Summary
We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.
Abstract
Alphavirale enzymen worden gesynthetiseerd in één polypeptide. De niet structureel poly protein (NSP) wordt verwerkt door zijn nsP2 cysteïne protease om actieve enzymen te produceren die essentieel zijn voor virale replicatie. Virale proteasen zijn zeer specifiek en herkennen gekonveerde decolleté site motief sequenties (~ 6-8 aminozuren). In verschillende groep IV virussen, de nsP protease (s) decolleté site Motif sequenties kunnen worden gevonden in specifieke gastheer eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van de aangeboren immuunresponsen en, in sommige gevallen, de beoogde eiwitten lijken te worden gekoppeld aan het virus-geïnduceerde fenotype. Deze virussen maken gebruik van korte stukken van homologeuze gastheer-pathogen-eiwit sequenties (SSHHP'S) voor gerichte vernietiging van gastheer eiwitten. Om sshhp's te identificeren kan de virale protease decolleté site Motif sequenties worden ingevoerd in blast en de gastheer genoom (s) kan worden doorzocht. Decolleté kan in eerste instantie worden getest met behulp van de gezuiverde nsP virale protease en fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) substraten gemaakt in E. coli. De FRET substraten bevatten cyaan en gele fluorescerende eiwitten en de decolleté site sequentie (CFP-sequentie-YFP). Deze protease test kan continu worden gebruikt in een plaat lezer of discontinu in SDS-PAGE gels. Modellen van de gebonden peptide substraten kunnen in silico worden gegenereerd om substraat selectie en mutagenese studies te begeleiden. CFP/YFP substraten zijn ook gebruikt om te identificeren van proteaseremmers. Deze in vitro en in silico-methoden kunnen worden gebruikt in combinatie met assays op basis van cellen om te bepalen of de beoogde host-proteïne van invloed is op virale replicatie.
Introduction
Bewijs van horizontale genoverdracht van virus naar host, of host to virus, kan worden gevonden in een verscheidenheid van genomen1,2,3,4. Voorbeelden van virale endogenisatie zijn de crispr spacer sequenties gevonden in bacteriële gastheer genomen4. Onlangs hebben we bewijs gevonden van gastheer eiwit sequenties ingebed in de niet-structurele poly proteïnen van (+) ssRNA groep IV virussen. Deze sequenties binnen de codeer gebieden van het virale genoom kunnen generationeel worden vermeerderd. De korte stukken van homologeuze gastheer-pathogen eiwit sequenties (sshhp's) zijn te vinden in het virus en gastheer5,6. Sshhp's zijn de gekligeerde decolleté-site-Motif sequenties die worden herkend door virale proteasen die homologie hebben aan specifieke gastheer eiwitten. Deze sequenties direct de vernietiging van specifieke gastheer eiwitten.
In onze vorige publicatie6hebben we een lijst samengesteld van alle gastheer eiwitten die werden doelwit van virale proteasen en ontdekten dat de lijst met doelen niet-willekeurig was (tabel 1). Er waren twee trends zichtbaar. Ten eerste behoorde het merendeel van de virale proteasen die gastheer eiwitten knippen tot groep IV virussen (24 van de 25 gevallen betrokken groep IV virale proteasen), en een protease behoorde tot de (+) ssRNA groep VI retrovirussen (HIV, humaan immunodeficiëntie virus)7. Ten tweede waren de eiwit doelen van de gastheer die door de virale proteasen werden gesneden in het algemeen betrokken bij het genereren van de aangeboren immuunresponsen die suggereerden dat de decolleté bedoeld waren om de immuunresponsen van de gastheer te antagoniseren. De helft van de gastheer eiwitten doelwit van de virale proteasen waren bekende componenten van signalering van Cascades die interferon (IFN) en proinflammatoire cytokines genereren (tabel 1). Anderen waren betrokken bij de transcriptie van host cellen8,9,10 of vertaling11. Belangwekkend, Shmakov et al.4 hebben aangetoond dat veel crispr protospacer sequenties corresponderen met genen die betrokken zijn bij plasmide conjugatie of replicatie4.
Groep IV omvat onder andere de Flaviviridae, de Picornaviridae, de Coronaviridae, de Calciviridae en de togaviridae. Verschillende nieuwe en opkomende pathogenen behoren tot groep IV zoals het Zikavirus (ZIKV), West Nile (WNV), chikungunya (CHIKV), ernstig acuut respiratoir syndroom virus (SARS) en Middle East respiratoir syndroom (MERS). Het (+) ssRNA genoom is in wezen een stukje mRNA. Om de enzymen te produceren die nodig zijn voor genoom replicatie moet het (+) ssRNA genoom eerst worden vertaald. In alphavirussen en andere groep IV virussen, de enzymen die nodig zijn voor de replicatie worden geproduceerd in een enkel poly eiwit (dat wil zeggen, nsP1234 voor VEEV). De niet-structurele poly proteïne (nsP) is proteolytisch verwerkt (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) door de nsP2 protease voor de productie van actieve enzymen12 (Figuur 1). Decolleté van de poly proteïne door de nsP2 protease is essentieel voor virale replicatie; Dit is aangetoond door verwijdering en op de site gerichte mutagenese van de actieve site cysteïne van de nsP2 protease13,14. Met name de vertaling van virale eiwitten voorafgaat aan genoom replicatiegebeurtenissen. NsP4 bevat bijvoorbeeld de RNA-afhankelijke RNA-polymerase die nodig is om het (+) ssRNA-genoom te repliceren. Genoom replicatie kan dsRNA-Intermediates produceren; deze tussen producten kunnen de aangeboren immuunresponsen van de gastheer activeren. Dus, deze virussen kunnen klieven gastheer aangeboren immuunrespons eiwitten vroeg in de infectie om hun effecten te onderdrukken15,16,17.
Silencing kan optreden op het niveau van DNA, RNA en eiwitten. Wat voor elk van de in Figuur 1 getoonde geluids dempings mechanismen gebruikelijk is, is dat korte vreemde DNA-, RNA-of eiwit sequenties worden gebruikt om de vernietiging van specifieke doelen te begeleiden om hun functie te antagoniseren. De geluidsdempende mechanismen zijn analoog aan Programma's voor zoeken en verwijderen die in drie verschillende talen zijn geschreven. De korte decolleté site sequentie is analoog aan een "keyword". Elk programma heeft een enzym dat de overeenkomst herkent tussen de korte reeks (het "trefwoord") en een woord in het "bestand" dat moet worden verwijderd. Zodra een overeenkomst wordt gevonden, het enzym snijdt ("verwijdert") de grotere doel volgorde. De drie in Figuur 1 getoonde mechanismen worden gebruikt om de gastheer te verdedigen tegen virussen, of om een virus te verdedigen tegen het immuunsysteem van een gastheer.
Virale proteasen herkennen korte decolleté site Motif sequenties tussen ~ 2-11 aminozuren; in nucleotiden komt dit overeen met 6-33 basissen. Ter vergelijking, crispr spacer sequenties zijn ~ 26-72 nucleotiden en RNAi zijn ~ 20-22 nucleotiden18,19. Hoewel deze sequenties relatief kort zijn, kunnen ze specifiek worden herkend. Gezien de hogere diversiteit van aminozuren, is de waarschijnlijkheid van een willekeurig decolleté-evenement relatief laag voor een virale protease die eiwit sequenties van 6-8 aminozuren of langer herkent. De voorspelling van SSHHP'S in gastheer eiwitten zal grotendeels afhangen van de specificiteit van de virale protease die wordt onderzocht. Als de protease strikte sequentie specificiteits vereisten heeft, is de kans op het vinden van een decolleté site sequentie 1/206 = 1 in 64.000.000 of 1/208 = 1 in 25.600.000.000; de meeste proteasen hebben echter variabele subsite toleranties (bijvoorbeeld R of K kan worden getolereerd op de S1-site). Daarom is er geen vereiste voor de sequentie-identiteit tussen de reeksen gevonden in de host versus het virus. Voor virale proteasen met lossere sequentie vereisten (zoals die van Picornaviridae) kan de kans op het vinden van een decolleté plaats in een gastheer eiwit hoger zijn. Veel van de vermeldingen in tabel 1 zijn afkomstig uit de familie Picornaviridae .
Schechter & Berger notatie20 wordt vaak gebruikt om de residuen in een protease substraat en de subsites waaraan ze binden te beschrijven, we gebruiken deze notatie overal. De residuen in het substraat die N-terminal van de scissile binding zijn worden aangeduid als P3-P2-P1 terwijl die C-terminal worden aangeduid als P1'-P2'-P3 '. De corresponderende subsites in de protease die deze aminozuurresiduen binden zijn S3-S2-S1 en S1'-S2'-S3 ', respectievelijk.
Om te bepalen welke host-eiwitten worden getarget, kunnen we SSHHP'S identificeren in de decolleté van virale polyprotein-sites en zoeken naar de gastheer eiwitten die ze bevatten. Hierin schetsen we procedures voor het identificeren van sshhp's met behulp van bekende virale protease decolleté site sequenties. De bioinformatische methoden, protease-assays en in de beschreven silico-methoden zijn bedoeld om te worden gebruikt in combinatie met assays op basis van cellen.
Sequentie-overeenstemmingen van de gastheer eiwitten die worden getarget door virale proteasen hebben soortspecifieke verschillen onthuld binnen deze korte decolleté site sequenties. Bijvoorbeeld, het Venezolaanse Equine encefalitis virus (veev) nsP2 protease bleek te snijden menselijke TRIM14, een tripartiete motief (Trim) eiwit6. Sommige TRIM proteïnen zijn virale restrictie factoren (bijv. TRIM5α21), de meeste worden verondersteld ubiquitine E3 ligases te zijn. TRIM14 mist een RING (echt interessant nieuw gen) domein en wordt niet beschouwd als een E3 ligase22. TRIM14 is voorgesteld een adapter te zijn in de mitochondriale antivirale signalosome (MAVS)22, maar kan andere antivirale functies hebben23. Uitlijning van TRIM14 sequenties van verschillende soorten toont aan dat paarden niet de decolleté site en haven een afgeknotte versie van TRIM14 die het C-Terminal PRY/SPRY-domein mist. Dit domein bevat een polyubiquitination site (afbeelding 2). In paardachtigen zijn deze virussen zeer dodelijk (~ 20-80% sterfte) terwijl bij mensen slechts ~ 1% sterven aan VEEV-infecties24. Decolleté van het PRY/SPRY-domein kan de MAVS-signalerings Cascade transitief kortsluiting. Deze Cascade kan worden geactiveerd door dsRNA en leidt tot de productie van interferon en pro-inflammatoire cytokines. De aanwezigheid van de SSHHP'S kan dus nuttig zijn om te voorspellen welke soorten verdedigingssystemen hebben tegen specifieke groep IV-virussen.
In groep IV virussen, IFN antagonisme mechanismen worden verondersteld te vermenigvuldigen redundant25. Host Protein decolleté kan van voorbijgaande aard zijn tijdens infectie en concentraties kunnen na verloop van tijd herstellen. We vonden in cellen dat TRIM14 decolleté producten zeer vroeg kunnen worden gedetecteerd na trans fectie (6 h) met een plasmide coderen van de protease (cytomegalovirus promotor). Bij langere periodes werden de splijting producten echter niet gedetecteerd. In virus geïnfecteerde cellen waren de kinetiek verschillend en konden decolleté producten worden gedetecteerd tussen 6-48 h6. Anderen hebben het uiterlijk van gastheer eiwit splijting producten gemeld al in 3-6 h post infectie9,11.
Proteolytische activiteit in cellen is vaak moeilijk te vangen; de splijting producten kunnen variëren in hun oplosbaarheid, concentratie, stabiliteit en levensduur. In op cellen gebaseerde testen kan niet worden aangenomen dat splijting producten zich in een cel zullen ophopen of dat de band intensiteiten van cut en Onbesneden proteïne compenserende verhogingen en dalingen zullen vertonen, aangezien het snij eiwit zeer snel kan worden afgebroken en mogelijk niet detecteerbaar is in een Western-Blot met een verwacht molecuulgewicht (MW) (bijv. de regio met de epitoop kan worden gespleten door andere gastheer proteasen of kunnen worden alomtegenwoordig). Als het substraat van de virale protease een aangeboren immuunrespons-eiwit is, kan de concentratie ervan variëren tijdens infectie. Bijvoorbeeld, sommige aangeboren immuunrespons eiwitten zijn aanwezig vóór virale infectie en worden verder geïnduceerd door interferon26. De concentratie van het doeleiwit kan daarom fluctueren tijdens infectie en vergelijking van niet-geïnfecteerde vs. geïnfecteerde cellysaten kan moeilijk te interpreteren zijn. Bovendien zijn alle cellen mogelijk niet gelijkmatig getransfuneerd of geïnfecteerd. In vitro protease assays met behulp van gezuiverde eiwitten van E. coli aan de andere kant hebben minder variabelen waarvoor te controleren en dergelijke testen kunnen worden gedaan met behulp van SDS-page in plaats van immunoblots. Contaminerende proteasen kunnen worden geremd in de vroege stappen van de eiwit zuivering van het GVB/YFP substraat, en gemuleerde virale proteasen kunnen worden gezuiverd en getest als controles om te bepalen of het decolleté te wijten is aan het virale protease of een contaminerende bacteriële protease.
Een beperking van in vitro protease-assays is dat ze de complexiteit van een zoogdier cel missen. Voor een enzym om zijn substraat te snijden, moeten de twee worden co-gelokaliseerd. Groep IV virale proteasen verschillen in structuur en lokalisatie. Bijvoorbeeld, de ZIKV protease is ingebed in het endoplasmisch reticulum (ER) membraan en kijkt naar de cytosol, terwijl de VEEV nsP2 protease is een oplosbare proteïne in het cytoplasma en Nucleus27. Sommige van de decolleté site sequenties gevonden in de ZIKV SSHHPS analyse waren in signaal peptiden suggereren dat decolleté co-translationally voor sommige doelen optreden kan. In deze analyses moet dus ook rekening worden gehouden met de locatie van het protease en het substraat in de cel.
Assays op basis van cellen kunnen waardevol zijn voor het vaststellen van een rol voor de geïdentificeerde gastheer-eiwit (en) in infectie. Methoden die erop gericht zijn virale protease splitsing van gastheer proteïnen te stoppen, zoals de toevoeging van een proteaseremmer6 of een mutatie in het hostdoel16 , kunnen worden gebruikt om de effecten ervan op virale replicatie te onderzoeken. Overexpressie van het beoogde eiwit kan ook invloed hebben op virale replicatie28. Plaque-assays of andere methoden kunnen worden gebruikt om virale replicatie te kwantificeren.
Protocol
1. Bioinformatica: identificatie van SSHHP'S in het ontvangende genoom met BLAST
Opmerking: Protein BLAST kan gevonden worden op blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
- Input ~ 20 aminozuren rond de scissile binding in de virale poly eiwit. Selecteer niet-redundante eiwit sequenties en typ in de gastheer genoom te doorzoeken (bijvoorbeeld homo sapiens).
- Selecteer indien nodig PHI-BLAST. Typ een patroon sequentie (bijvoorbeeld voor de 25 residuen van V12 hieronder vermeld het patroon "AG" zonder aanhalingstekens).
Opmerking: In PHI-BLAST geven vierkante haken [XY] aan dat aminozuur X of Y zich op de subsite positie kan bevinden (bijv. AG [AC] [homo]). - Inspecteer de BLAST-resultaten en Identificeer de hits met een hoge sequentie identiteit voor residuen die bewaard worden in de polyproteïne-decolleté (bijv. tripartiete Motif proteïne 14) (Figuur 3).
Opmerking: Voor serumproteasen wordt een hoger behoud van het P1-residu verwacht, terwijl voor cysteïne-proteasen een hoger behoud van het P2-residu wordt verwacht. - Kleur de residuen die identiek zijn aan een decolleté site sequentie en zijn in sequentiële volgorde (geen hiaten). Kleur de residuen getolereerd op de subsite, maar aanwezig in een andere splijting site in een tweede kleur.
Opmerking: Residuen die conservatieve substituties vertegenwoordigen (bv. Leu vs. val) die niet aanwezig zijn in een virale splijting site, kunnen ook worden gevonden en kunnen of kunnen niet worden herkend door het virale protease. - Rangorde de BLAST-hits op basis van het aantal opeenvolgende identieke of getolereerde residuen dat overeenkomt met een decolleté site volgorde. Selecteer in de lijst de eiwitten die ≥ 6 identieke of soortgelijke residuen bevatten voor analyse in protease-assays.
- Herhaal de procedure voor de andere decolleté plaatsen (nsP2/3, nsP3/4, enz.) en versterk de voorspelling geleidelijk door meer hoog geconcongeerde residuen toe te voegen aan het PHI-BLAST patroon.
- Selecteer indien nodig PHI-BLAST. Typ een patroon sequentie (bijvoorbeeld voor de 25 residuen van V12 hieronder vermeld het patroon "AG" zonder aanhalingstekens).
2. in vitro assays: ontwerpen en voorbereiden van protease substraten
- Bouw een plasmide codering van het cyaan fluorescerende eiwit (GVB), ≤ 25 aminozuren van de decolleté site sequentie, gevolgd door het gele fluorescerende eiwit (YFP, ook bekend als Venus29).
Opmerking: Het plasmide kan worden geconstrueerd met behulp van sequentie en ligatie onafhankelijk klonen (SLIC)30 of commerciële gensynthese. Een pet15b plasmide met de in Figuur 4 getoonde sequentie werd commercieel gesynthetiseerd en hier gebruikt.- Voor het optimaliseren van de substraat lengte, construeren extra variabele lengte FRET substraten met 12-25 aminozuren van de natuurlijke virale polyprotein decolleté site sequenties met behulp van een 2-fragment SLIC reactie. Analyseer decolleté met behulp van de SDS-PAGE gel-gebaseerde assay of door het meten van stationaire kinetische parameters met behulp van de onderstaande methoden.
Opmerking: In sommige gevallen kunnen decolleté sites worden geïdentificeerd door homologie aan bekende splijting sites31. Als het splijten van de substraten met de polyproteïne-junctie sequenties niet wordt waargenomen, is er mogelijk behoefte aan extra residuen of een structureel motief (bijv. een Alfa helix32). Als alternatief kan de gezuiverde virale protease inactief zijn. Bevestig de splitsing van de virale polyproteïne sequenties voor het nastreven van SSHHPS-analyse. Het aantal residuen in het substraat werd geoptimaliseerd voor de VEEV-protease met behulp van variabele lengte substraten (12 tot 25 aminozuren) gevolgd door analyse van VMax en Km32,33. De Zika virale ns2B/NSB protease decolleté sites gebruikt in de voorbeelden zijn gepubliceerd34,35.
- Voor het optimaliseren van de substraat lengte, construeren extra variabele lengte FRET substraten met 12-25 aminozuren van de natuurlijke virale polyprotein decolleté site sequenties met behulp van een 2-fragment SLIC reactie. Analyseer decolleté met behulp van de SDS-PAGE gel-gebaseerde assay of door het meten van stationaire kinetische parameters met behulp van de onderstaande methoden.
- Bereid het GVB/de YFP-substraten door vers te transformeren 8-20 μL BL-21 (DE3)E. colibevoegde cellen met het GVB-V12-YFP plasmide volgens de aanwijzingen van de fabrikant en plaat op Luria Bertani (LB) agar-platen met 50 μg/mL Ampicillaire (37 °C).
- Autoclaaf vier 4 L kolven met LB media (1,5 L media per kolf) en 100 mL LB in een maatkolf van 250 mL. Dop elke kolf met aluminiumfolie.
- Inoculeren van de 100 mL cultuur met een kolonie van de vers getransformeerde bacteriën en groeien bij 37 ° c met schudden (200 rpm) 's nachts.
- Als u het GVB/YFP-substraat wilt maken, moet u vier kolven van 4 L met 25 mL van een nachtelijke kweek inoculeren. Begin met het schudden van de culturen bij 37 °C en bewaak de groei met UV-VIS-spectroscopie bij 600 Nm per uur.
- Wanneer de bacteriën een extinctie bereiken van ~ 1,0 bij 600 nm (ongeveer ~ 3-4 h van groei) induceren eiwit expressie door toevoeging van 0,5 mL 1 M Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) per kolf. Na het toevoegen van IPTG, verlaagt u de temperatuur van de schud incubator tot 17 °C en laat u de expressie 's nachts doorgaan voor 17-20 uur.
- Pellet de bacteriën met een High-Speed centrifuge bij 7.000 x g gedurende 10 min (4 °c) en bewaar de pellets. Verwijder en gooi vloeibare media weg. Bewaar de pellets onmiddellijk bij-80 °C of lyse.
- Bereid 100 mL lysisbuffer met 50 mM tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 mL bacteriële EiwitExtractie reagens, 30 mg lysozyme, 25 U van DNase en 1 proteaseremmer Tablet. Rebreng de pellets in lysisbuffer met een pipet en breng ~ 25-35 mL in 50 mL wegwerp conische buizen.
- Plaats de buisjes in een plastic bekerglas met ijswater. Plaats de sonicator-tip in de buizen zodat de punt ~ 1 cm van de onderkant van de buis is en soniceert de eiwitlysaten 10-20 keer op niveau 5 voor 15 s-intervallen totdat het lysaat vloeibaar en vloeibaar wordt.
Opmerking: Gebruik gehoorbescherming tijdens sonicatie. - Breng het lysaat over naar hogesnelheidcentrifugeer buizen en centrifugeer bij 20.500 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Na de spin, bewaar het supernatant (~ 100 mL) en breng het over naar een schone fles. Gooi de pellets weg.
- Bereid 1 L buffer A (50 mM tris pH 7,6, 500 mM NaCl). Bereid 300 mL buffer B (50 mM tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol).
- Evenwichts een 100 mL nikkel kolom met 3 kolom volumes van buffer A en een debiet van 5 mL/min.
- Laad het lysaat op de nikkel kolom met een debiet van 2 tot 5 mL/min. was de kolom met 2 kolom volumes van buffer A, gevolgd door ~ 5 kolom volumes van 20% buffer B. Tijdens de 20% buffer B Wash zal de extinctie bij 280 nm (A280) toenemen naarmate de verontreinigingen tijdens het wassen uit de kolom komen. Ga door met het wassen van de kolom totdat de A280 van het eluaat is teruggekeerd naar de uitgangswaarden.
- Elute het eiwit met 2-3 kolom volumes van 100% buffer B met een debiet van 2-5 mL/min en verzamel 10 mL fracties. Meet de A280 van elke breuk.
- Combineer en concentreer fracties met een280 > 0,1 met behulp van een 15 ml centrifugale ultrafiltratie unit. Draai de ultrafiltratie-eenheden op 5.000 x g gedurende 15 minuten en blijf fracties toevoegen totdat het volume is teruggebracht tot ~ 50-75 ml.
- Snijd een 14 inch stukje dialyse slang met een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 6-8 kDa. Hydrateer de dialyse slang door deze volledig ondergedompeld in 300 mL water gedurende 10 min. bind een veilige knoop aan het ene uiteinde van het membraan. Vul de zak met dialyse buffer om ervoor te zorgen dat er geen scheuren of lekken aanwezig zijn. Verwijder de buffer uit de zak en houd de zak ondergedompeld in de dialyse buffer.
- Breng het geconcentreerde eiwit van 2.2.13 over in de dialyse zak met een plastic pipet. Verwijder eventuele luchtbelletjes uit de zak. Sluit de zak met een tweede knoop of een dialyse clip. Dialyze het eiwit tegen 500 mL 50 mM tris pH 7,6, 5 mM EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur), 250 mM NaCl in een 500 mL gegradueerde cilinder, 's nachts bij 4 °C.
- Dialyseer het eiwit een tweede keer tegen 500 mL 50 mM tris pH 7,6 bij 4 °C gedurende 2 uur.
- Bereid voor de anion-wisselkolom 500 mL buffer A (50 mM tris pH 7,6) en 500 mL buffer B (50 mM tris pH 7,6, 1,0 M NaCl). Een anion-wissel kolom van 30 mL met 3 kolom volumes buffer A (2-5 mL/min).
- Haal het eiwit uit de dialyse zak en breng het over naar een fles. Houd de fles op ijs. Laad het gedialyseerde eiwit op de kolom (2-5 mL/min).
Opmerking: Het GVB/YFP-eiwit zal de kolom binden en zal geel zijn in uiterlijk. - Was de kolom met buffer A tot de A280 terugkeert naar Baseline (5 ml/min). Elute het eiwit met een gradiënt (0-50% buffer B, 100 mL) en verzamel 10 mL fracties.
- Inspecteer de kolom fracties met SDS-PAGE. Combineer die die > 95% zuiver zijn.
- Concentreer het eiwit op een A280 ~ 10-20 met behulp van een 15 ml centrifugale ultrafiltratie unit. Draai de concentrator gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 4.500 x g en blijf eiwitten toevoegen totdat alle eiwit bevattende fracties zijn gecombineerd.
- Haal het eiwit uit de dialyse zak en breng het over naar een fles. Houd de fles op ijs. Laad het gedialyseerde eiwit op de kolom (2-5 mL/min).
- Verwijder voorzichtig het eiwit uit de concentrator met een pipet. Aliquot het eiwit in 1,5 mL micro centrifugebuizen en Flash bevriezen in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag bij-80 °C. Buffer wissel het eiwit bij kamertemperatuur uit met behulp van een PD-10-kolom met de juiste test buffer vóór gebruik.
- Gebruik de wet van bier om de eiwitconcentratie te berekenen met behulp van de A280 en een berekende extinctiecoëfficiënt (bv. voor het V12 substraat de vogele = 47.790 M-1 cm-1).
Opmerking: De extinctiecoëfficiënt (vogele) kan worden berekend op basis van de eiwitsequentie in Figuur 4 met behulp van het Expasy ProtParam-programma (https://Web.expasy.org/protparam/).
3. bereiding van de Alphaviral nsP2 cysteïne protease
- Ontwerpen en construeren van een plasmide coderen van de protease. Gebruik voor cysteïne proteasen de pet32 plasmide om een thioredoxine (TRX) fusie-eiwit te construeren.
Opmerking:De pet32 plasmide codeert een trombine decolleté site (lvprgs) voor het verwijderen van de thioredoxine en zijn-tag (Figuur 5). Thioredoxine zal helpen bij het handhaven van de actieve site cysteïne in een gereduceerde toestand tijdens expressie. Voor serumproteasen is de thioredoxine niet nodig en kunnen stappen met betrekking tot de verwijdering ervan door trombine achterwege worden gelaten. De VEEV nsP2 protease sequentie werd opgenomen in een pet32b plasmide die commercieel werd bereid om het hanteren van bepaalde agenten te voorkomen.- Vers transformeren het plasmide DNA in BL21 (DE3) pLysS E. coli volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Plaat de bacteriën op LB agar platen die Ampicileen bevatten.
Opmerking: Chlooramfenicol wordt alleen gebruikt voor E. coli stammen die de plyss plasmide dragen en wordt weggelaten als BL21 (DE3) cellen worden gebruikt. Het is niet nodig chlooramfenicol op de LB agar plaat in deze stap op te nemen. - Autoclaaf vier 4 L kolven van 1,5 L LB media (6 L totaal volume) en 100 mL LB in een maatkolf van 250 mL. Dop elke kolf met aluminiumfolie.
- Inoculeren een 100 mL nachtelijke cultuur van LB/Ampicillaire met een kolonie van de plaat en groeien in een schudden incubator (200 rpm) bij 37 °C.
- Inoculeren de 4 L kolven met 25 mL van de nachtelijke kweek en voeg de juiste antibiotica toe.
Opmerking: De media voor de BL21 (DE3) pLysS cellen die het pet32 plasmide dragen, moeten een eindconcentratie hebben van 25 μg/mL chlooramfenicol en 50 μg/mL Ampicilyl. - Induceren van eiwit expressie door toevoeging van 0,5 mL IPTG aan de kweek wanneer de extinctie bij 600 nm 1,0 bereikt. Verlaag de temperatuur van de schud incubator tot 17 °C. Sta uitdrukking toe om 's nachts door te gaan (~ 17 uur).
- Pellet de cellen door centrifugeren (7.000 x g gedurende 10 min bij 4 °c). Verwijder de vloeibare media en gooi deze weg.
Opmerking: De pellets kunnen gedurende maanden worden bewaard bij-80 °C of onmiddellijk worden gelockeerd. - Bereid 100 mL lysisbuffer (50 mM tris pH 7,6, 500 mL NaCl, 2 mM Beta mercapto ethanol (BME), 30 mg lysozym, 5% glycerol, 25 U DNase, 35 mL bacteriële EiwitExtractie reagens). Open flessen van BME in een chemische kap bij het toevoegen. Bewaar het bacteriële lysaat op ijs of bij 4 °C voor deze en alle volgende stappen.
Opmerking: Voor cysteïne proteasen, 2 mM BME is opgenomen om te houden van de nucleofiele cysteïne verlaagd. De kolommen kunnen op kamertemperatuur worden uitgevoerd met behulp van gekoelde buffers. Buffers moeten worden gemaakt met koud gedeïoniseerd water gekoeld tot 4 °C. - Respendeer de bacteriële pellets in ~ 25 mL lysisbuffer en breng ~ 25 mL lysaat over in 4 x 50 mL wegwerp conische buisjes. Plaats de buisjes in plastic bekers die ijswater bevatten. Sonicate het lysaat 10 keer op niveau 5 voor 15 s-intervallen.
- Breng het lysaat over in hogesnelheids centrifugebuizen. Het lysaat verduidelijken door centrifugeren (30 min, 20.500 x g bij 4 °c).
- Bereid 0,5 L buffer A (50 mM tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM BME) en chill tot 4 °C.
- Bereid 250 mL buffer B (50 mM tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM BME, 300 mM imidazol) en chill tot 4 °C.
- Evenwichts een 50 mL nikkel kolom met 3 kolom volumes buffer A. plaats het geklaarde lysaat op de kolom bij 2-5 mL/min en gooi de pellets weg.
- Was de kolom (2-5 mL/min) met 2 kolom volumes buffer A gevolgd door 5 kolom volumes buffer A met 20% buffer B (60 mM imidazol). Elute het eiwit (5 mL/min) met 100% buffer B en verzamel 10 mL fracties.
- Combineer en concentreer fracties met de protease die een280 ≥ 0,1 hebben met een 15 ml centrifugale ultrafiltratie Unit en 15 min spins bij 5.000 x g bij 4 °c. Nadat het volume is teruggebracht tot ~ 5 ml, wisselt de buffer het eiwit in de concentratie-eenheid uit door een nieuwe dialyse buffer toe te voegen aan het eiwit (50 mm tris pH 7,6, 250 mm NaCl, 5 mm dithiotreïtol (DTT), 1 mm EDTA, 5% glycerol). Spin opnieuw op 5.000 x g bij 4 °c gedurende 15 minuten; Herhaal de buffer wissel stap 2-3 keer. Voeg trombine toe aan het eiwit (20 μL van 1 eenheid/μL) voorafgaand aan dialyse om de thioredoxine en zijn tag te verwijderen.
- Breng het eiwit over in een dialyse zakje en dialyze tegen 500 mL van de dialyse buffer (4 °C) 's nachts in een gegradueerde cilinder van 500 mL.
Opmerking: Het FPLC-systeem (Fast proteïne Liquid Chromatography) en de nikkel kolom moeten grondig worden gereinigd met strip buffer (2 M NaCl, 50 mM EDTA) voordat u doorgaat naar de anion-wisselingskolom. Elk resterend nikkel in de FPLC-lijnen zal de bufferoplossingen met DTT Brown veranderen wanneer ze gemengd zijn. Was de nikkel kolom en het FPLC-systeem met 4 kolom volumes water. Pomp het FPLC-systeem grondig met water wassen. De nikkel kolom kan worden geregenereerd door vloeiende 2 kolom volumes van 0,2 M nikkel sulfaat over de hars voor daaropvolgende zuiveringen.
- Vers transformeren het plasmide DNA in BL21 (DE3) pLysS E. coli volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Plaat de bacteriën op LB agar platen die Ampicileen bevatten.
- Voor de anion-wisselingskolom wordt 1 L buffer A (50 mM tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glycerol) bereid.
- Bereid 0,5 L buffer B (50 mM tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glycerol, 1,25 M NaCl).
- Een kolom met een anion-wissel van 30 mL met buffer A (3 kolom volumes, 2-5 mL/min). Plaats de buisjes in de breuk collector voor het verzamelen van de doorstroming.
Opmerking: De VEEV protease heeft een berekend isoelektrisch punt (pI) van 8,7 en bindt kationen-uitwisselings kolommen, maar stroomt door anion Exchange-kolommen. De pI kan worden berekend op basis van de eiwitsequentie met behulp van het Expasy ProtParam-programma (https://Web.expasy.org/protparam/). - Verdun het dialyzed proteïne 1:3 met buffer A en laad vervolgens het eiwit (5 mL/min). Verzamel de doorstroom in fracties van 10 mL.
- Verwijder de anion-wissel kolom uit het FPLC-systeem. Sluit een kationen wisselingskolom aan op het FPLC-systeem. Een 30 mL kationen wisselingskolom met 3 kolom volumes buffer A (5 mL/min).
- Laad de stroom door de anion-wisselingskolom op de kationen wisselingskolom op 2-5 mL/min. was de kolom met buffer A tot de A280 terugkeert naar Baseline niveau. Elute het eiwit met een 100 mL gradiënt (0-50% buffer B) en verzamel 10 mL fracties.
Opmerking: De veev protease zal rond 0,6 M NaCl Elueer. - Inspecteer de kolom fracties met SDS-PAGE. Combineer fracties die > 95% zuiver zijn en concentreer u op een A280 ≈ 2 met 15 ml centrifugale ultrafiltratie units. Het enzym kan worden ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 °C.
- Laad de stroom door de anion-wisselingskolom op de kationen wisselingskolom op 2-5 mL/min. was de kolom met buffer A tot de A280 terugkeert naar Baseline niveau. Elute het eiwit met een 100 mL gradiënt (0-50% buffer B) en verzamel 10 mL fracties.
4. het enzym continu met behulp van een plaat lezer aszeggen
- Bereid 50 mL test buffer (50 mM HEPES pH 7,0).
- Als de alphavirale proteasen relatief lage kCat waarden hebben, Verdun het enzym in de test buffer tot 4,7 μM (dit komt ruwweg overeen met een A280 = 0,2 voor de veev protease zonder TRX).
- Om de activiteit van het enzym te meten, bereidt u een substraat voor in de test buffer met een concentratie van 185 μM; Dit komt ruwweg overeen met een A280 = 9. Bereid in 8 microcentrifugebuisjes de in tabel 2 getoonde reactie mixen samen door de juiste volumes van de 185 μM substraat voorraad en buffer te combineren. In een zwarte helft-gebied 96-goed plaat pipet 45 μL van de reactie mixen in 3 putten (kolommen 1, 2, 3). Rij A moet de [S] = 5 μM-reactiemix bevatten, en rij H moet de reactiemix [S] = 140 μM bevatten.
- Stel de plaat lezer in om tegelijkertijd fluorescentie op twee golflengten te detecteren met een vaste instelling voor fotomultiplicator buis (PMT) (bijv. laag):
Golflengte 1 excitatie = 434 nm, emissie = 527 nm
Golflengte 2 excitatie = 434 nm, emissie = 470 nm - Stel de leestijd in op 20 min (meting van 1 Lees per minuut) en selecteer de putten die u wilt lezen. Plaats de plaat in de plaat lezer en meet de spontane snelheid van hydrolyse gedurende 20 min. Bewaak de emissie verhoudingen (emissie bij 527/emissie op 470) na verloop van tijd.
- Voer een eindpunt lezen van de plaat met de "ONBESNEDEN" substraat.
Opmerking: Deze waarden zullen worden gebruikt in volgende gegevens berekeningen. Het gemiddelde van de emissie verhoudingen uit 3 putten zal de waarden van de "ONBESNEDEN" substraat op t = 0 in tabel 3. - Verwijder de plaat en pipet 5 μL van het enzym in elke put. Lees de plaat nogmaals gedurende 20 minuten met 1 keer per minuut. Stel de plaat lezer in op de uitvoer van absolute waarden.
Opmerking: Voor deze test zullen de hellingen negatief zijn. Elk goed zal een totaal volume van 50 μL bevatten. - Aan het einde van de lees, Seal de plaat met film om verdamping te voorkomen. Laat de plaat 's nachts op kamertemperatuur staan, zodat het enzym het substraat volledig kan snijden.
- Na ~ 24 h, verwijder de afdichtings folie en voer een eindpunt lezen van de plaat met behulp van dezelfde PMT als in de voorgaande platen. Gemiddelde deze emissie verhoudingen en invoer in tabel 3 onder "Cut". Bevestig het splijting van het substraat met behulp van de hieronder beschreven SDS-page discontinue assay (stap 5,1.).
- Exporteer de gegevens naar een spreadsheet. De fluorescentie-eenheden op elk moment van de 2 golflengten (tabel 4).
- Bereken de nmol van substraat die op tijd t zijn geknipt met behulp van vergelijking (1) waarbij X de emissie verhouding (527 nm/470 nm) op een bepaald tijdstip is, NEG de emissie ratio van het "Onbesneden" substraat bij t = 0, en POS is de emissie verhouding van het volledig "gesneden" substraat gemeten na 24 uur snijden (tabel 3).
Opmerking: Representatieve fluorescentie gegevens worden weergegeven voor een goed (goed E7) met een substraat van 80 μM (4 nmol van S per well) in tabel 4. De berekeningen werden uitgevoerd voor elk goed in de plaat. - Voor elke put, plot nmol vs. tijd (min) en het verkrijgen van de initiële snelheden (hellingen) door het aanpassen van de gegevens aan y = mx + b. Voor de gegevens verzameld in 4.1.5, plot nmol vs. tijd (min) voor elke put. De helling zal gelijk zijn aan het per minuut geproduceerde nmol-product. Aftrekken van de spontane snelheid van hydrolyse gemeten in 4.1.5 uit de enzym-gekatalyseerde reactiesnelheden (tabel 5).
Opmerking: De eerste Lees kan worden afgesneden van de gegevens als het is artifactueel hoog als gevolg van de beweging van de plaat in de plaat lezer. - Bereken de hoeveelheid enzym in mg die aan elke put is toegevoegd (bijv. 0,0009 mg). Een eenheid wordt gedefinieerd als een μmol van het product geproduceerd per minuut (μmol/min). Verdeel de nmol/min door de mg enzym aanwezig in de put om mU/mg te verkrijgen; Verdeel door 1.000 om U/mg te verkrijgen.
- Plot [S] μM op de x-as en U/mg op de y-as en plaats de gegevens in de Michaelis-Menten-vergelijking om VMax en Kmte verkrijgen. Dit kan worden gedaan in de software (bijvoorbeeld GraFit).
5. het enzym wordt niet continu gebruikt om SDS-PAGE te analyseren
- Bereid een 50 μL-reactie met 10 μM substraat en buffer in plaats van enzym en label als "ONBESNEDEN".
Opmerking: De volumes substraat en buffer worden weergegeven in tabel 2. Als de continue assay is uitgevoerd, kunnen de monsters direct vanaf de 96-well plate worden gebruikt.- Bereid een 50 μL-reactie met 10 μM substraat en 5 μL enzym en label als "CUT". Start de timer wanneer het enzym aan het substraat wordt toegevoegd.
Opmerking: Remmers kunnen worden toegevoegd aan extra buizen met enzym en substraat. Pas het volume van de toegevoegde buffer aan om het toegevoegde volume van de remmer te compenseren. De concentraties van DMSO mogen niet hoger zijn dan 2%. - Inincuberen de reacties voor ~ 15-24 h bij kamertemperatuur (22 ± 3 °C). Stop de reacties door 50 μL van 2x Laemelli-buffer toe te voegen. Na het stoppen van de reactie kook, elke buis voor 3-10 min.
- Monteer de geltank volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Plaats een 17-put voorgegoten 12% poly acrylamide gel cassette en een buffer dam aan de andere kant. Vul het binnenreservoir van de cel met 1x SDS-Running buffer totdat de buffer de bovenkant van de cassette bereikt. Vul het externe reservoir half-vol met dezelfde buffer.
- Om het splijting te analyseren met behulp van de discontinue test, laadt u 5 μL van elk reactiemengsel in een rijstrook van een SDS-PAGE gel die begint met de "ONBESNEDEN" reactie. Neem in de eerste of laatste strook een moleculair gewichts markering op.
- Bevestig de elektroden van de geltank aan de voeding en scheid de producten op 110 V gedurende 60 min. Verwijder de gel uit de cassette door het gereedschap kraken tussen de platen in te voegen. Plaats de gel in een plastic bakje en dompel de gel onder in 5-10 mL gel kleurings oplossing; bands zullen zichtbaar zijn binnen 30 minuten. Na 1-24 uur Verwijder de overtollige vlek, dompel de gel in water en gebruik een gel Imager om een foto van de gel te maken.
- Bereid een 50 μL-reactie met 10 μM substraat en 5 μL enzym en label als "CUT". Start de timer wanneer het enzym aan het substraat wordt toegevoegd.
6. docking substraat peptiden aan de VEEV-nsP2 cysteïne protease
- Download het coördinaten bestand voor de VEEV cysteïne protease uit het VOB (https://www.rcsb.org/). De PDB code is 2HWK. Sla het bestand op als 2HWK. pdb.
- Bereid de eiwitstructuur met MOE (https://www.chemcomp.com/). Laad het proteïne PDB-bestand in MOE. Klik op de selectie en het oplosmiddel aan de rechterkant balk en verwijder het oplosmiddel.
- Open het paneel structuur voorbereiding vanuit de bovenste menubalk proteïne. Automatisch alle structurele items corrigeren door te klikken op de juiste en protonate de structuur door te klikken op Protonate3D. Voeg gedeeltelijke toeslagen aan het eiwit toe door het deelvenster gedeeltelijke toeslagen te openen en Amber 99 te selecteren en de hydrogenen en Lone Pairs naar wens aan te passen. Sla het structuurbestand ten slotte op als "2HWK_dock. pdb".
- Bouw de structuur voor de substraat peptiden (nsP12, nsP23, nsP34) en TRIM14 met MOE. Open het paneel eiwit bouwer, voer de volgorde van de ondergrond in, stel de geometrie in als uitgebreid en klik op bouwen. De structuur zal worden getoond in MOE venster.
- Minimaliseer de peptide structuur door te klikken op minimaliseren in het paneel. Sla de structuur op als een PDB-bestand (afbeelding 6).
- Dock de substraat peptiden aan VEEV-nsP2 met behulp van PyRx/AutoDock 4,2 (http://autodock.Scripps.edu/). Open de PyRx tool, bewerk de voorkeursinstelling, Inactiveer alle torsies voor ligand preparaat. Laad het substraat molecuul, klik met de rechtermuisknop op de molecuul naam in het deelvenster Navigator, selecteer ligand maken om het ligand-koppelingsbestand voor te bereiden. Laad het eiwit 2HWK_clean. pdb en selecteer macromolecule maken om het pdbqt-dockingbestand voor te bereiden (afbeelding 7).
- Start de wizard autodock op het deelvenster docking onderaan. Selecteer de voorbereide ligand en proteïne-bestanden. Definieer de proteïne binding Pocket door het handmatig aanpassen van de raster dimensie die is gecentreerd op het katalytische residu CYS-477. Met behulp van de standaardafstand parameter 0,375 Å. Klik op Voer AutoGrid uit om rasterkaarten te genereren.
- Voer autodock uit en selecteer de methode Lamarckian genetische algoritme (LGA). Klik op de Dockingparameters en stel het aantal ga-runs in op 50. Gebruik de standaardparameters voor anderen. Klik op doorsturen om de docking-run te starten.
- Open het deelvenster resultaten analyseren . Inspecteer alle voorspelde bindende poses. Selecteer het beste model met de laagste voorspelde bindingsenergie en redelijke bindende interacties tussen de CYS-477 en substraat op de decolleté site. Sla het bindende model op als PDB-bestand voor verdere MD-simulaties.
7. MD simulaties van gedockte VEEV-substraat complexen
- Bereid de invoerbestanden met behulp van Amber (http://ambermd.org/). Volgens het standaardprotocol worden MD-simulaties uitgevoerd voor de voorspelde modellen voor substraat binding met behulp van het AMBER-pakket en het veld ff99SB Force.
Opmerking: De solvated Systems worden onderworpen aan een grondige energie minimalisatie voorafgaand aan MD simulaties. Periodieke grenswaarden worden toegepast om een continu systeem te simuleren. De methode van het particle mesh Ewald (PME) werd gebruikt om de elektrostatische interacties met lange afstand te berekenen. Het gesimuleerde systeem werd eerst onderworpen aan een geleidelijke temperatuurstijging van 0 K tot 300 K over 100 PS, en vervolgens geëscaleerd voor 500 PS op 300 K, gevolgd door productieruns van 2 NS lengte in totaal.- Voer de simulatie taak uit op een high performance computing Facility. Onze simulaties werden uitgevoerd op de Biowulf cluster (https://HPC.NIH.gov/) (Figuur 8).
- Visualiseer de traject output met behulp van het VMD-programma (http://www.KS.uiuc.edu/Research/VMD/). Analyseer de bindende interacties en conformationele veranderingen van de substraten en TRIM14 binnen de actieve plaats van nsP2 (Figuur 9).
Representative Results
SSHHPS analyse van de ZIKV ns2B/3 protease geïdentificeerd 4 host eiwit targets: FOXG1, SFRP1, een Gs alpha subeenheid van een retinale cDNA Library, en de NT5M mitochondriale 5 ', 3 '-nucleotidase (Figuur 10)6. Met name voorspelde geen andere methode deze eiwitten als potentiële doelen van de ZIKV protease. Mutaties in het FOXG1-gen zijn gekoppeld aan een aangeboren syndroom dat wordt gekenmerkt door verminderde ontwikkeling en structurele hersenafwijkingen zoals microcefalie. SFRP1 is een afgescheiden, frizzled-gerelateerd eiwit (SFRP); Deze oplosbare receptoren kunnen op competitieve wijze WNT-liganden binden aan antagoniseert en WNT-signalering remmen. De Wnt signalering traject is betrokken bij de regulering van de IFN reactie tijdens Flavivirus infectie36. Het decolleté van SFRP1 zou naar verwachting de Flavivirus-replicatie verbeteren. SFRP1 is ook betrokken bij Th17-celdifferentiatie37. Sequentie-overeenstemmingen van de SSHHP'S toonden soortspecifieke verschillen in de decolleté site sequenties (Figuur 10D). De decolleté site sequentie in SFRP1 was identiek bij mensen en kippen; ZIKV kan mortaliteit en microcefalie veroorzaken in kippen embryo's38. Bij knaagdieren wordt de sterk gecondengeerde P1-residu (K/R) R ↓ G vervangen door een Glycine (RGG). Immunocompetente muizenstammen zijn over het algemeen resistent tegen ZIKV infectie en ziekte39.
Steady State kinetische parameters en remming constanten kunnen worden gemeten voor de virale polyproteïne sequenties en voor de gastheer eiwit sequenties met behulp van de continue assay in een plaat lezer31,40,41 (Figuur 11a). Voor kwalitatieve decolleté informatie, zoals decolleté van een bepaalde sequentie of de remming van de protease door verschillende verbindingen, kan de discontinue test worden gebruikt (Figuur 11B).
De optimalisering van het aantal residuen tussen GVB en YFP kan nodig zijn. Een substraat gebonden model kan worden gemaakt met behulp van de in silico methoden. Een representatief gedockt model van de kruising nsP1/nsP2 wordt weergegeven in afbeelding 9. Voor de VEEV nsP2 protease was een decolleté van een 12-amino acid Semliki forest virus (SFV) sequentie gerapporteerd (Km = 0,58 mM)33. Het verlengen van de substraat volgorde tot 19, 22 en 25 residuen en het verminderen van de Ionische sterkte van de buffer leidde tot een significante reductie in Km. Onderzoek van de VEEV nsP2 kristalstructuur en kristal verpakking toonde ook aan dat een deel van een van de knooppunten was verpakt tegen het protease domein en was helical. Zo kunnen de langere VEEV-substraten beter binden door de herkenning van een secundair structureel motief.
Voor TRIM14, we verkregen een Km = 21 μM6,33. De Km voor het substraat met de host-eiwitsequentie was vergelijkbaar met de km -waarden van de substraten met de sequenties van de virale polyprotein decolleté site (km(V12) = 12 μm en Km(V34) = 21 μm). De splitsings site sequenties op de nsP1/nsP2, nsP2/nsP3, en nsP3/nsP4 knooppunten werden met verschillende efficiënties gesneden. In de cel, dit wordt gedacht om toe te staan voor sequentiële splitsing van de poly proteïne42.
Voorzichtigheid moet worden betracht bij het interpreteren van negatieve resultaten. Als er geen decolleté optreedt, kan de decolleté plaats te kort zijn of kan de gezuiverde protease inactief zijn. Voor substraten die geknipt worden, zijn extra experimenten nodig om het splijting van het volledige eiwit of decolleté in virus geïnfecteerde cellen te bevestigen. Er moeten passende follow-on-experimenten worden gekozen. De effecten van overexpressie of uitschakeling van het doeleiwit op virale replicatie kunnen ook worden getest.
Figuur 1: drie mechanismen van uitschakeling. Silencing kan optreden op het niveau van DNA, RNA, of eiwitten. Deze algoritmen ' zoeken en verwijderen ' gebruiken elk een ' trefwoord ' om het decolleté van een bestand met het woord te richten. Dit cijfer is gewijzigd van Morazzani et al.32 en de verwijzingen daarin. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: soortspecifieke verschillen in de decolleté van de site sequenties. De C-Terminal PRY/SPRY-domeinen van TRIM14-homologen worden in de uitlijning weergegeven. Het PRY/SPRY-domein kan worden geïdentificeerd door de geaccentueerde motieven die grijs zijn gemarkeerd. Human TRIM14 wordt gesneden in QEAGA ↓ G door de VEEV nsP2 cysteïne protease. De SSHHP-sequentie wordt in kleur weergegeven. Het residu in het groen is het P1-residu; blauw is de P4 residu, en in het rood zijn andere behouden residuen binnen de decolleté site Motif sequentie. Paarden haven een afgeknotte versie van TRIM14 zonder het PRY/SPRY-domein. De lysine gemarkeerd in cyaan is poly-alomtegenwoordige en is belangrijk voor de assemblage van de MAVS signalosome. De C-Terminal PRY/SPRY-domein kan transitief worden afgesneden door de nsP2 protease om de antivirale respons van de gastheer te schaden tijdens een acute virale infectie. In paardachtigen is dit domein altijd afwezig. Dit suggereert dat het PRY/SPRY-domein van TRIM14 een beschermende functie kan hebben tegen VEEV-infecties. Dit cijfer is gereproduceerd van Morazanni et al.6Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: SSHHPS-identificatie met behulp van blast. De volgorde van de decolleté-site op de veev nsP1/nsP2 Junction is afgestemd op de sshhp-sequentie in de host Protein TRIM14. Het residu groen gekleurd is het P1-residu; in blauw is de P4 residu en in het rood zijn andere geconcongeerde resten van de decolleté site Motif sequentie. De meeste harmoniseringen bevatten homologie aan gebieden buiten het gediende decolleté site motief of omvatten niet de P1/P1 ' scissile obligatie residuen. TRIM14 toonde een match met 6 residuen in sequentiële volgorde die P1 en P1 omvatte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: eiwit-en DNA-sequenties van het GVB-V12-YFP substraat voor de VEEV nsP2 cysteïne protease. De beperkings sites NdeI (CATATG) en XhoI (CTCGAG) worden in hoofdletters weergegeven. In het rood is de decolleté site sequentie van de virale poly proteïne die zich tussen nsP1 en nsP2. Het residu in het groen is de P1 ' residu en in blauw is de P4 residu van de decolleté site. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: eiwitsequentie van de TRX-VEEV-nsP2 cysteïne protease construct. Thioredoxine (TRX) wordt geel weergegeven. De trombine decolleté site en zijn-tag worden in cyaan weergegeven. De CYS-zijn dyad zijn rood gelabeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Peptide structuren in moe. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 7: docking van substraat peptide met behulp van PyRx/AutoDock. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: taken die op het Biowulf-cluster worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: model van het VEEV P12 substraat dat de decolleté site sequentie op de nsP1/nsP2 Junction bevat. De CYS-477/his-546 katalytische dyade wordt blauw weergegeven. Figuur werd gemaakt met behulp van pymol (https://pymol.org). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: SSHHPS-analyse van het zikavirus ns2B/ns3 protease. A) voorspelde eiwit doelstellingen voor de host van de Zikv ns2B/ns3 protease. Residuen in het rood komen overeen met één enkele decolleté site sequentie. Residuen in het groen worden getolereerd op de subsite en komen overeen met residuen op andere decolleté plaatsen. SFRP1 had het hoogste aantal identieke residuen in opeenvolgende volgorde. (B) GVB-substraat-yfp-eiwitten (~ 50-60 kDa) werden uitgedrukt en gezuiverd met de voorspelde sshhp-sequentie van elk gastheer eiwit (menselijk). De ZIKV protease cut Human FOXG1, SFRP1, NT5M en een Gsalpha subeenheid geïsoleerd uit een retinale cDNA Library. De decolleté producten zijn ongeveer 28-30 kDa. De substraat sequenties zijn beschikbaar in morazzani et al.6 (C) terwijl de ns2B/ns3 protease cut SFRP1, het heeft zijn homologen niet gesneden (SFRP2 en SFRP4). D) de uitlijning van de decolleté van verschillende diersoorten kan nuttig zijn bij de keuze van een diermodel voor een groep IV-virus. Merk op dat de gecondengeerde R ↓ G-sequentie verschilt tussen mensen en knaagdieren in SFRP1. Figuur gereproduceerd van Morazzani et al.6Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 11: kinetische analyse van steady state met behulp van de continue en discontinue assays. A) de in tabel 5 getoonde kinetische gegevens zijn in grafit uitgezet. De inzet toont de lineweaver-Burk plot. B) SDS-page gel die de splijting producten van het GVB-V12-yfp-substraat weergeeft. In Lane 1 is de "ONBESNEDEN" substraat (48 kDa). In Lane 2 is het "CUT" substraat (31 kDa en 27 kDa). In Lanes 3-9 werden verschillende verbindingen opgenomen om hun remmende activiteit te testen. Lane 4 bevat de E64d covalente remmer. Deze reacties werden 's nachts uitgevoerd voor ~ 17 h bij kamertemperatuur. Het koken van de monsters was nodig om het scherpe banding patroon te bereiken. De nsP2 protease is zichtbaar (56 kDa) in de reacties die enzym bevatten, maar niet in Lane 1. Lane 1 is de "No enzyme" controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Sequentie-specifieke vernietiging van een eiwit of een nucleïnezuur geleid door een vreemde sequentie wordt alleen gezien in een paar gevallen in de biologie. De in Figuur 1 getoonde mechanismen zijn defensieve mechanismen die een host beschermen tegen een virus of een virus van een host.
Met behulp van bioinformatica methoden kunnen we de doelstellingen identificeren die door deze systemen worden vernietigd. In onze analyses van SSHHP-sequenties ontdekten we dat velen van hen gevonden konden worden in eiwitten die nodig waren om aangeboren immuunresponsen te genereren. Sommige hadden duidelijke rollen zoals Mavs en trif (TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β), terwijl andere waren gerelateerd aan immuniteit hoewel complexere mechanismen (bijv. histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. De doel informatie die is opgeslagen in de SSHHP-reeks heeft de potentie om trajecten te identificeren die antivirale effecten tegen deze virussen hebben. Antivirale reacties in vivo zijn vaak virus-specifieke26,43. Subsets van trim proteïnen hebben bijvoorbeeld antivirale effecten op verschillende virussen43,44,45, sommige zijn virale restrictie factoren (bijv. HIV en TRIM5α). De specificiteit van de trim eiwitten (~ 70 zijn geïdentificeerd) nog steeds wordt onderzocht44,45. De informatie binnen SSHHP'S kan bijdragen aan ons begrip van hoe deze virussen de aangeboren immuunresponsen omzeilen. Andere patronen en correlaties kunnen worden ontdekt naarmate meer SSHHP'S worden onderzocht.
In onze analyses zijn soortspecifieke verschillen zichtbaar (Figuur 2, Figuur 10). Het is bekend dat deze virussen sommige soorten meer beïnvloeden dan andere. Informatie over het hostbereik, de gevoeligheid van de host en de verdediging van de host kunnen aanwezig zijn in SSHHPS. Bijvoorbeeld, paarden, de meest vatbare soort voor paardachtigen encefalitis virussen, ontbrak de regio van de menselijke TRIM14 die transitief werd gesneden door de VEEV nsP2 protease. Mensen sterven zelden aan VEEV-infecties, maar kunnen24worden geïnfecteerd. De Human TRIM14 Protein droeg een nsP2 protease decolleté sequentie6. De aanwezigheid van de splijting site suggereren dat mensen hebben een afweermechanisme tegen deze virussen. Vogels zijn gedacht te zijn potentiële reservoirs van deze virussen46. De corresponderende SSHHP-sequentie in het TRIM14-eiwit van kippen verschaf van de sequenties gevonden bij mensen en andere soorten. Subtiele verschillen zoals deze kunnen een doelhost eiwit oncleavable of gemakkelijker gespleten maken. Aguirre et al.16 toonde aan dat een oncleavable gemuleerd snaar eiwit hogere niveaus van IFN veroorzaakte na infectie met het Denguevirus en dat muizen natuurlijk een versie van Sting dragen die niet door de dengue ns2B3 protease wordt gesneden. De Murine STING eiwit werd niet gesneden door de ZIKV protease47. In onze SSHHPS-analyse observeerden we ook verschillen in de sequenties van de ZIKV-protease-decolleté op de site toen we de menselijke eiwitten vergeleken met die van knaagdieren6 (Figuur 10D). Het reproduceren van de soortspecifieke Proteolytische splijting van gastheer eiwitten kan belangrijk zijn in diermodellen die worden gebruikt voor groep IV-virussen. De remming van host Protein decolleté heeft ook implicaties met betrekking tot de ontwikkeling van groep IV proteaseremmers. In onze vorige publicatie toonden we aan dat we TRIM14 decolleté konden remmen door de VEEV nsP2 protease met behulp van CA074 methyl ester6. Dit resultaat suggereert dat kleine molecuul remmers van deze proteasen in staat zijn om de aangeboren immuunresponsen te moduleren die de infectie kunnen onderdrukken6,31.
Genetische variatie binnen een soort heeft ook de potentie om verschillen in Proteolytische splijting te produceren. Subtiele verschillen in het gebruik van codon kunnen invloed hebben op ribosoom onderbreken van48. Omdat sommige groep IV virale proteasen zijn ingebed in het ER membraan, verschillen in deze pauzes kunnen invloed hebben op decolleté van een doelwit als decolleté co-translationally optreedt. Sommige van de decolleté sites die we identificeerden waren in voorspelde signaal peptide sequenties (bijv., SFRP1) terwijl anderen intern waren.
SSHHPS-analyse kan informatie produceren die verschilt van andere methoden voor het hosten van eiwit analyses. SSHHPS-analyse was goedkoop en eenvoudig in gebruik. Het gebruik van een bacteriële expressie systeem toegestaan het testen van korte segmenten (~ 25 aminozuren) van zoogdier sequenties zonder het gebruik van zoogdier celcultuur. We constateerden dat de GVB-YFP-substraten alle geteste menselijke eiwit sequenties konden tolereren; echter, de rendementen varieerden. In vergelijkbare assays, substraten met menselijke eiwit sequenties zolang 63 aminozuren werden met succes uitgedrukt, gezuiverd, en gebruikt voor kinetische analyses en remmer screening49,50,51. Aangezien slechts kleine hoeveelheden van het substraat nodig zijn voor de discontinue Assay, kan een groot aantal doelwitten worden verkend. Een voordeel van het systeem is dat de CFP/YFP-substraten kunnen worden gebruikt voor SDS-PAGE-analyses en voor uitgebreidere kinetische analyses (d.w.z. IC50, ki, km, VMax). Voor de opsporing van geneesmiddelen, remmende verbindingen kunnen produceren artefacten in fluorescerende assays. Zo kan de discontinue assay in combinatie met een continue test een decolleté of remming van decolleté bevestigen. De monsters voor de discontinue SDS-PAGE assay kunnen direct uit de 96-well platen worden genomen. CFP/YFP substraten zijn gebruikt voor samengestelde bibliotheek screening52. Er zijn echter aanvullende analyses nodig om te bepalen of een substraat geschikt is voor screening met een hoge doorvoer, zoals de berekening van een Z-factor53.
Een uitdaging bij het ontwerpen van een substraat is het identificeren van de regio rond de scissile binding die is gebonden en herkend door de protease. In de hier getoonde voorbeelden begonnen we met 12 residu sequenties die gecentreerd waren rond de scissile binding. Na het analyseren van sequentie overeenstemmingen van de decolleté sites werd homologie op de residuen N-terminal van de scissile binding gevonden voor de VEEV protease, terwijl voor de ZIKV protease homologie aan verschillende van de C-terminale residuen werd aangetroffen. Een in silico-model van het gedockte substraat kan worden gebruikt voor het ontwerpen van door de site geleide mutagenese experimenten die de bindingsplaatsen van het substraat sonde. Aangezien de substraat-en enzym sequenties op plasmiden staan, kan worden gemuleerd om de in silico-modellen of subsite toleranties te testen. Dit kan voordelig zijn als er geen kristalstructuur van het gebonden substraat (s) beschikbaar is.
SSHHPS-analyse kan ook nieuwe informatie opleveren over de mechanismen waarmee door virussen geïnduceerde fenotypes worden geproduceerd door virale enzymen. Een van de zikv targets, SFRP1, maakt deel uit van de Wnt signalering traject en heeft rollen in zowel hersenen en oog ontwikkeling en in de immuunresponsen36,37,54,55,56,57. We constateerden dat de andere eiwit sequenties die door de ZIKV ns2B/ns3 protease konden worden gesneden ook in eiwitten waren die betrokken waren bij de ontwikkeling van hersenen en ogen; afwijkingen in beide zijn waargenomen bij congenitale Zika syndroom en worden verondersteld deel uit te maken van het virus-geïnduceerde fenotype58.
De voorspelbaarheid van gastheer-pathogen interacties kunnen worden misbruikt voor een verscheidenheid van toepassingen: target-specifieke oncolytic virale therapieën; het-riskeren van levende virusvaccins; verfijning, voorspellen of selecteren van diermodellen; voorspelling van het hostbereik of de gevoeligheid; voorspelling van zoönotische gebeurtenissen; en voorspelling van de host-verdediging. Aangezien de beschreven methoden op volgorde gebaseerd zijn, kunnen ze van waarde zijn om in de toekomst in software te integreren.
Disclosures
De meningen die hier worden geuit zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet die van de u. S. Navy, U. S. Army, U. S. Department of Defense, of de regering van de U. S.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Defense Threat reductie Agency (DTRA) projectnummers CB-SEED-SEED09-2-0061 en CBCall4-CBM-05-2-0019, en deels door de Intramural/Extramural onderzoeksprogramma van de NCATS, NIH (XH) en Naval Research Laboratory basis fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
| 2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
| 4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
| AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
| AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
| Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
| Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
| Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
| Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
| Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| DNAse | Sigma | DN25-1G | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
| Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
| IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
| Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
| Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
| Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
| Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher | ||
| New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
| Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
| pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
| Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
| Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
| Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
| RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
| RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
| RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
| Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
| Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
| SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |
References
- Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
- Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
- Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
- Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
- Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
- Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
- Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
- Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
- Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
- Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
- Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
- Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
- Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
- Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
- Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
- Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934 (2012).
- Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
- Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
- Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
- Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
- Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
- Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
- Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
- Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
- Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
- Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894 (2009).
- Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
- Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
- Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
- Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
- Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
- Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
- Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
- Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
- Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
- Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
- Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
- Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
- Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
- Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16 (2008).
- Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
- van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
- Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347 (2016).
- Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
- Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
- Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
- Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
- Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
- Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
- Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
- Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
- Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
- Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).
