربية.
    1. تصغير بنيه الببتيد بالنقر فوق تصغير علي اللوحة. حفظ البنية كملف PDB (الشكل 6).
  3. قفص الاتهام الببتيدات الركيزة ل VEEV-nsP2 باستخدام PyRx/اوتودوك 4.2 (http://autodock.scripps.edu/). فتح أداه pyrx ، وتحرير الاعداد تفضيل ، إلغاء تنشيط جميع العمليات لاعداد ligand. تحميل جزيء الركيزة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي اسم الجزيء علي لوحه الملاح ، حدد جعل يجند لاعداد ملف الربط والإرساء. تحميل البروتين 2HWK_clean .pdb ، وحدد جعل جزيء لاعداد ملف الإرساء pdbqt (الشكل 7).
    1. بدء تشغيل "معالج الإرساء التلقائي" علي لوحه الإرساء في الجزء السفلي. حدد ملفات الربط والبروتين التي تم اعدادها. تحديد جيب ربط البروتين عن طريق ضبط البعد الشبكة يدويا الذي يتركز في بقايا الحفاز Cys-477. باستخدام معلمه التباعد الافتراضي 0.375 Å. انقر فوق تشغيل AutoGrid لإنشاء خرائط الشبكة.
    2. قم بتشغيل الإرساء التلقائي وحدد طريقه خوارزميه لامارككيان الجينية (LGA). انقر فوق معلمات الإرساء وتعيين عدد تشغيل GA إلى 50. استخدم المعلمات الافتراضية للآخرين. انقر فوق إلى الامام لبدء تشغيل الإرساء.
    3. افتح لوحه نتائج التحليل . افحص جميع الوضعيات المتوقعة للربط. حدد أفضل نموذج مع ادني الطاقة المتوقعة ملزمه والتفاعلات ملزمه معقولة بين Cys-477 والركيزة علي موقع الانشقاق. حفظ طراز الربط كملف PDB لمزيد من المحاكاة MD.

7. المحاكاة MD من المجمعات الركيزة VEEV المرساة

  1. اعداد ملفات الإدخال باستخدام العنبر (http://ambermd.org/). بعد البروتوكول القياسي ، يتم اجراء محاكاة MD لنماذج ملزمه الركيزة المتوقعة باستخدام حزمه العنبر وحقل قوه ff99SB.
    ملاحظه: وتخضع الانظمه الملحومة لتقليل الطاقة بشكل شامل قبل محاكاة الدكتوراه. يتم تطبيق شروط الحدود الدورية لمحاكاة نظام مستمر. واستخدمت الجسيمات شبكه ايالد (PME) طريقه لحساب التفاعلات الكهربائية طويلة المدى. خضع النظام المحاكي لأول مره لزيادة تدريجيه في درجه الحرارة من 0 K إلى 300 K علي 100 ps ، ثم معايرتها ل500 ps في 300 K ، تليها أشواط إنتاج 2 ns طول في المجموع.
    1. تشغيل وظيفة المحاكاة في منشاه حوسبة عاليه الأداء. وجريت عمليات المحاكاة التي أجريناها علي مجموعه الجلف البيولوجي (https://hpc.nih.gov/) (الشكل 8).
    2. تصور مخرجات المسار باستخدام برنامج VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). تحليل التفاعلات الملزمة والتغييرات المطابقة لركائز و TRIM14 داخل الموقع النشط nsP2 (الشكل 9).

Representative Results

التحليل SSHHPS لل ZIKV ns2B/3 البروتيني حددت 4 أهداف البروتين المضيف: FOXG1, SFRP1, زs الفا الوحدة الفرعية من مكتبه cdna الشبكية, و NT5M الميتوكوندريا 5 ', 3 '-النيوبوتيداز (الشكل 10)6. ولا سيما ، لم توقع اي طريقه أخرى هذه البروتينات كاهداف محتمله للبروتيز ZIKV. وقد تم ربط الطفرات في الجينات FOXG1 إلى متلازمة خلقيه تتميز بضعف التنمية وتشوات الدماغ الهيكلية مثل ميكروسيفاي. SFRP1 هو البروتين المرتبطة التي يفرزها frizzled (SFRP) ؛ هذه المستقبلات القابلة للذوبان يمكن ربط تنافسيه wnt يغاندس لمعاداه وتمنع wnt الإشارات. وتشارك في المسار الإشارات Wnt في تنظيم استجابه IFN خلال الاصابه36العدوى الفيروسية. ومن المتوقع ان الانشقاق من SFRP1 لتعزيز النسخ المتماثل فلايروفيروس. SFRP1 وتشارك أيضا في التمايز Th17 الخلية37. وأظهرت التسلسلات المتوالية لل SSHHPS اختلافات خاصه بالأنواع في متواليات موقع الانشقاق (الشكل 10د). وكان تسلسل موقع الانشقاق في SFRP1 متطابقة في البشر والدجاج. يمكن ان يحفز زيكف الوفاات وصغر الراس في أجنه الدجاج38. في القوارض ، يتم استبدال بقايا P1 المحفوظة للغاية (K/R) R ↓ G بواسطة الجليسين (RGG). سلالات مناعية من الفئران هي عموما مقاومه للعدوى ZIKV والمرض39.

يمكن قياس المعلمات الحركية الثابتة للدولة وثوابت التثبيط لمتواليات بوليبروتين الفيروسية ولمتواليات البروتين المضيف باستخدام الفحص المستمر في لوحه القارئ31,40,41 (الشكل 11ا). لمعلومات الانقسام النوعي ، مثل انشقاق تسلسل معين أو تثبيط الانزيم البروتيني من قبل مركبات مختلفه ، يمكن استخدام الفحص المتقطع (الشكل 11ب).

قد تكون هناك حاجه إلى الاستفادة المثلي من عدد البقايا في الفترة ما بين الباسيفيكي و YFP. ويمكن اجراء نموذج الركيزة المرتبطة باستخدام أساليب سيليكو. ويبين الشكل 9نموذجا راسيا لتقاطع NsP1/nsP2. ل VEEV nsP2 البروتياز ، وقد تم الإبلاغ عن انشقاق من 12-الأحماض الامينيه Semliki الفيروسات الغابات (SFV) تسلسل (Km = 0.58 mM)33. أطاله تسلسل الركيزة إلى 19 ، 22 ، و 25 بقايا والحد من القوه الايونيه للمخزن المؤقت ادي إلى انخفاض كبير في Km. فحص هيكل الكريستال VEEV nsP2 والتعبئة والتغليف الكريستال وأظهرت أيضا ان جزءا من واحده من التقاطعات كانت معباه ضد المجال البروتياز وكان حلزونية. وهكذا ، فان ركائز VEEV أطول قد ربط أفضل نظرا للاعتراف عزر الهيكلية الثانوية.

لTRIM14 ، حصلنا علي Kم = 21 μM6،33. كم لركيزة تحمل تسلسل البروتين المضيف كانت مشابهه لقيم km من الركائز التي تحتوي علي الفيروسية الانقسامات موقع انشقاق البروتين (km(V12) = 12 μm و km(V34) = 21 μm). تم قطع متواليات موقع الانشقاق في nsP1/nsP2 ، nsP2/nsP3 ، وتقاطعات nsP3/nsP4 بكفاءات مختلفه. في الخلية ، ويعتقد ان هذا يسمح لانشقاق متسلسلة منال42المتعدد البروتين.

وينبغي توخي الحذر عند تفسير النتائج السلبية. إذا لم يحدث انشقاق ، قد يكون موقع الانشقاق قصير جدا أو قد يكون الانزيم البروتيني المنقي غير نشط. بالنسبة للركازات التي يتم قطعها ، هناك حاجه إلى تجارب اضافيه لتاكيد انشقاق البروتين كامل الطول أو الانقسام في الخلايا المصابة بالفيروس. وينبغي اختيار تجارب المتابعة المناسبة. ويمكن أيضا اختبار اثار الإفراط في التعبير أو إسكات البروتين المستهدف علي النسخ المتماثل الفيروسي.

Figure 1
الشكل 1: ثلاث أليات لإسكات الأصوات. يمكن ان يحدث إسكات علي مستوي الحمض النووي ، RNA ، أو البروتين. هذه الخوارزميات "البحث والحذف" كل استخدام "الكلمة الاساسيه" لتوجيه انشقاق ملف يحتوي علي الكلمة. وقد تم تعديل هذا الرقم من Morazzani et al.32 والإشارات الواردة فيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاختلافات الخاصة بالأنواع في تسلسل مواقع الانشقاق. يتم عرض المجالات C-الطرفية PRY/SPRY TRIM14 المتجانسات في المحاذاة. يمكن تحديد المجال PRY/SPRY بواسطة الزخارف المحفوظة التي تم تمييزها باللون الرمادي. يتم قطع الإنسان TRIM14 في القبلة ↓ G من قبل الانزيم البروتيني VEEV nsP2 السيستين. يتم عرض تسلسل SSHHP في اللون. بقايا في الأخضر هو P1 ' بقايا; في اللون الأزرق هو بقايا P4 ، اللون الأحمر هي بقايا المحفوظة الأخرى داخل تسلسل عزر موقع الانشقاق. الخيول الميناء نسخه مقتطعه من TRIM14 تفتقر إلى المجال PRY/SPRY. يسين المبرز في السماوي هو بولي-اوبيتاميناتيد وهو مهم لتجميع signalosome مافس. قد يتم قطع المجال C-الطرفية PRY/SPRY بشكل عابر من قبل البروتياز nsP2 لاضعاف استجابه المضيف المضادة للفيروسات اينتراسيلولارلي اثناء العدوى الفيروسية الحاده. في الخيول ، وهذا المجال غائبه دائما. وهذا يوحي بان المجال PRY/SPRY من TRIM14 قد يكون لها وظيفة وقائية ضد التهابات VEEV. وقد استنسخ هذا الرقم من Morazanni et al.6الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تعريف SSHHPS باستخدام الانفجار. يتم محاذاة تسلسل عزر موقع الانشقاق في تقاطع VEEV nsP1/nsP2 مع تسلسل SSHHP في TRIM14 البروتين المضيف. بقايا الملونة في الأخضر هو P1 ' بقايا; في اللون الأزرق هو بقايا P4 اللون الأحمر بقايا المحفوظة الأخرى من تسلسل عزر موقع الانشقاق. تحتوي معظم المحاذاة علي التماثل إلى المناطق خارج عزر موقع الانقسام المحفوظة أو لم تتضمن بقايا السندات سيسيل P1/P1. وأظهرت TRIM14 مطابقه ل 6 بقايا بترتيب متسلسل يتضمن P1 و P1 '. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: البروتين والحمض النووي تسلسل من الركيزة ف-V12-YFP ل VEEV nsP2 السيستين البروتياز. يتم عرض مواقع تقييد NdeI (CATATG) و XhoI (CTCGAG) في أحرف الراس. في الأحمر هو تسلسل موقع انشقاق من بوليبروتين الفيروسية التي هي في بين nsP1 و nsP2. بقايا في الأخضر هو P1 ' بقايا اللون الأزرق هو بقايا P4 من موقع الانشقاق. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تسلسل البروتين من Trx-VEEV-nsP2 السيستين بناء الانزيم البروتيني. يظهر ثياوريدوكسين (Trx) باللون الأصفر. يظهر الموقع الانشقاق وعلامته في السماوي. يتم تسميه الصبغي مزدوج له باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: هياكل الببتيد في وزاره التربية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التحام من الببتيد الركيزة باستخدام PyRx/اوتودوك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الوظائف التي تعمل علي مجموعه الجلف البيولوجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: نموذج الركيزة VEEV P12 التي تحتوي علي تسلسل موقع الانشقاق عند تقاطع nsP1/nsP2. و cys-477/له-546 الصبغي مزدوج الحفاز هو مبين باللون الأزرق. وقد تم الرقم باستخدام Pymol (https://pymol.org). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: تحليل SSHHPS لفيروس زيكا ns2B/ns3 البروتياز. (ا) توقعات البروتين المضيف المستهدفة لل Zikv ns2B/ns3 البروتياز. البقايا باللون الأحمر تطابق تسلسل موقع انشقاق واحد. ويتم التغاضي عن البقايا باللون الأخضر في الموقع الفرعي وبقايا المباراات في مواقع الانشقاق الأخرى. وكان لSFRP1 اعلي عدد من البقايا المتطابقة في ترتيب متتابع. (ب) تم التعبير عن بروتينات الركيزة-yfp (~ 50-60 كده) وتنقيتها التي تحتوي علي تسلسل SSHHP المتوقع من كل بروتين مضيف (بشري). الانزيم البروتيني ZIKV قطع FOXG1 الإنسان ، SFRP1 ، NT5M و Gsالفا الوحدة الفرعية معزولة من مكتبه cdna الشبكية. المنتجات الانشقاق حوالي 28-30 كده. سلاسل الركيزة متوفرة في morazzani وآخرون6 (C) في حين ان ns2B/ns3 البروتيني قطع SFRP1 ، فانه لم يقطع المتجانسات (SFRP2 و SFRP4). (د) قد تكون محاذاة مواقع الانشقاق من الأنواع الحيوانية المختلفة مفيده في اختيار نموذج حيواني لفيروس المجموعة الرابعة. لاحظ ان تسلسل R ↓ G المحفوظة يختلف بين البشر والقوارض في SFRP1. الشكل مستنسخ من Morazzani وآخرون6يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: التحليل الحركي الثابت للدولة باستخدام المقايسات المستمرة وغير المستمرة. (ا) تم رسم البيانات الحركية المبينة في الجدول 5 في غراتيك. يظهر الداخلي مؤامرة Lineweaver-بورك. (ب) هلام الصفحات SDS يظهر المنتجات الانشقاق من الركيزة السفلية-V12-yfp. في حاره 1 هو "تقطيعه" الركيزة (48 كده). في حاره 2 هو الركيزة "CUT" (31 ده كده و 27 كده). في الممرات 3-9 وشملت مركبات مختلفه لاختبار نشاطها المثبطة. لين 4 يحتوي علي مثبط E64d التكافؤ. وقد تم تشغيل هذه التفاعلات بين عشيه وضحيها ل ~ 17 ساعة في درجه حرارة الغرفة. وكان من اللازم غلي العينات لتحقيق نمط النطاقات الحاد. NsP2 البروتياز مرئية (56 كده) في ردود الفعل التي تحتوي علي انزيم, ولكن ليس في حاره 1. لين 1 هو السيطرة "لا انزيم". يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ولا ينظر إلى التدمير الخاص بالتسلسل للبروتين أو الحمض النووي الموجه بتسلسل أجنبي الا في حالات قليله في علم الاحياء. أليات المبينة في الشكل 1 هي أليات الدفاعية التي تحمي المضيف من فيروس ، أو فيروس من المضيف.

باستخدام أساليب المعلوماتية الحيوية يمكننا تحديد الأهداف التي دمرتها هذه الانظمه. في تحليلاتنا لمتواليات SSHHP ، اكتشفنا ان العديد منها يمكن العثور عليها في البروتينات اللازمة لتوليد الاستجابات المناعية الفطرية. وكان بعض الأدوار واضحة مثل mavs و trif (TIR-المجال التي تحتوي علي محول-يحفز المضادة للفيروسات-β) ، في حين ان البعض الآخر كانت تتعلق الحصانة علي الرغم من أليات أكثر تعقيدا (علي سبيل المثال ، histone H3 ، SFRP1 ، FOXG1)8،9. المعلومات الهدف المخزنة في تسلسل SSHHP لديه القدرة علي تحديد المسارات التي لها تاثيرات مضاده للفيروسات ضد هذه الفيروسات. الاستجابات المضادة للفيروسات في فيفو غالبا ما تكون محدده الفيروسات26,43. علي سبيل المثال ، مجموعات فرعيه من البروتينات تقليم لها اثار مضاده للفيروسات علي مختلف الفيروسات43،44،45، وبعضها عوامل تقييد الفيروسية (علي سبيل المثال ، فيروس نقص المناعة الTRIM5α). خصوصية البروتينات تقليم (~ 70 وقد تم تحديد) لا يزال يجري فحص44،45. المعلومات داخل SSHHPS قد تسهم في فهمنا لكيفيه التهرب من هذه الفيروسات الاستجابات المناعية الفطرية. ويمكن الكشف عن أنماط أخرى والارتباطات كما يتم فحص مزيد من SSHHPS.

وكانت الاختلافات الخاصة بالأنواع واضحة في تحليلاتنا (الشكل2، الشكل 10). ومن المعروف ان هذه الفيروسات تؤثر علي بعض الأنواع أكثر من غيرها. قد تكون معلومات حول نطاق المضيف وقابليه المضيف ودفاعات المضيف موجودة داخل SSHHPS. علي سبيل المثال ، الخيول ، والأنواع الأكثر عرضه للفيروسات التهاب الدماغ الخيول ، تفتقر إلى منطقه TRIM14 البشرية التي تم قطعها بشكل عابر من قبل الانزيم البروتيني VEEV nsP2. البشر نادرا ما يموتون من التهابات VEEV ولكن يمكن ان يصاب24. الإنسان TRIM14 البروتين حملت nsP2 البروتيني الانقسام تسلسل6. يشير وجود موقع الانشقاق إلى ان البشر لديهم اليه دفاعيه ضد هذه الفيروسات. وقد يعتقد ان الطيور الخزانات المحتملة لهذه الفيروسات46. واختلف تسلسل SSHHP المقابل في بروتين TRIM14 من الدجاج عن المتواليات الموجودة في البشر والأنواع الأخرى. قد تجعل الاختلافات خفيه مثل هذه أونكليافابلي البروتين المضيف الهدف أو أكثر بسهوله المشقوق. واظهر اغيري وآخرون16 ان بروتين سلسله أونكليافابلي تحور المستحثة مستويات اعلي من ifn بعد عدوي فيروس الضنك وان الفئران تحمل بطبيعة الأمر نسخه من لدغه التي لا تقطعها حمي الضنك ns2B3 البروتياز. لم يتم قطع البروتين المغلف murine بواسطة الانزيم البروتيني ZIKV47. في تحليل SSHHPS لدينا ، لاحظنا أيضا الاختلافات في تسلسل الانقسام زيكف البروتياز الموقع عندما قارننا البروتينات البشرية مع تلك القوارض6 (الشكل 10د). قد يكون استنساخ انقسامات البروتينية الخاصة بالأنواع من البروتينات المضيفة مهما في النماذج الحيوانية المستخدمة لفيروسات المجموعة الرابعة. تثبيط انشقاق البروتين المضيف له أيضا اثار فيما يتعلق بتطوير مثبطات الانزيم البروتيني المجموعة الرابعة. في المنشور السابق ، أظهرنا اننا يمكن ان تمنع TRIM14 الانقسام من قبل البروتيني VEEV nsP2 باستخدام CA074 استر الميثيل6. وتشير هذه النتيجة إلى ان مثبطات جزيء صغير من هذه بروتياسيس قد تكون قادره علي تعديل الاستجابات المناعية الفطرية التي هي قادره علي قمع العدوى6,31.

الاختلاف الجيني داخل الأنواع أيضا لديه القدرة علي إنتاج الاختلافات في الانقسام البروتيني. الاختلافات خفيه في استخدام كودون يمكن ان تؤثر علي الريبوسوم التوقف48. وبما ان بعض البروتينات الفيروسية المجموعة الرابعة مضمنه في غشاء الحركة المؤقتة ، فان الاختلافات في هذه التوقفات يمكن ان تؤثر علي انشقاق الهدف إذا حدث الانشقاق بشكل مشترك. وكانت بعض المواقع الانشقاق التي حددناها في تسلسل الببتيد اشاره المتوقعة (علي سبيل المثال ، SFRP1) في حين ان البعض الآخر كانت داخلية.

تحليل SSHHPS يمكن ان تنتج المعلومات التي تختلف عن غيرها من أساليب تحليلات البروتين المضيف. وكان تحليل SSHHPS غير مكلفه وسهله الاستخدام. وقد سمح استخدام نظام التعبير البكتيري باختبار الأجزاء القصيرة (~ 25 من الأحماض الامينيه) من متواليات الثدييات دون استخدام ثقافة خلايا الثدييات. وجدنا ان ركائز اف بي اف-YFP كانت قادره علي تحمل كل من تسلسل البروتين البشري اختبارها; ومع ذلك ، تباينت الغلة. في اختبارات مماثله, ركائز التي تحتوي علي تسلسل البروتين البشري طالما تم التعبير عن الأحماض الامينيه 63 بنجاح, تنقيه, وتستخدم للتحليلات الحركية وفحص المثبط49,50,51. بما ان فقط كميات صغيره من الركيزة لازمه لمقايسة متقطعه, [ا لرج نومبر] الأهداف يستطيع كنت استكشفت. ومن مزايا هذا النظام انه يمكن استخدام الركائز التي تستخدم في التحليل التفصيلي لصفحات المخزونات والتحليلات الحركية الأكثر تفصيلا (اي IC50، ki، km، Vmax). لاكتشاف المخدرات ، يمكن ان تنتج المركبات المثبطة التحف في اختبارات الفلورسنت. وهكذا ، فان الفحص المتقطع في تركيبه مع الفحص المستمر يسمح لأحد بتاكيد الانشقاق أو تثبيط الانقسام. ويمكن أخذ العينات الخاصة بالمقايسة المتقطعة لصفحات SDS مباشره من لوحات 96. وقد استخدمت ركائز الباسيفيكي/YFP لمكتبه مجمع الفرز52. غير انه يلزم اجراء تحليلات اضافيه لتحديد ما إذا كانت الركيزة مناسبه للفحص العالي الإنتاجي مثل حساب العامل Z53.

تحدي واحد في تصميم الركيزة هو تحديد المنطقة حول السندات سسيسيلي التي هي ملزمه والمعترف بها من قبل الانزيم البروتيني. في الامثله المعروضة هنا ، بدانا مع 12 تسلسل بقايا التي كانت تتمحور حول السندات سسيسيلي. بعد يحلل تسلسل تحالفات من الانشقاق موقعات [هومولوج] إلى البقايا [ن-ترمينل] من ال [سسيسيلي بوند] كان أسست ل ال [فيف] البروتياز, حيث ان ل ال [زيكف] البروتياز [هوثلوج] إلى عده من ال [ك-ترمينل] رواسب كان أسست. ويمكن استخدام نموذج سيليكو من الركيزة رست لتصميم التجارب الطفرات الموجهة الموقع التي التحقيق في مواقع ملزمه من الركيزة. بما ان الركيزة وانزيم تسلسل علي البلازميدات, اما يستطيع كنت تحورت ان يختبر ال في [سلكو] نماذج أو موقعات فرعيه تفاوت. وهذا يمكن ان يكون مفيدا إذا كان هيكل الكريستال من الركيزة (ق) ملزمه غير متوفر.

وقد ينتج عن تحليل SSHHPS أيضا معلومات جديده عن أليات التي تنتج عن طريق الانزيمات الفيروسية الأنماط الظاهرية المستحثة بالفيروس. واحده من الأهداف zikv ، SFRP1 ، هو جزء من مسار الإشارات wnt ولها ادوار في كل من تنميه الدماغ والعين وفي الاستجابات المناعية36،37،54،55،56،57. وجدنا ان متواليات البروتين الأخرى التي يمكن ان تقطعها زيكف ns2B/ns3 البروتياز كانت أيضا في البروتينات المشاركة في تنميه المخ والعين; لوحظ وجود تشوات في كل من متلازمة زيكا الخلقية ويعتقد انها جزء من النمط الظاهري المستحث بالفيروس58.

ويمكن استغلال امكانيه التنبؤ بالتفاعلات بين المضيف والممرض بالنسبة لمجموعه متنوعة من التطبيقات: العلاجات الفيروسية المحددة الهدف ؛ أزاله المخاطرة بلقاحات الفيروسات الحية ؛ صقل النماذج الحيوانية أو التنبؤ بها أو اختيارها ؛ التنبؤ بالنطاق المضيف أو القابلية ؛ التنبؤ بالاحداث الحيوانية الحيوانية ؛ والتنبؤ بالدفاعات المضيفة. وبما ان الأساليب الموصوفة تستند إلى التسلسل ، فانها قد تكون ذات قيمه لدمجها في البرمجيات في المستقبل.

Disclosures

الآراء المعرب عنها هنا هي تلك التي للمؤلفين ولا تمثل تلك التي من الولايات الامريكيه البحرية ، الجيش الأمريكي ، الولايات الامريكيه وزاره الدفاع ، أو الحكومة الامريكيه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل وكاله الدفاع عن الحد من التهديد (DTRA) أرقام المشروع CB-البذور-SEED09-0061 و CBCall4-CBM-05-2-0019 ، وجزئيا من قبل برنامج البحوث داخل المبني/خارج الأورال من NCATS ، المعاهد القومية للصحة (XH) والبحوث البحرية قاعده مختبر الصناديق.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934 (2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894 (2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16 (2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347 (2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).

Tags

المناعة والعدوى ، الإصدار 154 ، الانزيم ، الفحص ، التاكل ، البروتين غير الهيكلي ، البيهفيروس ، المجموعة الرابعة ، البروتياز ، SSHHPS ، فحص الهلام ، في المختبر ، التحام
تحليل المجموعة الرابعة SSHHPS الفيروسية باستخدام في المختبر وأساليب Silico
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P.… More

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter