Summary
我们提出了一个通用方案，用于识别嵌入在病毒多蛋白中的同源宿主病原体蛋白序列（SSHHPS）的短段。SSHHPS被病毒蛋白酶识别，并指导几种IV组病毒对特定宿主蛋白的定向破坏。
Abstract
Α病毒酶在单个多肽中合成。非结构多蛋白 （nsP） 由其 nsP2 半胱氨酸蛋白酶处理，以产生病毒复制所必需的活性酶。病毒蛋白酶是高度特异性的，并识别保守的裂解位点图案序列（#6-8氨基酸）。在若干IV组病毒中，nsP蛋白酶（s）裂解位点图案序列可以在参与产生先天免疫反应的特定宿主蛋白质中找到，在某些情况下，靶向蛋白似乎与病毒引起的表型有关。这些病毒利用短段的同源宿主病原体蛋白序列（SSHHPS）来有针对性地破坏宿主蛋白。为了识别SSHHPS病毒蛋白酶裂解位点图案序列可以输入到BLAST和宿主基因组可以搜索。裂解最初可以使用纯化的nsP病毒蛋白酶和荧光共振能量转移（FRET）基质在大肠杆菌中进行测试。FRET基质含有青色和黄色荧光蛋白和裂解位点序列（CFP序列-YFP）。这种蛋白酶测定可以连续用于板片读取器，也可以在SDS-PAGE凝胶中连续使用。在硅酸盐中可以生成结合肽基板的模型，以指导基质的选择和诱变研究。CFP/YFP基质也被用于识别蛋白酶抑制剂。这些体外和硅胶方法可与基于细胞的测定相结合，以确定靶向宿主蛋白是否影响病毒复制。
Introduction
水平基因从病毒转移到宿主，或宿主病毒的证据，可以在各种基因组1，2，3，4中找到。病毒内元化的例子是在细菌宿主基因组4中发现的CRISPR间隔序列。最近，我们发现宿主蛋白序列嵌入（+）sSRNA IV组病毒的非结构多蛋白中的证据。病毒基因组编码区域内的这些序列可以代代传播。在病毒和宿主5，6中发现同源宿主病原体蛋白序列（SSHHPS）的短段。SSHHPS 是病毒蛋白酶识别的保存性裂解位点图案序列，与特定的宿主蛋白具有同源性。这些序列直接破坏特定的宿主蛋白。
在上一份出版物6中，我们编制了病毒蛋白酶所针对的所有宿主蛋白的列表，发现目标列表是非随机的（表1）。两种趋势显而易见。首先，切割宿主蛋白的病毒蛋白酶大部分属于IV类病毒（25例中24例涉及IV组病毒蛋白酶），其中1个蛋白酶属于（+）ssRNA VI类逆转录病毒（HIV，人体免疫缺陷病毒）7。其次，病毒蛋白酶切割的宿主蛋白靶点通常参与产生先天免疫反应，这表明裂解旨在对抗宿主的免疫反应。病毒蛋白酶所针对的宿主蛋白的一半是产生干扰素（IFN）和亲炎细胞因子的信号级联的已知成分（表1）。其他人参与主机细胞转录8，9，10或翻译11。有趣的是，Shmakov等人4已经表明，许多CRISPR原间隔序列对应于参与质粒结合或复制4的基因。
第四组包括弗拉维里达、皮科纳维里达、科罗纳维里达、卡尔西维里达和托加维里达。若干新的和正在出现的病原体属于第四类，如寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、严重急性呼吸系统综合症病毒（SARS）和中东呼吸综合征病毒（MERS）。（+）ssRNA基因组本质上是一个mRNA的片段。要产生基因组复制所需的酶，首先必须翻译（+）ssRNA基因组。在α病毒和其他IV组病毒中，复制所需的酶在单个多蛋白中产生（即，用于VEEV的nsP1234）。非结构多蛋白 （nsP） 由 nsP2 蛋白酶 （nsP1234 nsP1、 nsP2、 nsP3、 nsP4） 进行蛋白酶处理，以产生活性酶12（图 1）。nsP2蛋白酶的多蛋白分裂是病毒复制所必需的;这已经证明通过删除和站点导向的诱变活性网站半胱氨酸的nsP2蛋白酶13，14。值得注意的是，病毒蛋白的翻译先于基因组复制事件。例如，nsP4 包含复制 （+） sRNA 基因组所需的 RNA 依赖RNA 聚合酶。基因组复制可以产生dsRNA中间体;这些中间体可以触发宿主的先天免疫反应。因此，这些病毒可能在感染早期分离宿主先天免疫反应蛋白，以抑制其影响15、16、17。
沉默可能发生在DNA，RNA和蛋白质的水平。图1所示的每个沉默机制的共同点是，短的外来DNA、RNA或蛋白质序列用于指导特定靶点的破坏，以对抗其功能。沉默机制类似于用三种不同语言编写的"搜索和删除"程序。短的裂解站点序列类似于"关键字"。每个程序都有一个酶，用于识别要删除的"文件"中的短序列（"关键字"）和单词之间的匹配。一旦找到匹配，酶切割（"删除"）更大的目标序列。图 1所示的三种机制用于保护宿主免受病毒侵害，或保护病毒免受宿主免疫系统的攻击。
病毒蛋白酶识别+2-11氨基酸之间的短裂解位点图案序列;在核苷酸中，这相当于6-33个碱基。比较而言，CRISPR间隔序列为+26-72核苷酸，RNAi为+20-22核苷酸18，19。虽然这些序列相对较短，但可以专门识别它们。鉴于氨基酸的分集性较高，对于识别6-8个氨基酸或更长蛋白质序列的病毒蛋白酶，随机裂解事件的概率相对较低。宿主蛋白中SSHHPS的预测将在很大程度上取决于被检查的病毒蛋白酶的特异性。如果蛋白酶有严格的序列特异性要求，则找到裂解位点序列的几率为 1/206 = 6400 万分之一或 1/208 = 256 亿分之一;然而，大多数蛋白酶具有可变的子位容差（例如，R 或 K 在 S1 站点中可以耐受）。因此，在主机与病毒的序列之间不需要序列标识。对于具有较宽松序列要求的病毒蛋白酶（如属于Picornaviridae 的蛋白酶），在宿主蛋白质中发现裂解位点的概率可能更高。表1中的许多条目来自皮科纳维里达家族。
Schechter & Berger 符号20通常用于描述蛋白酶基质中的残留物及其结合的子位，我们始终使用此表示法。成板中成型粘结N端子的残留物表示为P3-P2-P1，而C端子的残留物表示为P1'-P2'-P3'。结合这些氨基酸残留物的蛋白酶中的相应子位分别是S3-S2-S1和S1'-S2'-S3'。
为了确定哪些宿主蛋白被瞄准，我们可以在病毒多蛋白裂解部位识别SSHHPS，并搜索含有它们的宿主蛋白。在这里，我们概述了使用已知的病毒蛋白酶裂解位序列识别SSHHPS的过程。生物信息学方法、蛋白酶测定和硅胶方法中描述，旨在与基于细胞的测定结合使用。
病毒蛋白酶所针对的宿主蛋白的序列排列揭示了这些短裂解位序列中物种特异性的差异。例如，委内瑞拉的马匹脑炎病毒（VEEV）nsP2蛋白酶被发现切割人类TRIM14，一种三方图案（TRIM）蛋白6。一些TRIM蛋白是病毒限制因子（例如，TRIM5_21），大多数被认为是泛于E3的利气。TRIM14缺乏一个RING（真正有趣的新基因）域，不被认为是一个E3利带22。TRIM14已被建议作为线粒体抗病毒信号体（MAVS）22的适配器，但可能具有其他抗病毒功能23。不同物种的TRIM14序列的对齐表明，马缺乏裂解位点，并怀有缺少C-终端PRY/SPRY域的TRIM14截断版本。此域包含多聚体化位点 （图2）。在马，这些病毒是高度致命的（+20-80%死亡率），而在人类只有+1%死于VEEV感染24。PRY/SPRY 域的裂解可能会暂时短路 MAVS 信令级联。这种级联可以由dsRNA触发，并导致干扰素和亲炎细胞因子的产生。因此，SSHHPS的存在对于预测哪些物种具有针对特定IV类病毒的防御系统可能很有用。
在第四组病毒中，IFN对抗机制被认为是倍增冗余25。宿主蛋白裂解在感染期间可能是短暂的，浓度可能随着时间的推移而恢复。我们在细胞中发现TRIM14裂解产物在转染（6小时）后可以非常早期地被检测到，其质粒编码蛋白酶（细胞巨细胞病毒促进剂）。然而，在较长的周期，裂解产物未被检测出来。在受病毒感染的细胞中，动力学不同，裂解产物可在6-48 h6之间检测到。其他人已经报告，早在感染9-6小时后，宿主蛋白裂解产物出现，11。
细胞中的蛋白水解活性往往难以捕获;裂解产物的溶解度、浓度、稳定性和寿命各不相同。在基于细胞的检测中，不能假定裂解产物会积聚在细胞中，或者切割和未切割蛋白的带强度会显示出补偿性增减，因为切割蛋白可能很快降解，并且可能无法在以预期分子量（MW）的西方污点中检测到（例如，包含表皮的区域可能被其他宿主蛋白酶压碎或可无用）。如果病毒蛋白酶的基质是先天免疫反应蛋白，其浓度在感染期间可能会有所不同。例如，一些先天免疫反应蛋白在病毒感染之前存在，由干扰素26进一步诱导。因此，目标蛋白的浓度在感染期间可能会波动，并且对未感染细胞和受感染的细胞解热物的比较可能难以解释。此外，所有细胞可能不会均匀转染或感染。另一方面，使用大肠杆菌的纯化蛋白质进行体外蛋白酶检测，其控制变量较少，因此可以使用 SDS-PAGE 而不是免疫图。在CFP/YFP基质蛋白质纯化的早期阶段，可以抑制污染蛋白酶，而突变的病毒蛋白酶可以作为对照物进行纯化和测试，以确定裂解是否由于病毒蛋白酶或污染细菌蛋白酶所致。
体外蛋白酶测定的一个局限性是它们缺乏哺乳动物细胞的复杂性。要切割其基质的酶，两者必须共同本地化。第四组病毒蛋白酶在结构和定位上有所不同。例如，ZIKV蛋白酶嵌入内质视网膜（ER）膜，面对细胞醇，而VEEV nsP2蛋白酶是细胞质和细胞核27中的可溶性蛋白质。ZIKV SSHHPS 分析中发现的一些裂解位点序列是在信号肽中，表明某些靶点可能以共翻译方式发生裂解。因此，在这些分析中还需要考虑蛋白酶和基质在细胞中的位置。
基于细胞的检测对于确定在感染中的宿主蛋白的作用有价值。旨在阻止宿主蛋白的病毒蛋白酶裂解的方法，如添加蛋白酶抑制剂6或宿主靶16的突变，可用于检查其对病毒复制的影响。靶向蛋白的过度表达也可能影响病毒复制28。斑块测定或其他方法可用于量化病毒复制。
Protocol
1. 生物信息学：使用BLAST识别宿主基因组中的SSHHPS
注：蛋白质 BLAST 可在 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 找到。
- 输入+20个氨基酸围绕病毒多蛋白的剪刀键。选择非冗余蛋白质序列，并在要搜索的宿主基因组中键入（例如，智人）。
- 如果需要，请选择 PHI-BLAST。键入型板序列（例如，对于下面所示的 V12 的 25 个残留物，请输入不带引号的型板"AG"）。
注：在 PHI-BLAST 中，方括号 [XY] 表示氨基酸 X 或 Y 可以位于子位置（例如，AG[AC][GAY]）。 - 检查 BLAST 结果，并确定对多蛋白裂解位点中保存的残留物具有高序列标识的命中（例如，三方图案蛋白 14）（图 3）。
注：对于丝氨酸蛋白酶，P1残留物的保存率更高，而半胱氨酸蛋白酶则有望对P2残留物进行更高的保存。 - 为与裂解位点序列相同且顺序（无间隙）的残留物着色。对子站点中耐受的残留物进行着色，但以第二种颜色呈现在不同的裂解位点中。
注：代表保守替代的残留物（例如，Leu vs. Val）在病毒裂解部位不存在，也可能被病毒蛋白酶识别，也可能无法识别。 - 根据与裂解位点序列匹配的连续相同或耐受残留的数量，对 BLAST 命中进行排名排序。从列表中选择含有#6相同或类似残留物的蛋白质，用于蛋白酶测定分析。
- 重复其他裂解位点（nsP2/3、nsP3/4等）的过程，并通过在PHI-BLAST模式中添加更多高度保守的残留物来逐步加强预测。
- 如果需要，请选择 PHI-BLAST。键入型板序列（例如，对于下面所示的 V12 的 25 个残留物，请输入不带引号的型板"AG"）。
2. 体外测定：设计和制备蛋白酶基质
- 构造一个质粒编码青色荧光蛋白（CFP），+25氨基酸的裂解位点序列，其次是黄色荧光蛋白（YFP，也称为金星29）。
注：质粒可采用序列和结扎独立克隆（SLIC）30或商业基因合成。包含图4所示序列的Pet15b质粒是商业合成的，并在这里使用。- 为了优化基板长度，使用2片SLIC反应构建含有12-25个氨基酸的天然病毒多蛋白裂解位点序列的额外可变长度FRET基板。使用基于 SDS-PAGE 凝胶的测定或使用以下方法测量稳态动力学参数来分析裂解。
注：在某些情况下，裂解位点可以通过同源识别到已知的裂解部位31。如果未观察到含有多蛋白结序列的基质的裂解，则可能需要额外的残留物或结构图案（例如，α螺旋32）。或者，纯化的病毒蛋白酶可能处于非活性状态。在进行SSHHPS分析之前，确认病毒多蛋白序列的裂解。基材中的残留物数量针对VEEV蛋白酶进行了优化，使用可变长度基质（12至25个氨基酸），然后分析Vmax和Km32，33。示例中使用的寨卡病毒 ns2B/nsB 蛋白酶裂解位点已发表34、35。
- 为了优化基板长度，使用2片SLIC反应构建含有12-25个氨基酸的天然病毒多蛋白裂解位点序列的额外可变长度FRET基板。使用基于 SDS-PAGE 凝胶的测定或使用以下方法测量稳态动力学参数来分析裂解。
- 通过全新转化 BL-21（DE3） 的 8-20 μL 来制备 CFP/YFP 基板E. coli根据制造商的指示和在Luria Bertani （LB） 含有 50 μg/mL 阿霉素 （37 °C） 的琼脂板上的具有 CFP-V12-YFP 质粒的合格细胞。
- 高压灭菌器四个 4 L 烧瓶，在 250 mL 烧瓶中含有 LB 介质（每瓶 1.5 L 介质）和 100 mL LB。用铝箔盖住每个烧瓶。
- 用一批新转化的细菌接种100 mL培养基，在37°C下生长，一夜之间摇动（200 rpm）。
- 要制造 CFP/YFP 基板，请用 25 mL 的隔夜培养物为 4 个 4 L 瓶。在 37°C 下开始摇动培养物，并以每小时 600 nm 的紫外线光谱监测生长。
- 当细菌在600nm（约+3-4小时生长）达到±1.0的吸收度时，每烧瓶加入0.5 mL的1M等丙基-β-D-硫拉酮（IPTG）来诱导蛋白质表达。加入IPTG后，将摇动培养箱的温度降至17°C，并允许表达在17-20小时内持续过夜。
- 使用 7，000 x g的高速离心机将细菌颗粒10分钟（4 °C），并保留颗粒。拆下并丢弃液体介质。立即将颗粒储存在-80°C或莱塞。
- 制备含有50mM Tris pH 7.6、500 mM NaCl、35 mL细菌蛋白提取试剂、30mg溶解酶、25 U DNase和1个蛋白酶抑制剂片剂的100 mL赖酶缓冲液。用移液器将颗粒重新悬浮在赖液缓冲液中，并将 ±25-35 mL 转移到 50 mL 一次性锥形管中。
- 将管子放在装有冰水的塑料烧杯中。将声波器尖端插入管中，使尖端距管底约 1 厘米，并在 5 级将奶嘴声波 10-20 次，间隔 15 秒，直到液化液化。
注：在声波过程中使用听力保护。 - 将液前转移到高速离心管和离心机在20，500 x g下，在4°C下30分钟。旋转后，保留上清液（±100 mL），并将其转移到干净的瓶子中。丢弃颗粒。
- 准备 1 L 缓冲器 A（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl）。准备 300 mL 的缓冲液 B（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl，300 mM Imidazole）。
- 使用 3 列缓冲器 A 和 5 mL/min 的流速对 100 mL 镍柱进行平衡。
- 使用 2 到 5 mL/min 的流速将分瓶剂加载到镍柱上。用 2 列卷的缓冲区 A 清洗该列，然后用 ±5 列卷的 20% 缓冲区 B 清洗。在 20% 缓冲 B 洗涤过程中，280 nm （A280）处的吸收率会随着污染物在洗涤过程中从柱中溢出而增加。继续洗涤列，直到 E280的洗净度已返回到基线值。
- 使用2-5 mL/min的流速，用2-3列体积100%缓冲B来洗取蛋白质，并收集10 mL分数。测量每个分数的 A280。
- 使用 15 mL 离心超滤单元组合和浓缩包含 A280 > 0.1 的分数。在 5，000 x g下旋转超滤装置 15 分钟，并继续添加馏分，直到体积降至 +50-75 mL。
- 切割一个14英寸的透析管，分子量截止（MWCO）为6-8 kDa。将透析管煮沸，将其完全浸入 300 mL 水中 10 分钟，在膜的一端打上一个安全结。向袋子中填充透析缓冲液，以确保不存在裂纹或泄漏。从袋子中取出缓冲液，并将袋子浸入透析缓冲液中。
- 用塑料移液器将浓缩蛋白从2.2.13转移到透析袋中。从袋子中取出所有气泡。用第二个结或透析夹合起袋子。在 500 mL 分级气缸中，在 500 mL 分级气缸中，在 500 mL 的圆柱体中，将蛋白质与 50mL 的 50mM Tris pH 7.6、5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）进行透析，在 500 mL 分级气缸中，在 500 mL 中，在 250 mM NaCl 中过夜。
- 在4°C下，对500 mL的500 mM Tris pH 7.6进行2小时第二次透析。
- 对于阴年交换列，准备 500 mL 的缓冲器 A（50 mM Tris pH 7.6）和 500 mL 缓冲液 B（50 mM Tris pH 7.6，1.0 M NaCl）。将 30 mL 的 ANion 交换列与 3 列缓冲区 A（2-5 mL/min）的体积进行平衡。
- 从透析袋中取出蛋白质，然后转移到瓶子里。把瓶子放在冰上。将透析蛋白加载到柱上（2-5 mL/min）。
注：CFP/YFP蛋白将结合柱，在外观上为黄色。 - 使用缓冲区 A 清洗列，直到 A280返回到基线（5 mL/min）。使用梯度（0-50%缓冲B，100 mL）洗取蛋白质，并收集10 mL分数。
- 使用 SDS-PAGE 检查列分数。结合那些大于95%的纯度。
- 使用15 mL离心超滤装置将蛋白质浓缩至A 280±10-20。在 4°C 下以 4，500 x g旋转浓缩器 10 分钟，并继续添加蛋白质，直到所有含蛋白质的馏分被合并。
- 从透析袋中取出蛋白质，然后转移到瓶子里。把瓶子放在冰上。将透析蛋白加载到柱上（2-5 mL/min）。
- 用移液器小心地从集中器中取出蛋白质。将蛋白质与1.5 mL微离心管中分光，在液氮中闪冻，在-80°C下长期储存。缓冲液在室温下使用与适当的测定缓冲液在使用前与适当的测定缓冲液平衡的PD-10柱交换蛋白质。
- 使用啤酒定律使用 A280和计算的消光系数计算蛋白质浓度（例如，对于 V12 基板 ， = 47，790 M-1 cm-1）。
注：消光系数 （*） 可以从图 4中的蛋白质序列中使用 Expasy ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/） 进行计算。
3. 阿尔法病毒nsP2半胱氨酸蛋白酶的准备
- 设计和构建一个质粒编码蛋白酶。对于半胱氨酸蛋白酶，使用pet32质粒来构建一种异体毒素（Trx）融合蛋白。
注意：Pet32 质粒编码血栓裂解位点 （LVPRGS）， 用于去除异恶症和他标记 （图 5).蒂奥雷多辛有助于在表达过程中将活性部位半胱氨酸保持在减少状态。对于丝氨酸蛋白酶，不需要使用三恶血素，可以省略其通过血栓去除的步骤。VEEV nsP2蛋白酶序列被合并到Pet32b质粒中，该质粒是商业制备的，以避免处理选择剂。- 根据制造商的指示，将质粒DNA新鲜转化为BL21（DE3）大肠杆菌。在含有安平的LB琼脂板上将细菌板板。
注：氯霉素仅用于携带pLysS质粒的大肠杆菌菌株，如果使用BL21（DE3）细胞，则省略。在此步骤中，无需在 LB 琼脂板上加入氯霉素。 - 高压灭菌器 4 个 4 L 烧瓶，1.5 L LB 介质（6 L 总体积）和 100 mL LB，在 250 mL 烧瓶中。用铝箔盖住每个烧瓶。
- 用板中的菌落接种100 mL的LB/Ampicillin过夜培养，并在37°C下在摇动的培养箱（200 rpm）中生长。
- 用25 mL的隔夜培养剂为4 L烧瓶接种，并加入适当的抗生素。
注：携带Pet32质粒的BL21（DE3）pLysS细胞的介质最终浓度应为25微克/mL氯霉素和50μg/mL安霉素。 - 当600nm的吸收达到1.0时，通过在培养物中加入0.5 mL的IPTG诱导蛋白质表达。将摇动培养箱的温度降至17°C。允许表达式在一夜之间继续 （+17 h）。
- 通过离心将细胞颗粒（7，000 x g在 4 °C 下 10 分钟）。拆下并丢弃液体介质。
注：颗粒可在-80°C下储存数月或立即分颗。 - 制备100 mL的赖氨酸缓冲液（50 mM Tris pH 7.6， 500 mL NaCl， 2 mM β甲酰乙醇 （BME）， 30毫克液化酶， 5% 甘油， 25 U DNase， 35 mL 细菌蛋白提取试剂）.添加时，在化学罩中打开 BME 瓶。将细菌酸酶保存在冰上或4°C，用于本步骤和所有后续步骤。
注：对于半胱氨酸蛋白酶，包括2 mM BME，以保持核亲子血氨酸减少。可以使用冷冻缓冲器在室温下运行柱子。缓冲液应用冷脱离子水冷却至4°C。 - 将细菌颗粒重新悬浮在±25 mL的赖沙缓冲液中，并将+25 mL的赖沙液转移到4 x 50 mL一次性锥形管中。将管子放入含有冰水的塑料烧杯中。在 5 级以 15 秒的间隔将液中的液平进行 10 次声波处理。
- 将液化液转移到高速离心管中。通过离心来澄清分糖（30分钟，20，500 x g，在4°C下）。
- 准备 0.5 L 的缓冲液 A（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl，5% 甘油，2 mM BME），冷却至 4°C。
- 准备 250 mL 的缓冲液 B（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl，5% 甘油，2 mM BME，300 mM imidazole），冷却至 4°C。
- 将50 mL镍柱与3列缓冲器A的体积平平。以2-5 mL/min将澄清的利雅液加载到该柱上，并丢弃颗粒。
- 用 2 列卷的缓冲区 A 洗涤列（2-5 mL/min），然后清洗包含 20% 缓冲 B（60 mM Imidazole）的 5 列缓冲区 A。用100%缓冲B洗取蛋白质（5 mL/min），并收集10 mL分数。
- 使用 15 mL 离心超滤单元，在 5，000 x g 下，使用 15 mL 离心超滤单元，结合和浓缩含有 A280 × 0.1 的蛋白酶的馏分，在 4°C 下，在 5，000 x g下旋转 15 分钟。体积减小到+5 mL后，缓冲液通过向蛋白质中加入新鲜透析缓冲液（50 mM Tris pH 7.6，250 mM NaCl，5 mM 二硫二硫醇 （DTT），1 mM EDTA，5% 甘油，交换浓缩单位中的蛋白质。在 4°C 下以 5，000 x g再次旋转 15 分钟;重复缓冲区交换步骤 2-3 次。在透析前向蛋白质（1个单位/μL的20 μL）中加入血栓，以去除三恶比毒素和其标记。
- 将蛋白质转移到透析袋中，在500 mL分级气缸中对透析缓冲液（4 °C）进行透析，并透析。
注：FPLC（快速蛋白液相色谱）系统和镍柱在进入阴热交换柱之前，应用剥离缓冲液（2 M NaCl，50 mM EDTA）彻底清洁。混合时，FPLC 管路中的任何残留镍都会使含有 DTT 的缓冲溶液变成棕色。用 4 柱水清洗镍柱和 FPLC 系统。泵用水彻底清洗 FPLC 系统。镍柱可以通过将 2 列体积的 0.2 M 硫酸镍流过树脂以进行后续净化来再生。
- 根据制造商的指示，将质粒DNA新鲜转化为BL21（DE3）大肠杆菌。在含有安平的LB琼脂板上将细菌板板。
- 对于海龙交换柱准备 1 L 的缓冲器 A （50 mM Tris pH 7.6， 5 mM DTT， 5% 甘油）。
- 准备 0.5 L 的缓冲液 B（50 mM Tris pH 7.6，5 mM DTT，5% 甘油，1.25 M NaCl）。
- 使用缓冲区 A（3 列卷，2-5 mL/min）将 30 mL 的 ANion 交换列模平衡。将管放在分数收集器中，以收集流通过。
注：VEEV 蛋白酶的计算等电点 （pI） 为 8.7，将绑定阳离子交换列，但会流经离子交换列。pI 可以从蛋白质序列中计算，使用 Expasy ProtParam 程序 （https://web.expasy.org/protparam/） - 使用缓冲液 A 稀释透析蛋白 1：3，然后加载蛋白质（5 mL/min）。以 10 mL 分数收集流通。
- 从 FPLC 系统移除网的网内交换列。将阳离子交换列连接到 FPLC 系统。将 30 mL 阳离子交换列与 3 列缓冲区 A（5 mL/min）的体积进行平衡。
- 以 2-5 mL/min 的速度将通过阳离子交换列的流量加载到阳离子交换列上。使用缓冲区 A 清洗该列，直到 A280返回到基线水平。用100 mL梯度（0-50%缓冲B）洗取蛋白质，并收集10 mL分数。
注：VEEV 蛋白酶将在 0.6 M NaCl 左右洗去。 - 使用 SDS-PAGE 检查列分数。使用 15 mL 离心超滤单元将纯度 >95% 的馏分组合到 A280 + 2。该酶可闪冻在液氮中，并储存在-80°C。
- 以 2-5 mL/min 的速度将通过阳离子交换列的流量加载到阳离子交换列上。使用缓冲区 A 清洗该列，直到 A280返回到基线水平。用100 mL梯度（0-50%缓冲B）洗取蛋白质，并收集10 mL分数。
4. 使用板式读取器连续对酶进行加成
- 准备 50 mL 的测定缓冲液 （50 mM HEPES pH 7.0）。
- 由于αviral蛋白酶具有相对较低的k猫值，将测定缓冲液中的酶稀释至4.7μM（这大致对应于无Trx的VEEV蛋白酶的A280 = 0.2）。
- 要测量酶的活性，在浓度为185 μM的测定缓冲液中制备基质;这大致对应于 A280 = 9。在8个微离心管中，通过组合185μM基底材和缓冲液的适当体积，制备表2所示的反应混合物。在黑色半区域 96 孔板移液器 45 μL 的反应混合成 3 孔 （列 1， 2， 3）.行 A 应包含 [S] = 5 μM 反应混合，行 H 应包含 [S] = 140 μM 反应混合。
- 设置板读取器，通过固定光电倍增管 （PMT） 设置（例如低）同时检测两个波长的荧光：
波长 1 激发 = 434 nm，发射 = 527 nm
波长 2 激发 = 434 nm，发射 = 470 nm - 将读取时间设置为 20 分钟（每分钟读取 1 次），然后选择要读取的井。将板插入板读取器，测量水解的自发速率 20 分钟。监测随时间的发射比率（527/排放 470）。
- 运行包含"UNCUT"基板的端点读取。
注：这些值将用于后续数据计算。3口井的排放比平均值为表3中t = 0的"UNCUT"基板值。 - 取出板，将5μL的酶移入每个孔中。再次读取板 20 分钟，每分钟读取 1 次。将板读取器设置为输出绝对值。
注：对于此测定，斜率将为负。每口井的总体积为50 μL。 - 在读取结束时，用薄膜密封板，以防止蒸发。将板放在室温下过夜，使酶完全切开基板。
- ±24 小时后，取出密封膜，并使用与先前板相同的 PMT 对板进行端点读取。在"CUT"下为这些排放比率和输入表3平均。使用下面描述的 SDS-PAGE 不连续测定（步骤 5.1.）确认基板的裂解。
- 将数据导出到电子表格。在 2 个波长的每个时间点输出荧光单位（表 4）。
- 使用方程 （1） 计算在时间 t 时切割的基板的 nmol，其中 X 是给定时间点的排放比 （527 nm/470 nm），否定是 t = 0 处"UNCUT" 基板的发射比，假设是 24 h 切割后测量的完全"CUT"基板的发射比（表 3）。
注：表4显示了一口井（井E7）的代表性荧光数据，其中含有80μM基质（每口井4 nmol S）。对板中的每口井进行了计算。 - 对于每个井，绘制 nmol 与时间（分钟），并通过将数据拟合 y = mx = b 来获取初始速度（斜率）。对于在 4.1.5 中收集的数据，绘制每个井的 nmol 与时间（分钟）的图解。斜率等于每分钟生产的 nmol 产品。从酶催化反应率中减去4.1.5中测得的水解的自发率（表5）。
注：如果由于板向板读取器移动而实际高，则可以从数据中剪切第一次读取。 - 计算添加到每个井中的酶（例如 0.0009 mg）的酶量（以 mg 表示）。单位定义为每分钟生产的产品μmol（μmol/min）。将 nmol/min 除以井中存在的酶毫克，以获得 mU/mg;除以 1，000 可获得 U/mg。
- 在 y 轴上的 x 轴和 U/mg 上绘制 [S] μM，并将数据拟合到 Michaelis-Menten 方程中，以获得 V最大值和 Km。这可以在软件中完成（例如，GraFit）。
5. 使用 SDS-PAGE 分析对酶进行不连续的分析
- 制备含有10μM基质和缓冲液的50μL反应，以代替酶，并贴上"UNCUT"的标签。
注：基材和缓冲液的体积如表2所示。如果已运行连续检测，则样品可以直接从 96 孔板使用。- 制备含有10μM基质和5μL酶的50μL反应，并贴上"CUT"的标签。当酶添加到基质时启动计时器。
注：抑制剂可以添加到含有酶和基质的其他管中。调整添加缓冲器的体积，以补偿抑制剂的添加体积。DMSO 的浓度不应超过 2%。 - 在室温（22 ~3°C）下孵育±15-24小时的反应。加入50 μL的2x莱梅利缓冲液，停止反应。停止反应沸腾后，每管3-10分钟。
- 根据制造商的指示组装凝胶罐。将17口预铸12%的聚丙烯酰胺凝胶盒和缓冲坝插入另一侧。用 1x SDS 运行缓冲器填充电池的内部储液罐，直到缓冲液到达盒式磁带的顶部。用相同的缓冲液将外部储液罐半满。
- 要使用不连续的测定分析裂解，将每种反应混合物的5μL加载到SDS-PAGE凝胶的通道中，从"UNCUT"反应开始。在第一条或最后一条车道上包括分子量标记。
- 将凝胶罐的电极连接到电源，并在 110 V 下分离产品 60 分钟。通过在板之间插入开裂工具，将凝胶从盒中取出。将凝胶放入塑料托盘中，将凝胶浸入凝胶染色溶液中 5-10 mL;波段将在 30 分钟内可见。1-24 小时后去除多余的污渍，将凝胶浸入水中，并使用凝胶成像仪拍摄凝胶照片。
- 制备含有10μM基质和5μL酶的50μL反应，并贴上"CUT"的标签。当酶添加到基质时启动计时器。
6. 将基底肽与VEEV-nsP2半胱氨酸蛋白酶对接
- 从 PDB 下载 VEEV 半胱氨酸蛋白酶的坐标文件 （https://www.rcsb.org/）PDB 代码为 2HWK。将文件另存为 2HWK.pdb。
- 使用 MOE （https://www.chemcomp.com/） 制备蛋白质结构。将蛋白质 PDB 文件加载到 MOE 中。单击右侧杆上的"选择"和"溶剂"，然后删除溶剂。
- 从顶部菜单栏蛋白质打开结构准备面板。通过单击"正确"自动校正所有结构项目，并通过单击Protonate3D来对结构进行质子。通过打开部分电荷面板并选择琥珀色99并根据需要调整氢和孤对，向蛋白质添加部分电荷。最后，将结构文件另存为"2HWK_dock.pdb"。
- 使用 MOE 构建基板肽（nsP12、nsP23、nsP34）和TRIM14的结构。打开蛋白质生成器面板，输入基板序列，将几何设置为"扩展"，然后单击"生成"。结构将显示在 MOE 窗口中。
- 通过单击面板上的"最小化"来最小化肽结构。将结构另存为 PDB 文件 （图 6.
- 使用 PyRx/AutoDock 4.2 （http://autodock.scripps.edu/） 将基板肽停靠到 VEEV-nsP2。打开 PyRx 工具，编辑首选项设置，停用所有倾斜准备。加载基板分子，右键单击导航器面板上的分子名称，选择"制作配体"以准备配体对接文件。加载蛋白质2HWK_clean.pdb，然后选择"制造大分子"来准备pdbqt对接文件（图7）。
- 在底部的停靠面板上启动"自动停靠向导"。选择准备好的配体和蛋白质文件。通过手动调整以催化残留物 Cys-477 为中心的网格尺寸来定义蛋白质结合口袋。使用默认间距参数 0.375 + 单击"运行自动网格"以生成网格映射。
- 运行自动停靠并选择拉马克遗传算法（LGA）方法。单击停靠参数并将GA 运行数设置为 50。对其他参数使用默认参数。单击"前进"以启动停靠运行。
- 打开"分析结果"面板。检查所有预测的绑定姿势。选择 Cys-477 和裂解位基体之间具有最低预测结合能量和合理结合相互作用的最佳模型。将绑定模型另存为 PDB 文件，以便进行进一步的 MD 模拟。
7. 坞站 VEEV 基质复合物的 MD 仿真
- 使用琥珀色 （http://ambermd.org/） 准备输入文件。按照标准协议，使用 AMBER 封装和 ff99SB 力场对预测的基板结合模型执行 MD 仿真。
注：在进行 MD 仿真之前，溶剂系统会彻底实现能量最小化。应用周期性边界条件来模拟连续系统。采用粒子网格Ewald（PME）方法计算远距离静电相互作用。模拟系统首先在 100 ps 以上逐渐温度从 0 K 到 300 K，然后在 300 K 下平衡 500 ps，然后总共运行 2 ns 长度的生产运行。- 在高性能计算设施运行模拟作业。我们的模拟在比奥武夫星团（https://hpc.nih.gov/）上运行（图8）。
- 使用 VMD 程序 （http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/） 可视化轨迹输出。分析nsP2活性位点内基板和TRIM14的结合相互作用和构象变化（图9）。
Representative Results
对ZIKV ns2B/3蛋白酶的SSHHPS分析确定了4个宿主蛋白靶点：FOXG1，SFRP1，来自视网膜cDNA库的Gs α亚单位，以及NT5M线粒体5'，3'-核糖样酶（图10）6。值得注意的是，没有其他方法预测这些蛋白质作为ZIKV蛋白酶的潜在目标。FOXG1基因的突变与先天性综合征有关，其特征是发育受损和大脑结构异常（如小头症）。SFRP1是一种分泌的卷曲相关蛋白（SFRP）;这些可溶性受体可以竞争性地结合Wnt配体来对抗和抑制Wnt信号。在弗拉维病毒感染36年期间，Wnt信号通路参与IFN反应的调节。SFRP1的裂解有望增强黄病毒的复制。SFRP1也参与Th17细胞分化37。SSHHPS 的序列对齐显示了裂解位点序列中特定于物种的差异（图10D）。SFRP1中的裂解部位序列在人和鸡中相同;ZIKV可诱发鸡胚胎死亡和小头症38。在啮齿动物中，高度保存的P1残留物（K/R）R+G被甘氨酸（RGG）取代。小鼠的免疫能力菌株一般对ZIKV感染和疾病39具有抗药性。
对于病毒多蛋白序列和主机蛋白序列，可以使用板读取器31、40、41中的连续测定来测量稳态动力学参数和抑制常数（图 11A ）。对于定性裂解信息，如特定序列的裂解或各种化合物抑制蛋白酶，可以使用不连续的测定（图11B）。
可能需要优化 CFP 和 YFP 之间的残留物数量。可以使用在硅中方法创建基板绑定模型。图9显示了nsP1/nsP2结的代表性对接模型。对于VEEV nsP2蛋白酶，已报告12个氨基酸Semliki森林病毒（SFV）序列的裂解（Km = 0.58 mM）33。将基板序列延长到19、22和25残留物，降低缓冲液的离子强度，可显著降低Km。对VEEV nsP2晶体结构和晶体包装的检查还表明，其中一个结的一部分被包装在蛋白酶领域和螺旋。因此，由于对二次结构主题的识别，VEEV 基板的绑定时间越长越好。
对于TRIM14，我们得到了一个Km = 21 μM6，33。携带宿主蛋白序列的基板的Km值与含有病毒多蛋白裂解位点序列（Km（V12） = 12 μM 和 Km（V34） = 21 μM 的基质的 Km值相当。nsP1/nsP2、nsP2/nsP3和nsP3/nsP4结处的裂解位点序列以不同的效率被切割。在细胞中，这被认为是允许多蛋白42的连续裂解。
在解释负面结果时应小心谨慎。如果没有发生裂解，裂解位点可能太短，或者纯化蛋白酶可能处于非活动状态。对于被切割的基质，需要额外的实验来确认受病毒感染细胞中全长蛋白质或裂解的裂解。应选择适当的后续实验。也可以测试目标蛋白过度表达或沉默对病毒复制的影响。
图1：三种沉默机制。在DNA、RNA或蛋白质水平上可以发生沉默。这些"搜索和删除"算法每个使用"关键字"来指示包含该单词的文件的裂解。这一数字已由Morazzani等人32和其中的参考文献修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：裂解位点序列中物种特异性差异。TRIM14 同源的 C 端 PRY/SPRY 域显示在对齐中。PRY/SPRY 域可以通过以灰色突出显示的保存图案来标识。人类TRIM14在QEAGA@G被VEEV nsP2半胱氨酸蛋白酶切割。SSHHP 序列以颜色显示。绿色残留物是 P1 的残渣;蓝色是 P4 残留物，红色是裂解部位图案序列中其他保存的残留物。Equine 拥有缺少 PRY/SPRY 域的 TRIM14 截断版本。青色中突出显示的流氨酸是多泛化的，对MAVS信号体的组装非常重要。C-终端PRY/SPRY域可能被nsP2蛋白酶暂时切断，在急性病毒感染期间在细胞内损害宿主的抗病毒反应。在马中，此域始终不存在。这表明TRIM14的PRY/SPRY域可能具有保护VEEV感染的功能。这个数字已由Morazanni等人转载6请点击这里查看这个数字的较大版本。
图 3：使用 BLAST 进行 SSHHPS 标识。VEEV nsP1/nsP2结处的裂解位点图案序列与宿主蛋白TRIM14中的SSHHP序列对齐。绿色着色的残渣是 P1 的残渣;蓝色是P4残留物，红色是裂解部位图案序列的其他保存残留物。大多数路线包含与保存的裂解部位图案以外的区域同源性，或者不包括 P1/P1' 剪刀粘结残留物。TRIM14 按顺序显示与 6 个残留物的匹配，顺序包括 P1 和 P1'。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：VEEV nsP2半胱氨酸蛋白酶CFP-V12-YFP基质的蛋白质和DNA序列。NdeI （CATATG） 和 XhoI （CTCGAG） 限制站点以大写字母显示。红色是来自nsP1和nsP2之间的病毒多蛋白的裂解位点序列。绿色残留物是 P1 的残留物，蓝色是裂解部位的 P4 残留物。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：Trx-VEEV-nsP2半胱氨酸蛋白酶结构的蛋白质序列。二恶名食毒素（Trx）以黄色显示。血栓裂解部位和His标记以青色显示。Cys-His dyad 被标记为红色。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：教育部的肽结构。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：使用PyRx/AutoDock对基板肽进行对接。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8：在 Biowulf 群集上运行的作业。请点击此处查看此图的较大版本。
图9：在nsP1/nsP2结处包含裂解位点序列的VEEV P12基板的模型。Cys-477/His-546 催化dyad 以蓝色显示。图是使用 Pymol （https://pymol.org） 制作的。请点击此处查看此图的较大版本。
图10：寨卡病毒ns2B/ns3蛋白酶的SSHHPS分析。（A） 预测 ZIKV ns2B/ns3 蛋白酶的宿主蛋白靶点。红色残留物与单个裂解位点序列匹配。在子部位可以容忍绿色残留物，并在其他裂解部位匹配残留物。SFRP1 的连续顺序相同残留物数量最多。（B） CFP-基质-YFP蛋白（+50-60 kDa）被表达和纯化，含有来自每个宿主蛋白（人）的预测SSHHP序列。ZIKV蛋白酶切割人类FOXG1，SFRP1，NT5M和从视网膜cDNA库分离的Gα亚单位。裂解产物约为 28-30 kDa。基质序列在Morazzani等人6（C）中可用，虽然ns2B/ns3蛋白酶切割SFRP1，但它没有切割其同源性（SFRP2和SFRP4）。（D） 不同动物物种的裂解部位的排列，可能有助于为IV组病毒选择动物模型。请注意，在SFRP1中，人类和啮齿动物之间保存的R+G序列不同。图转载自Morazzani等人6请点击这里查看这个数字的较大版本。
图11：使用连续和不连续测定的稳态动力学分析。（A） 表5所示的动力学数据绘制在GraFit中。内联显示了 Lineweaver-Burk 图。（B） 显示CFP-V12-YFP基板裂解产物的SDS-PAGE凝胶。在通道 1 是"UNCUT"基板 （48 kDa）。在车道 2 是"CUT"基板 （31 kDa 和 27 kDa）。在通道3-9个不同的化合物被包括在内，以测试其抑制活性。车道 4 包含 E64d 共价抑制剂。这些反应在室温下运行了±17小时。需要对样品进行沸腾，以实现尖锐的带状模式。nsP2蛋白酶在含有酶的反应中可见（56 kDa），但在通道1中不可见。车道 1 是"无酶"控制。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
在生物学中只看到由外来序列引导的蛋白质或核酸的序列特异性破坏。图 1所示的机制是防御机制，用于保护主机免受病毒或主机的病毒侵害。
使用生物信息学方法，我们可以识别被这些系统破坏的目标。在分析SSHHP序列时，我们发现，其中许多可以在产生先天免疫反应所需的蛋白质中找到。有些具有明显的作用，如MAVS和TRIF（TIR-域包含适配器诱导干扰素-β），而其他与免疫有关，虽然更复杂的机制（例如，Histone H3，SFRP1，FOXG1）8，9。存储在 SSHHP 序列中的目标信息有可能识别对这些病毒具有抗病毒作用的路径。体内的抗病毒反应通常是病毒特异性26，43。例如，TRIM蛋白的子集对不同的病毒有抗病毒作用43，44，45，有些是病毒限制因子（例如，HIV和TRIM5+）。TRIM蛋白的特异性（约70个已经确定）仍在检查44，45。SSHHPS 中的信息可能有助于我们了解这些病毒如何逃避先天免疫反应。随着对更多 SSHHPS 的检查，可能会发现其他模式和相关性。
在我们的分析中，物种特异性的差异是显而易见的（图2，图10）。这些病毒对某些物种的影响比其他物种更大。有关主机范围、主机敏感性和主机防御的信息可能存在于 SSHHPS 中。例如，马，最易感染马脑炎病毒的物种，缺乏被VEEV nsP2蛋白酶暂时切割的人类TRIM14区域。人类很少死于VEEV感染，但可以感染24。人类TRIM14蛋白携带nsP2蛋白酶裂解序列6。裂解部位的存在表明人类有一个防御机制来对付这些病毒。鸟类被认为是这些病毒的潜在储存库46。TRIM14蛋白质中来自鸡的相应SSHHP序列与人类和其他物种的序列不同。像这样的细微差异可能使目标宿主蛋白不干净或更容易被分块。Aguirre等人16日表明，一种不洁变异的STRING蛋白在登革热病毒感染后诱导了较高的IFN水平，小鼠自然携带一种不是被登革热ns2B3蛋白酶切割的STING版本。ZIKV蛋白酶47没有切割鼠汀蛋白。在我们的SSHHPS分析中，当我们将人类蛋白质与啮齿动物6的蛋白质进行比较时，我们还观察到ZIKV蛋白酶裂解位点序列的差异（图10D）。在用于IV组病毒的动物模型中，复制宿主蛋白的物种特异性蛋白解裂解可能很重要。宿主蛋白裂解的抑制对IV组蛋白酶抑制剂的发展也有影响。在以前的出版物中，我们表明，我们可以用CA074甲基酯6抑制VEEV nsP2蛋白酶TRIM14裂解。这一结果表明，这些蛋白酶的小分子抑制剂也许能够调节能够抑制感染的先天免疫反应6，31。
一个物种内的遗传变异也有可能在蛋白溶性裂解中产生差异。康顿使用的细微差异可能会影响核糖体暂停48。由于一些IV组病毒蛋白酶嵌入在ER膜中，如果裂解以共翻译方式发生，这些暂停的差异可能会影响目标的裂解。我们识别的一些裂解位点位于预测信号肽序列中（例如 SFRP1），而其他则为内部。
SSHHPS 分析可以生成不同于其他宿主蛋白分析方法的信息。SSHHPS 分析成本低廉且易于使用。使用细菌表达系统允许测试哺乳动物序列的短段（±25氨基酸），而无需使用哺乳动物细胞培养。我们发现CFP-YFP基质能够耐受所有经过测试的人类蛋白质序列;然而，产量各不相同。在类似的测定中，含有人类蛋白质序列的基质只要63个氨基酸被成功表达、纯化，并用于动力学分析和抑制剂筛选49、50、51。由于不连续测定只需要少量的基板，因此可以探索大量目标。该系统的一个优点是CFP/YFP基板可用于SDS-PAGE分析和更精细的动力学分析（即IC50、Ki、Km、Vmax）。对于药物发现，抑制化合物可以在荧光测定中产生伪影。因此，不连续的测定与连续测定相结合，可以确认裂解或抑制裂解。不连续的SDS-PAGE检测样品可以直接从96孔板中抽取。CFP/YFP基板已用于化合物库筛选52。然而，需要额外的分析来确定基板是否适合高通量筛选，如Z因子53的计算。
设计基材的一个挑战是识别由蛋白酶约束和识别的剪刀键周围的区域。在此处显示的示例中，我们从以剪刀键为中心的 12 个残渣序列开始。在分析裂解部位与剪刀结的残余N端的序列对齐后，发现VEEV蛋白酶的裂解部位与若干C端残留物的ZIKV蛋白酶同源性。对接基板的硅基模型可用于设计探测基板结合位点的场位定向诱变实验。由于基质和酶序列在质粒上，因此可以突变以测试硅基模型或子位容差。如果绑定基板的晶体结构不可用，则这一点可能更有利。
SSHHPS分析还可能产生关于病毒诱导的表型由病毒酶产生机制的新信息。ZIKV目标之一，SFRP1，是Wnt信号通路的一部分，在大脑和眼睛发育以及免疫反应36，37，54，55，56，57的作用。我们发现，ZIKV ns2B/ns3蛋白酶可以切割的其他蛋白质序列也存在于大脑和眼睛发育的蛋白质中;在先天性寨卡综合征中观察到两种异常，被认为是病毒引起的表型58的一部分。
宿主-病原体相互作用的可预测性可用于各种应用：靶点特定的溶性溶性病毒疗法;消除活病毒疫苗的风险;动物模型的细化、预测或选择;宿主范围或易感性的预测;人畜共患病事件的预测;和主机防御的预测。由于所述方法基于序列，因此将来可以合并到软件中。
Disclosures
这里表达的观点是作者的观点，并不代表美国海军、美国陆军、美国国防部或美国政府的观点。
Acknowledgments
这项工作得到了国防威胁减少局（DTRA）项目号CB-SEED09-SEED09-2-0061和CBCall4-CBM-05-2-0019的支持，并部分得到了国家航空工业局、NIH（XH）和海军研究实验室基地基金的校内/校外研究计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
| 2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
| 4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
| AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
| AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
| Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
| Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
| Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
| Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
| Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| DNAse | Sigma | DN25-1G | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
| Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
| IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
| Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
| Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
| Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
| Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher | ||
| New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
| Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
| pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
| Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
| Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
| Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
| RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
| RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
| RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
| Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
| Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
| SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |
References
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