Summary
אנו מציגים פרוטוקול כללי לזיהוי קטעים קצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (SSHHPS) מוטבע polyprotein הנגיפי. SSHHPS מזוהים על ידי הפרוטסים נגיפי ולהפנות את ההרס המיועד של חלבונים מארחים ספציפיים על ידי מספר וירוסים הקבוצה הרביעית.
Abstract
אנזימים אלפא-ויראליות מסונתז בפוליפפטיד בודד. Polyprotein לא מבניים (nsp) מעובד על ידי פרוטאז nsP2 ציסטאין שלה כדי לייצר אנזימים פעילים חיוניים עבור שכפול נגיפי. הפרוטסים ויראלי הם ספציפיים מאוד ולהכיר מחשוף שמרו רצפים מוטיב האתר (~ 6-8 חומצות אמינו). בכמה וירוסים Group IV, פרוטאז nsP (s) מחשוף מוטיב האתר ניתן למצוא חלבונים מארחים ספציפיים מעורב ביצירת תגובות החיסונית מולדים, במקרים מסוימים, החלבונים ממוקד להיראות מקושרים את הנגיף המושרה פנוטיפים. וירוסים אלה לנצל קטעים קצרים של הומוולוגי רצפי חלבון הפתוגן מארח (SSHHPS) עבור הרס ממוקד של חלבונים מארחים. כדי לזהות SSHHPS ויראלי מחשוף המחשוף באתר רצפי מוטיב ניתן להכניס את הפיצוץ ואת הגנום מארח (s) ניתן לחפש. הפצילות בתחילה ניתן לבחון באמצעות מטוהרים nsP ויראלי פרוטאז והעברת אנרגיה בתהודה הקרינה (לדאוג) מצעים שנעשו ב -E. coli. מצעים הסריג מכילים חלבון פלורסנט תכלת וצהוב ורצף האתר המחשוף (CFP-רצף-YFP). שיטת פרוטאז זו ניתן להשתמש ברציפות בקורא צלחת או ברציפות ב-SDS-דף ג ' לים. מודלים של מצעים פפטיד מאוגד ניתן לייצר בסיליקו כדי להנחות את המצע בחירת מחקרים מוטגנזה. CFP/YFP מצעים יש גם מנוצל כדי לזהות מעכבי פרוטאז. אלה בתוך מבחנה ובשיטות סיליקו ניתן להשתמש בשילוב עם בחני מבוסס תא אומר לקבוע אם החלבון המארח הייעודי משפיע על שכפול נגיפי.
Introduction
עדות של העברה גנטית אופקית מווירוס לארח, או מארח לנגיף, ניתן למצוא במגוון של גנום1,2,3,4. דוגמאות של האנדוזציה ויראלית הם רצפי מרווח crispr שנמצאו מארח חיידקי גנום4. לאחרונה, מצאנו ראיות של רצפי חלבון מארח מוטבע ב polyproteins שאינם מבניים של (+) ssRNA קבוצה הרביעי וירוסים. רצפים אלה בתוך אזורי הקידוד של הגנום הנגיפי ניתן להפיץ באופן כללי. הקטעים הקצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (sshhps) נמצאים בווירוס ומארח5,6. SSHHPS הם באתר המחשוף שמרו רצפי מוטיב המוכרים על ידי הפרוטסים נגיפי כי יש הומולוגיה לחלבונים מארחים ספציפיים. רצפים אלה מכוונים את ההרס של חלבונים מארחים ספציפיים.
בפרסום הקודם שלנו6, הערכנו רשימה של כל החלבונים המארחים שהיו ממוקדים על ידי הפרוטסים ויראלי מצאו כי רשימת היעדים היה לא אקראי (שולחן 1). שתי מגמות היו בבירור. ראשית, רוב הפרוטסים ויראלי כי לחתוך חלבונים מארחים שייך לקבוצה הרביעי וירוסים (24 של 25 מקרים מעורבים הקבוצה הרביעית ויראלית), פרוטאז אחד שייך (+) ssRNA קבוצת השישי וירוסים (HIV, הנגיף החיסוני האנושי)7. שנית, מטרות החלבון המארח להיות גזור על ידי הפרוטסים נגיפי היו מעורבים בדרך כלל ביצירת התגובות החיסונית מולדים רומז כי ביקנים נועדו להרגיז את התגובות החיסונית של הפונדקאי. מחצית החלבונים המארחים ממוקדות על ידי הפרוטסים ויראלי היו רכיבים ידועים של מפלי איתות שיוצרים אינטרפרון (IFN) ו ציטוקינים proinflammatory (שולחן 1). אחרים היו מעורבים בתמלול התאים המארחים8,9,10 או תרגום11. מעניין, Shmakov ואח '4 הראו כי רצפי CRISPR רבים מתאים לגנים המעורבים בתוך בניין הפלבאמצע או שכפול4.
הקבוצה הרביעית כוללת, בין היתר, מפלאביריתיים, פיאורנרידיים, מאוזיים, כלוניים , וטוגוניים. מספר פתוגנים חדשים ומתפתחים שייכים לקבוצה IV כגון וירוס Zika (ZIKA), מערב הנילוס (WNV), Chikungunya (CHIKV), חמור תסמונת הנשימה הנשימתית וירוס (סארס) ואת תסמונת הנשימה המזרח התיכון וירוס (מרס). The (+) הגנום ssRNA הוא בעיקרו פיסת mRNA. כדי לייצר את האנזימים הנחוצים לשכפול הגנום, הגנום (+) ssRNA הראשון חייב להיות מתורגם. ב אלפא וירוסים ווירוסים הרביעי של הקבוצה, האנזימים הנחוצים לשכפול מיוצרים ב-polyprotein יחיד (כלומר, nsP1234 עבור VEEV). פוליפרוטאין שאינו מבני (nsP) הוא מעובד פרוטפוליסטי (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) על ידי פרוטאז nsP2 לייצר אנזימים פעילים12 (איור 1). פצילות של פוליפרוטאין על ידי nsP2 פרוטאז חיוני עבור שכפול נגיפי; זה הוכח על ידי מחיקה ומוטזיס בבימויו של האתר של האתר הפעיל ציסטאין של nsP2 פרוטאז13,14. בעיקר, את התרגום של חלבונים נגיפי לפני אירועי שכפול הגנום. לדוגמה, nsP4 מכיל rna התלוי רנ א פולימראז צורך לשכפל את (+) הגנום ssRNA. שכפול הגנום יכול לייצר dsRNA intermediates; intermediates אלה יכולים להפעיל את התגובות החיסונית מולדים של המארח. Thus, וירוסים אלה עשויים לקליב מארח מולדת תגובה חיסונית חלבונים בתחילת זיהום על מנת לדכא את השפעותיו15,16,17.
השתקה יכולה להתרחש ברמה של דנ א, רנ א וחלבון. מה שמשותף לכל אחד ממנגנוני ההשתקה המוצגים באיור 1 הוא ה-DNA הזר הקצר, RNA או רצפי החלבונים משמשים כדי להנחות את ההרס של מטרות ספציפיות כדי להרגיז את תפקידם. מנגנוני ההשתקה הם מקבילה לתוכניות "חיפוש ומחיקה" שנכתבו בשלוש שפות שונות. רצף המחשוף הקצר הוא אנלוגי ל-"מילת מפתח". לכל תוכנית יש אנזים המכיר את ההתאמה בין הרצף הקצר ("מילת המפתח") לבין מילה ב"קובץ" שנמחק. לאחר שנמצאה התאמה, קיצוץ האנזים ("מוחק") את רצף היעד הגדול יותר. שלושת המנגנונים המוצגים באיור 1 משמשים להגנה על המחשב המארח מפני וירוסים, או כדי להגן על וירוס ממערכת החיסון של המחשב המארח.
הפרוטסים ויראלי לזהות מחשוף קצר באתר רצפי מוטיב בין ~ 2-11 חומצות אמינו; ב נוקלאוטידים, זה יתאים 6-33 בסיסים. להשוואה, רצפי מרווח crispr הם ~ 26-72 נוקלאוטידים ו rnai הם ~ 20-22 נוקלאוטידים18,19. בעוד רצפים אלה קצרים יחסית, הם יכולים להיות מזוהים במיוחד. בהינתן מגוון גבוה יותר של חומצות אמינו, ההסתברות של אירוע מחשוף אקראי הוא נמוך יחסית עבור פרוטאז נגיפי הכרת רצפי חלבון של 6-8 חומצות אמינו או יותר. החיזוי של SSHHPS בחלבונים מארחים יהיה תלוי במידה רבה בספציפיות של הפרוטאז הנגיפי הנבדק. אם פרוטאז יש הדרישות הספציפיות רצף קפדנית הסיכוי למצוא רצף האתר מחשוף הוא 1/206 = 1 ב 64,000,000 או 1/208 = 1 ב 25,600,000,000; עם זאת, ברוב הפרוטסים יש אתר משנה טולרנסים (למשל, R או K עשוי להיות נסבל באתר S1). כתוצאה מכך, אין דרישה לזהות רצף בין הרצפים שנמצאו במחשב המארח לעומת הווירוס. עבור מיומנויות ויראליות כי יש דרישות רצף משוחרר יותר (כגון אלה השייכות Picornaviridae) ההסתברות למציאת אתר מחשוף בחלבון מארח עשוי להיות גבוה יותר. רבים מהערכים בטבלה 1 הם ממשפחת פיאורנריים .
&שכטר סימון ברגר משמש בדרך כלל לתיאור השקעים במצע פרוטאז ולאתרי האתר שעליהם הם מאגד, אנו משתמשים בסימון זה לאורך כל הדרך. שאריות במצע כי הם N-טרמינל של scissile bond מסומנים P3-P2-P1 בעוד אלה הם C-טרמינל מסומנים P1'-P2' P3 '. אתרי האתר המתאימים בפרוטאז כי לאגד אלה חומצות אמינו שאריות הם S3-S2-S1 ו-S1'-S2'-S3 ', בהתאמה.
כדי לקבוע אילו חלבונים מארחים מיועדים, אנו יכולים לזהות את SSHHPS באתרי המחשוף הנגיפי פוליפרוטאין ולחפש את החלבונים המארחים המכילים אותם. להלן, אנו הליכי מיתאר לזיהוי SSHHPS באמצעות מחשוף הנגיפי פרוטאז האתר רצפים. השיטות הביותטיות, הפרוטאז, ובשיטות סיליקו המתוארות, מיועדות לשימוש בשילוב עם מספר מבוסס-תא.
מערכים רצף של החלבונים המארחים ממוקד על ידי הפרוטסים נגיפי חשפו מינים ספציפיים הבדלים בתוך אלה רצפי מחשוף קצר באתר. לדוגמה, וירוס דלקת קרום המוח של ונצואלה (VEEV) nsP2 פרוטאז נמצא לחתוך את TRIM14 האנושי, מוטיב ה tripartite COMMISSION (TRIM) חלבון6. כמה חלבונים TRIM הם גורמי הגבלה נגיפי (למשל, TRIM5α21), רובם נחשבים אוביקוויב E3 ליגסים. TRIM14 חסרה טבעת (גן מאוד מעניין באמת) התחום והוא אינו נחשב E3 ליגאז22. TRIM14 כבר הציע להיות מתאם בתוך הסימן האנטי ויראלי מיטוכונדריאני (MAVS)22, אבל אולי יש פונקציות אנטי ויראליות אחרות23. היישור של רצפי TRIM14 ממינים שונים מראה כי הסוס חסר באתר המחשוף והנמל גרסה קטומה של TRIM14 כי הוא חסר את ה-C-terminal מתחם/SPRY. תחום זה מכיל אתר polyubiquitination (איור 2). בסוסים, וירוסים אלה הם קטלניים מאוד (~ 20-80% תמותה) ואילו בבני אדם רק ~ 1% למות מזיהומים VEEV24. הפצילות של התחום לחטט/SPRY עשוי להיות קצר ביותר מעגל איתות מתחת ל-MAVS. מפל זה יכול להיות מופעל על ידי dsRNA ומוביל לייצור ציטוקינים אינטרפרון ו pro-דלקתיות. כך, הנוכחות של SSHHPS עשוי להיות שימושי לניבוי איזה מינים יש מערכות הגנה נגד וירוסים מסוימים הרביעי קבוצה.
בווירוסים של הקבוצה הרביעית, מנגנוני האנטוניזם של IFN נחשבים להכפלת25מיותרים. מעטפת חלבון מארח עשוי להיות ארעי במהלך זיהום וריכוזים עשוי להתאושש לאורך זמן. מצאנו בתאים כי מוצרי המחשוף TRIM14 ניתן להבחין מוקדם מאוד לאחר החצייה (6 h) עם קידוד פלבמיד את פרוטאז (cytomegalovirus ירוס מקדם). עם זאת, בתקופות ארוכות יותר, מוצרי המחשוף לא זוהו. בתאים נגועים בווירוס, הקינטיקה היו שונים מוצרי המחשוף יכול להיות מזוהה בין 6-48 h6. אחרים דיווחו על הופעתו של מארח חלבון מוצרי מחשוף מוקדם ככל 3-6 h לאחר הזיהום9,11.
פעילות פרוטחרדה בתאים לעתים קרובות קשה לתפוס; מוצרי המחשוף יכולים להשתנות באמצעות מסיסות, ריכוז, יציבות וחיים. בתוך תא מבוסס assays זה לא ניתן להניח כי מוצרי מחשוף יצטברו בתא או כי עוצמות הלהקה של החלבון גזור ומלא מלוטש יציג מגדילה הפיצוי ופוחתת כמו חלבון לחתוך עלול להיות מושפל מהר מאוד ולא ניתן לגילוי בכתם המערבי במשקל מולקולרי צפוי (MW) (למשל, האזור המכיל את האפירופה יכול להיות ביקע על ידי הפרוטסים מארחים אחרים או יכול להיות אוביקווילי. אם המצע של הפרוטאז הנגיפי הוא חלבון תגובה חיסונית מולדת, הריכוז שלה עשוי להשתנות במהלך הזיהום. לדוגמה, כמה חלבונים מולדים תגובה חיסונית נמצאים לפני זיהום נגיפי הם המושרה עוד על ידי אינטרפרון26. הריכוז של חלבון היעד עשוי אפוא להשתנות במהלך הזיהום והשוואה של ליטים נגועים נגוע לעומת נגוע עלול להיות קשה לפענוח. בנוסף, כל התאים עשויים שלא להיות מזוהמים או נגועים בצורה אחידה. בתוך הפריה חוץ גופית פרוטאז שימוש בחלבונים מטוהרים מ -E. coli מצד שני יש פחות משתנים שעליהם לשלוט וכדומה יכול להיעשות באמצעות sds-PAGE במקום בלוק חיסוני. הפרוטסים מזהם יכול להיות מעוכב בשלבים המוקדמים של טיהור חלבון של המצע CFP/YFP, ומוטציה ויראלי הפרוטסים ניתן לטהר ונבדק כפקדים כדי לקבוע אם המחשוף נובע פרוטאז נגיפי או פרוטאז חיידקי מזהם.
מגבלה אחת של פרוטאז מחוץ לבית הספר היא שאין להם מורכבות של תא יונקים. כדי שאנזים יחתוך את המצע שלו, השניים חייבים להיות מותאמים לשיתוף. שונות ויראלית של קבוצה הרביעית במבנה ובלוקליזציה. לדוגמה, פרוטאז ZIKV מוטבע הממברנה האנדופלזמית (ER) הפנים ופרצופים ציטוסול, בעוד הפרוטאז VEEV nsP2 הוא חלבון מסיס בציטופלסמה ו גרעין27. חלק מהמחשוף שנמצאו בניתוח ZIKV SSHHPS היו בפפטידים של אותות הרומזים כי המחשוף עלול להתרחש במשותף למטרות מסוימות. כך, המיקום של פרוטאז ואת המצע בתא גם צריך להיחשב בניתוחים אלה.
בחני מבוסס התא יכול להיות בעל ערך עבור הקמת תפקיד עבור חלבון מארח מזוהה (s) זיהום. שיטות שמטרתן לעצור מחשוף פרוטאז ויראלי של חלבונים מארחים כגון תוספת של מעכב פרוטאז6 או מוטציה ביעד המארח16 ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות שלהם על שכפול נגיפי. ביטוי יתר של חלבון ייעודי גם עלול להשפיע על שכפול נגיפי28. הפלאק אומר או שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לכמת שכפול נגיפי.
Protocol
1. ביואינפורמטיקה: זיהוי של SSHHPS בגנום מארח באמצעות הפיצוץ
הערה: הפיצוץ חלבון ניתן למצוא ב blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
- קלט ~ 20 חומצות אמינו המקיפים את הקשר scissile ב polyprotein ויראלי. בחר רצפי חלבון שאינם יתירים והקלד את הגנום המארח כדי לחפש (למשל, הומו ספיינס).
- במידת הצורך, בחר פי-הפיצוץ. הקלד רצף תבניות (לדוגמה, עבור 25 שאריות של רובוטית v12 המוצג להלן להזין את התבנית "AG" ללא ציטוטים).
הערה: ב-PHI-הפיצוץ, סוגריים מרובעים [XY] לציין כי חומצת אמינו X או Y יכול להיות במיקום אתר המשנה (למשל, AG [AC] [גיי]). - בדוק את תוצאות הפיצוץ ולזהות את הלהיטים בעלי זהות רצף גבוה לשקעים הנשמרים באתרי המחשוף הפוליפוניים (למשל, חלבון מוטיב טריפרטיטה 14) (איור 3).
הערה: עבור סרין פרוטסיס שימור גבוה יותר של שאריות P1 הוא צפוי, ואילו עבור ציסטאין הפרוטסייסים שימור גבוה יותר של שאריות P2 הוא צפוי. - צבעו את השקעים הזהים לרצף של אתר מחשוף והם בסדר רציף (ללא רווחים). צבעו את השקעים הנסבלים באתר המשנה, אך הציגו באתר מחשוף אחר בצבע שני.
הערה: שאריות המייצגים תחליפים שמרנים (למשל, מLeu vs. Val) שאינם נוכחים באתר מחשוף ויראלי ניתן למצוא, או שאינם מזוהים על ידי הפרוטאז הנגיפי. - להורות על הפיצוץ להיטים בהתבסס על מספר שאריות זהים או נסבל ברציפות התואמים רצף האתר מחשוף. מתוך הרשימה, בחר את החלבונים המכילים ≥ 6 שאריות זהים או דומים לניתוח ב פרוטאז assays.
- חזור על ההליך עבור אתרי המחשוף האחרים (nsP2/3, nsP3/4, וכו ') ויחזק בהדרגה את החיזוי על-ידי הוספת משקעים שאינם מנוהלים יותר לתבנית פי-הפיצוץ.
- במידת הצורך, בחר פי-הפיצוץ. הקלד רצף תבניות (לדוגמה, עבור 25 שאריות של רובוטית v12 המוצג להלן להזין את התבנית "AG" ללא ציטוטים).
2. בתוך מחוץ לספר: עיצוב והכנת מצעים פרוטאז
- בניית פלאמיד קידוד חלבון פלורסנט ציאן (CFP), ≤ 25 חומצות אמינו של רצף האתר המחשוף, ואחריו חלבון פלורסנט צהוב (YFP, הידוע גם בשם ונוס29).
הערה: ניתן לבנות את הפלמיד באמצעות רצף ושיבוט עצמאי (SLIC)30 או סינתזה גנים מסחריים. פלpet15b בינוני המכיל את הרצף המוצג באיור 4 היה מסונתז מסחרית ושימש כאן.- כדי למטב את אורך המצע, לבנות באורך משתנה נוסף מצעים המכילים 12-25 חומצות אמינו של הטבעי ויראלי מחשוף מפצילות האתר באמצעות התגובה SLIC 2 קטעים. ניתוח מחשוף באמצעות שיטת SDS-דף מבוססי ג'ל או על ידי מדידת הפרמטרים של מצב יציב קינטי באמצעות שיטות להלן.
הערה: במקרים מסוימים, אתרי המחשוף ניתן לזהות על ידי הומולוגיה לאתרי המחשוף הידועים31. אם המחשוף של מצעים המכילים את רצפי הצומת polyprotein לא נצפתה, ייתכן שיש דרישה עבור שאריות נוספים או מוטיב מבניים (g.,32alpha סליל). לחילופין, פרוטאז ויראלי מטוהר יכול להיות פעיל. לאשר את המחשוף של רצפי פוליפרוטאין נגיפי לפני שרודפים SSHHPS ניתוח. מספר השקעים במצע היה מותאם עבור הפרוטאז הווייב באמצעות מצעים באורך משתנה (12 עד 25 חומצות אמינו) ולאחריו ניתוח של Vmax ו-Km32,33. הns2B/nsb של המחשוף הנגיפי בשימוש בדוגמאות פורסמו34,35.
- כדי למטב את אורך המצע, לבנות באורך משתנה נוסף מצעים המכילים 12-25 חומצות אמינו של הטבעי ויראלי מחשוף מפצילות האתר באמצעות התגובה SLIC 2 קטעים. ניתוח מחשוף באמצעות שיטת SDS-דף מבוססי ג'ל או על ידי מדידת הפרמטרים של מצב יציב קינטי באמצעות שיטות להלן.
- להכין את מצעים CFP/YFP על ידי שינוי טרי 8-20 μL של BL-21 (DE3)E. coliתאים מוכשרים עם CFP-רובוטית v12-YFP פלמיד על פי הוראות היצרן ועל צלחת על לוריא ברטני (LB) אגר צלחות המכילות 50 μg/mL אמפיצילין (37 ° c).
- אוטוקלב ארבע 4 מבחנות L המכיל מדיה LB (1.5 L מדיה לכל בקבוקון) ו 100 mL של LB בבקבוקון 250 mL. כובע כל בקבוקון עם רדיד אלומיניום.
- איחסן את תרבות 100 mL עם מושבה של חיידקים טריים שעברו שינוי ולצמוח ב 37 ° צ' עם טלטול (200 rpm) לילה.
- כדי להפוך את המצע CFP/YFP, האיחסן ארבע ארבע מבחנות עם 25 מ ל של תרבות לילה. התחל לטלטל את התרבויות ב 37 ° צ' ולפקח על הצמיחה על ידי UV-vis ספקטרוסקופיה ב 600 ננומטר שעה.
- כאשר החיידק מגיע לספיגה של ~ 1.0 ב 600 nm (כ ~ 3-4 h של הצמיחה) לגרום חלבון ביטוי על ידי הוספת 0.5 mL של 1 M איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לבקבוקון. לאחר הוספת IPTG, להקטין את הטמפרטורה של האינקובטור לרעוד ל 17 ° c ולאפשר ביטוי להמשיך למשך הלילה עבור 17-20 h.
- גלולה החיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 7,000 x g עבור 10 דקות (4 ° c) ולשמור את כדורי. הסר והתעלם ממדיה נוזלית. אחסן את כדורי ב-80 ° c או lyse באופן מיידי.
- להכין 100 mL של מאגר הליזה המכיל 50 mM Tris pH 7.6, 500 mM הנאל, 35 mL של חלבון חיידקי החילוץ מגיב, 30 מ"ג של lysozyme, 25 U של DNase, ו 1 הלוח מעכב פרוטאז. השהה מחדש את כדורי במאגר הליזה עם פיפטה והעברה של ~ 25-35 mL לתוך 50 mL מנורות חרוט חד פעמיות.
- מניחים את הצינורות בתוך גביע פלסטיק המכיל מי קרח. הכנס את העצה sonicator לתוך הצינורות כך הטיפ הוא ~ 1 ס מ מהחלק התחתון של הצינור וsonicate lysates 10-20 פעמים ברמה 5 עבור מרווחי 15 s עד ליפוסט הופך נוזל מעובה.
הערה: השתמש בהגנת שמיעה במהלך sonication. - העבר את ליפוסט לצינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה וצנטריפוגה ב 20,500 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c. לאחר הספין, לשמור על supernatant (~ 100 mL) ולהעביר אותו לבקבוק נקי. להיפטר כדורי.
- להכין 1 L של מאגר A (50 mM טריס pH 7.6, 500 מ"מ הנאל). להכין 300 mL של מאגר B (50 mM טריס pH 7.6, 500 mM הנאל, 300 מילימטר).
- באופן שולי מ100 עמודת ניקל mL באמצעות 3 כרכים של עמודות של מאגר A ושיעור זרימה של 5 מ"ל/min.
- טען את הליפוסט על עמודת הניקל באמצעות קצב זרימה של 2 עד 5 mL/min. שטוף את העמודה עם 2 אמצעי אחסון של עמודות של ' מאגר A ', ולאחר מכן על-ידי כרכים של ~ 5 עמודות של 20% מאגר B. במהלך שטיפת האגירה ב-20%, הספיגה ב-280 nm (A280) תגדיל כמזהמים מתוך הטור במהלך השטיפה. המשך לשטוף את הטור עדש280 של הללויה חזרה לערכים בסיסיים.
- Elute החלבון עם 2-3 כרכים העמודה של 100% מאגר B באמצעות קצב הזרימה של 2-5 mL/min ולאסוף 10 מ"ל שברים. מדוד את ה-A280 של כל שבר.
- לשלב ולרכז שברים המכילים A280 > 0.1 באמצעות יחידת אולטראפילטרציה בעלת 15 מ"ל. סובב את יחידות האולטרה-סינון ב-5,000 x g עבור 15 דקות והמשך להוסיף שברים עד שעוצמת הקול הופחתה ל ~ 50-75 mL.
- גזור 14 פיסת אינץ ' של אבובים דיאליזה עם משקל מולקולרי לגזור (MWCO) של 6-8 kDa. מימה צינורות דיאליזה על ידי הרתיחה אותו לגמרי שקוע 300 mL של מים עבור 10 דקות. לקשור קשר מאובטח בקצה אחד של הקרום. מלא את התיק עם מאגר דיאליזה כדי לוודא שאין סדקים או דליפות. הסירו את החוצץ מהתיק ושמרו את התיק מתחת למאגר הדיאליזה.
- להעביר את החלבון מרוכז מ2.2.13 לתוך שקית הדיאליזה עם פיפטה פלסטיק. להסיר בועות אוויר מהתיק. סגור את השקית בקשר שני או באטב דיאליזה. Dialyze החלבון נגד 500 mL של 50 mM טריס pH 7.6, 5 מ"מ EDTA (החומצה האטיניבית של התרופה), 250 mM בשנת בשנת בשנת בשנת בשנת 4 500 מעלות גליל לילה ב -4 ° c.
- Dialyze חלבון פעם שנייה נגד 500 mL של 50 mM טריס pH 7.6 ב 4 ° צ' עבור 2 h.
- עבור העמודה אניון exchange להכין 500 mL של מאגר A (50 mm טריס ph 7.6) ו 500 mL מאגר B (50 mm טריס ph 7.6, 1.0 M הנאל). באמצעות השפה 30 mL החלפת עמודה עם 3 כרכים עמודה של מאגר A (2-5 mL/min).
- הסירו את החלבון משקית הדיאליזה והעבירו אותו לבקבוק. . תשאיר את הבקבוק על הקרח טען את החלבון דיאליזה על העמודה (2-5 mL/min).
הערה: החלבון CFP/YFP יהיה לאגד את העמודה יהיה צהוב במראה. - שטוף את העמודה באמצעות ' מאגר A ' עדש280 מחזירה לתוכנית הבסיסית (5 מ"ל/דקה). Elute החלבון באמצעות מעבר צבע (0-50% מאגר B, 100 mL) ולאסוף 10 מ"ל שברים.
- בדוק את שברי העמודות באמצעות SDS-PAGE. שלבו את אלה ש> 95% טהורים.
- רכזו את החלבון ל-A280 ~ 10-20 באמצעות יחידת בדיקת אולטרה-מדיה צנטריפוגלית 15 mL. סובב את הרכז ב 4,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ולהמשיך להוסיף חלבון עד כל שברים המכילים חלבון שולבו.
- הסירו את החלבון משקית הדיאליזה והעבירו אותו לבקבוק. . תשאיר את הבקבוק על הקרח טען את החלבון דיאליזה על העמודה (2-5 mL/min).
- הסר בזהירות את החלבון מהרכז עם פיפטה. מחלקים את החלבון לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL והקפאת הבזק בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c. המאגר מחליף את החלבון בטמפרטורת החדר באמצעות טור של PD-10 הכולל את מאגר התאים המתאים לפני השימוש.
- השימוש בחוק בירה מחשב את ריכוז החלבון באמצעות A280 ומקדם השמדה מחושב (למשל, עבור המצע רובוטית v12 ɛ = 47,790 M-1 ס מ -1).
הערה: ניתן לחשב את מקדם ההשמדה (ɛ) מתוך רצף החלבונים באיור 4 באמצעות התוכנית Expasy פרוטוכאראם (https://web.expasy.org/protparam/).
3. הכנת האלפא ויראלי nsP2 ציסטאין פרוטאז
- עיצוב ובניית פלסמיד קידוד הפרוטאז. עבור הפרוטסים ציסטאין, השתמש בpet32 פלמיד לבניית חלבון היתוך thioredoxin (trx).
הערהPet32 באמצע מקודד באתר מחשוף הטרומבין (LVPRGS) להסרת thioredoxin ו-שלו-tag (איור 5). Thioredoxin יסייע לשמור על האתר הפעיל ציסטאין במצב מופחת במהלך הביטוי. עבור סרין פרוטסיס, thioredoxin אינו נחוץ ושלבים הכרוכים בהסרת התרומבין ניתן להשמיט. רצף הפרוטאז VEEV nsP2 שולב לתוך פלביניים pet32b כי היה מוכן מסחרית כדי למנוע טיפול סוכני בחירה.- שינוי טרי ה-DNA פלמיד לתוך BL21 (DE3) החיידק של א. קולי לפי כיווני היצרן. צלחת חיידקים על LB אגר צלחות המכילות אמפיצילין.
הערה: כלורמפאנסול משמשת רק עבור זנים E. coli הנושאים את פלאאס פלמיד והוא מושמט אם BL21 (DE3) תאים משמשים. אין צורך לכלול כלוראמאנקול על לוחית LB אגר בשלב זה. - אוטוקלב ארבע 4 ליטר מבחנות של 1.5 L של LB מדיה (6 L סה כ נפח) ו 100 mL של LB בבקבוקון 250 mL. כובע כל בקבוקון עם רדיד אלומיניום.
- איחסן 100 mL לילה התרבות של LB/אמפיצילין עם מושבה מן הצלחת ולצמוח בחממה רועדת (200 rpm) ב 37 ° c.
- לחישוב 4 L מבחנות עם 25 מ ל של תרבות הלילה ולהוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה.
הערה: התקשורת עבור BL21 (DE3) התאים הנושאים את הפלזמה pet32 צריך להיות ריכוזי הסופי של 25 μg/mL כלורמפנול ו 50 μg/mL אמפיצילין. - לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת 0.5 mL של IPTG לתרבות כאשר ספיגת ב 600 ננומטר מגיע 1.0. הנמך את הטמפרטורה של האינקובטור הרועד ל -17 ° c. אפשר לביטוי להמשיך למשך הלילה (~ 17 שעות).
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (7,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c). הסר והשמט את המדיה הנוזלית.
הערה: את כדורי ניתן לאחסן ב-80 ° c במשך חודשים או מיידית. - להכין 100 mL של מאגר הליזה (50 mM Tris pH 7.6, 500 mL הנאטו, 2 מ"מ ביתא רקפטואתנול (bme), 30 מ"ג lysozyme, 5% גליצרול, 25 U dnase, 35 mL בקטריאלי חלבון החילוץ מגיב). פתח בקבוקים של BME בשכונה כימית בעת הוספת. לשמור על החיידקים למטה בקרח או ב 4 ° c עבור זה ואת כל הצעדים הבאים.
הערה: עבור הפרוטסים ציסטאין, 2 מ"מ bme הוא כלול כדי לשמור את cystehilic ציסטטין מופחת. ניתן להפעיל את העמודות בטמפרטורת החדר באמצעות מאגרים מצוננים. יש לעשות את המאגרים עם מים קרים שעברו התקררות עד 4 ° c. - השהה מחדש את כדורי החיידקי ב-~ 25 מ ל של מאגר הליזה והעבר ~ 25 מ ל של ליפוסט לתוך 4 x 50 mL שפופרות חרוט חד פעמיות. מניחים את הצינורות לתוך כוסות פלסטיק המכילות מי קרח. Sonicate the ליפוסט 10 פעמים ברמה 5 עבור מרווחי 15 s.
- העבר את הליפוסט לצינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה. להבהיר את הליפוסט על ידי צנטריפוגה (30 דקות, 20,500 x g ב 4 ° c).
- להכין 0.5 L של מאגר A (50 mM טריס pH 7.6, 500 mM הנאקל, 5% גליצרול, 2 מ"מ BME) ו להתקרר עד 4 ° c.
- להכין 250 mL של מאגר B (50 mM טריס pH 7.6, 500 mM הנאל, 5% גליצרול, 2 מ"מ BME, 300 מ"מ) ו להתקרר 4 ° c.
- באמצעות שפות של 50 mL עם שלושה כרכים של עמודות של מאגר A. טען את הליפוסט הבהיר על העמודה ב 2-5 mL/min ולמחוק את כדורי.
- שטוף את העמודה (2-5 mL/min) עם 2 כרכים של עמודות של מאגר A ואחריו 5 כרכים של עמודות של מאגר A המכיל 20% מאגר B (60 מ"מ הסרמדול). Elute החלבון (5 מ"ל/min) עם 100% מאגר B ולאסוף 10 מ"ל שברים.
- לשלב ולרכז שברים המכילים את הפרוטאז כי יש280 ≥ 0.1 באמצעות 15 מ"ל יחידת בדיקת אולטרה-מדיה צנטריפוגלי ו 15 דקות ספינים ב 5,000 x g ב 4 ° c. לאחר שעוצמת הקול הופחתה ל-~ 5 mL, החלפת המאגר החלבון ביחידת הריכוז על-ידי הוספת מאגר דיאליזה טרי לחלבון (50 mM Tris pH 7.6, 250 מ"מ הנאטו, 5% מילימטר הדקט (DTT), 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול). ספין שוב ב 5,000 x g ב 4 ° צ' עבור 15 דקות; חזור על שלב החלפת המאגר 2-3 פעמים. הוסף את התרומבין לחלבון (20 μL של 1 יחידה/μL) לפני דיאליזה כדי להסיר את ה-thioredoxin ואת התגית שלו.
- להעביר את החלבון לתוך שקית דיאליזה ו dialyze נגד 500 mL של מאגר דיאליזה (4 ° c) ב 500 mL בוגר גליל לילה.
הערה: Fplc (חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלי) המערכת ואת העמודה ניקל צריך להיות נקי ביסודיות עם מאגר להתפשט (2 M הנאל, 50 mM edta) לפני שתמשיך לטור החליפין אניון. כל ניקל שיורית בקווים FPLC תהפוך את פתרונות המאגר המכילים את החום DTT כאשר מעורבים. שטוף את עמודת הניקל ומערכת FPLC עם 4 כרכים של מים בעמודות. משאבה לשטוף את מערכת FPLC ביסודיות עם מים. את עמודת ניקל ניתן ליצור מחדש על ידי זורם 2 כרכים העמודה של 0.2 M ניקל סולפט מעל שרף עבור הפורימות הבאים.
- שינוי טרי ה-DNA פלמיד לתוך BL21 (DE3) החיידק של א. קולי לפי כיווני היצרן. צלחת חיידקים על LB אגר צלחות המכילות אמפיצילין.
- עבור העמודה החלפת הטור להכין 1 L של מאגר A (50 mM טריס pH 7.6, 5 מ"מ DTT, 5% גליצרול).
- להכין 0.5 L של מאגר B (50 mM טריס pH 7.6, 5 מ"מ DTT, 5% גליצרול, 1.25 M הנאל).
- באמצעות השפה a 30 mL החלפת טור עם מאגר A (3 כרכים עמודה, 2-5 mL/min). הניחו את הצינורות באספן השברים לאיסוף הזרימה.
הערה: פרוטאז VEEV יש נקודה איזואלקטריים מחושב (pI) של 8.7 ויהיה לאגד עמודות היון החליפין אבל יזרום באמצעות החלפת עמודות החליפין. ניתן לחשב את ה-pI מתוך רצף החלבונים באמצעות התוכנית של Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/). - לדלל את חלבון דיאליזה 1:3 עם מאגר A, ולאחר מכן לטעון את החלבון (5 מ"ל/min). לאסוף את הזרימה בתוך 10 מ"ל שברים.
- הסר את העמודה אניון exchange מהמערכת fplc. חבר עמודת החלפת קטיון למערכת FPLC. באמצעות שקופיות של 30 מ ל טורים בהחלפת הקטיון עם 3 כמויות עמודות של מאגר A (5 מ"ל/min).
- טען את הזרימה באמצעות עמודת החליפין של אניון אל עמודת חילופי הקטיון ב-2-5 mL/min. שטוף את העמודה באמצעות ' מאגר a ' עד שהפונקציה A280 תחזור לרמה הבסיסית. Elute חלבון עם 100 mL הדרגתי (0-50% מאגר B) ולאסוף 10 מ"ל שברים.
הערה: פרוטאז ה-VEEV ייוט בסביבות 0.6 מ ' הנאל. - בדוק את שברי העמודות באמצעות SDS-PAGE. לשלב שברים כי הם > 95% טהור ולהתרכז A A280 ≈ 2 באמצעות 15 mL ביחידות בעלי האולטרמגלית. האנזים יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c.
- טען את הזרימה באמצעות עמודת החליפין של אניון אל עמודת חילופי הקטיון ב-2-5 mL/min. שטוף את העמודה באמצעות ' מאגר a ' עד שהפונקציה A280 תחזור לרמה הבסיסית. Elute חלבון עם 100 mL הדרגתי (0-50% מאגר B) ולאסוף 10 מ"ל שברים.
4. לומר את האנזים ברציפות באמצעות קורא לוחית
- הכינו 50 מ ל של מאגר השיטת (50 מ"מ HEPES pH 7.0).
- כמו מגמות אלפא ויראליות יש יחסית נמוך בערכים kהחתול , לדלל את האנזים במאגר הקושי כדי 4.7 μm (זה יהיה בערך להתאים A280 = 0.2 על הפרוטאז Veev ללא trx).
- כדי למדוד את הפעילות של האנזים, להכין מלאי של מצע במאגר היכולת עם ריכוז של 185 μM; זה יהיה בערך להתאים A A280 = 9. ב 8 מיקרוצנטריפוגה צינורות, להכין את תערובות התגובה המוצגת בטבלה 2 על ידי שילוב של אמצעי האחסון המתאימים של 185 μm מלאי המצע ומאגר. בחצי אזור שחור 96-באר pipet 45 μL של התגובה mixes ל 3 בארות (עמודות 1, 2, 3). שורה A צריכה להכיל את המיקס [S] = 5 μM, ו-H Row צריך להכיל את [S] = 140 μM ערבוב התגובה.
- הגדר את קורא הצלחות כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית בו בשני אורכי גל עם הגדרה קבועה של צינור הפוטוסולייר (PMT) (למשל, נמוך):
גל 1 עירור = 434 nm, פליטה = 527 nm
גל 2 עירור = 434 nm, פליטה = 470 nm - הגדר את זמן הקריאה כ-20 דקות (מדידה 1 לקריאה בדקה) ובחר את הבארות לקריאה. הכנס את הצלחת לתוך הקורא לוחית למדוד את הקצב הספונטני של הידרוליזה עבור 20 דקות. נטר את יחסי הפליטה (פליטה ב 527/פליטה ב-470) עם הזמן.
- הפעל נקודת קצה שנקראה הלוח המכיל את המצע "לא מלוטש".
הערה: ערכים אלה ישמשו בחישובי נתונים עוקבים. הממוצע של יחסי הפליטה מ 3 בארות יהיו הערכים של המצע "נימולים" ב-t = 0 בטבלה 3. - הסר את הצלחת ואת pipet 5 μL של אנזים לתוך כל טוב. קרא את הלוחית שוב למשך 20 דקות עם 1 קריאה בדקה. הגדר את קורא הצלחות כך שייפלט ערכים מוחלטים.
הערה: לצורך שיטת הפעולה הזו, המדרונות יהיו שליליים. כל טוב יכיל נפח כולל של 50 μL. - בסוף הקריאה, לאטום את הצלחת עם הסרט כדי למנוע אידוי. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר לילה כדי לאפשר לאנזים לחתוך את המצע לחלוטין.
- לאחר ~ 24 h, הסר את הסרט איטום ובצע נקודת קצה לקרוא את הצלחת באמצעות אותו PMT כמו בלוחות הקודמים. ממוצע יחסי הפליטה והקלט לטבלה 3 תחת "גזור". לאשר את המחשוף של המצע באמצעות שיטת SDS-עמוד לא רציף המתואר להלן (שלב 5.1.).
- יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. פלט יחידות הזריחה בכל נקודה עבור 2 אורכי גל (שולחן 4).
- לחשב את nmol של מצע שנחתכו בזמן t באמצעות משוואה (1) שבו X הוא יחס הפליטה (527 ננומטר/470 ננומטר) בנקודת זמן נתונה, שלילי הוא יחס הפליטה של המצע "נימולים" ב-t = 0, ו- pos הוא יחס הפליטה של המצע "cut" לחלוטין נמדד לאחר 24 h של גזירה (שולחן
הערה: נתוני הנציגה הפלואורסצנטית מוצגים עבור אחד טוב (גם E7) המכיל 80 μM המצע (4 nmol של S לכל טוב) בטבלה 4. החישובים נערכו עבור כל טוב בצלחת. - עבור כל טוב, עלילה לעומת הזמן (דקות) ולהשיג את המהירויות הראשוניות (מדרונות) על ידי התאמת הנתונים y = mx + b. עבור הנתונים שנאספו ב 4.1.5, עלילה nmol לעומת זמן (דקות) עבור כל באר. השיפוע יהיה שווה למוצר הנמול המיוצר לדקה. הפחת את שיעורי ההידרוליזה הספונטניים הנמדדים ב4.1.5 משיעורי התגובה לזרז האנזימים (שולחן 5).
הערה: ניתן לחתוך את הקריאה הראשונה מהנתונים אם היא גבוהה ביותר עקב תנועת הצלחת לתוך קורא הלוחית. - לחשב את כמות האנזים ב-mg שנוספו לכל טוב (למשל, 0.0009 mg). יחידה מוגדרת כ-μm של מוצר המופק לדקה (μמול/דקות). לחלק את nmol/מינימום על ידי mg של אנזים נוכח בבאר כדי להשיג mU/mg; לחלק על ידי 1,000 כדי לקבל U/mg.
- מגרש [S] μM על ציר x ו-U/mg על ציר ה-y ולהתאים את הנתונים למשוואה מייקל-מנטה כדי להשיג Vmax ו-Km. ניתן לעשות זאת בתוכנה (למשל, GraFit).
5. לומר את האנזים ללא הפסקה באמצעות SDS-ניתוח עמודים
- הכנת תגובת 50 μL המכיל 10 המצע μM ומאגר במקום אנזים ותווית כמו "לא מלוטש."
הערה: אמצעי האחסון של המצע והמאגר מוצגים בטבלה 2. אם השימוש המתמשך הופעל, ניתן להשתמש בדגימות ישירות מלוחית 96.- להכין תגובה 50 μL המכיל 10 המצע μM ו 5 האנזים μL ותווית כמו "גזור". הפעל את שעון העצר כאשר האנזים נוסף למצע.
הערה: מעכבי ניתן להוסיף צינורות נוספים המכילים אנזים ומצע. כוונן את עוצמת הקול של מאגר נוסף כדי לפצות על נפח המעכב שנוסף. ריכוזי DMSO לא יעלה על 2%. - דגירה התגובות עבור ~ 15-24 h בטמפרטורת החדר (22 ± 3 ° c). להפסיק את התגובות על ידי הוספת 50 μL של מאגר 2x Laemelli. לאחר עצירת התגובה הרתיחה, כל צינור עבור 3-10 דקות.
- הכנס את מיכל הג בהתאם להנחיות היצרן. הכנס מקדמה של 17% היטב לפני שחקנים בקסטה של 12% פוליאקרילמיד וסכר מאגר בצד השני. מלא את מאגר הפנים של התא עם מאגר הפעלה של 1x SDS עד שהמאגר מגיע לראש הקלטת. מלא את המאגר החיצוני חצי מלא עם אותו מאגר.
- כדי לנתח את המחשוף באמצעות שימוש בלתי רציף, טען 5 μL של כל תערובת התגובה לנתיב של הג SDS-עמוד מתחיל עם התגובה "נימולים". כלול סמן משקל מולקולרי בנתיב הראשון או האחרון.
- לצרף את האלקטרודות של הטנק ג'ל לספק כוח ולהפריד את המוצרים ב 110 V עבור 60 דקות. להסיר את ג'ל מתוך הקלטת על ידי הוספת כלי פיצוח בין לוחיות. הניחו את הג במגש פלסטיק והשקיעו את הג ב-5-10 מ ל של פתרון הצביעת ג'ל; להקות יהיו גלויות בתוך 30 דקות. לאחר 1-24 שעות להסיר את הכתם עודף, להטביע את הג במים ולהשתמש באיג'ר ג'ל לצלם את הג.
- להכין תגובה 50 μL המכיל 10 המצע μM ו 5 האנזים μL ותווית כמו "גזור". הפעל את שעון העצר כאשר האנזים נוסף למצע.
6. עגינה פפטידים למצע VEEV-nsP2 Cysteine פרוטאז
- הורד את קובץ הקואורדינטות של ה-veev ציסטאין פרוטאז מ-PDB (https://www.rcsb.org/). . הקוד מספר 2 שבוע שמור את הקובץ כ-2H. pdb.
- הכן את מבנה החלבון באמצעות מו (https://www.chemcomp.com/). טען את קובץ ה-PDB בחלבון ל-מו. לחץ על בחירה והממס בצד ימין ליד הסרגל ולמחוק את הממס.
- פתחו את לוח ההכנה של המבנה מחלבוןשורת התפריטים העליון. לתקן באופן אוטומטי את כל הפריטים מבניים על ידי לחיצה על נכון protonate המבנה על ידי לחיצה על Protonate3D. הוסף חיובים חלקיים לחלבון על-ידי פתיחת לוח חיובים חלקיים ובחירה בענבר 99 והתאם הידרוגנים וזוגות בודדים לפי הצורך. לבסוף, שמור את קובץ המבנה כ-"2HWK_dock. pdb".
- לבנות את המבנה של פפטידים המצע (nsP12, nsP23, nsP34) ו TRIM14 באמצעות מו. פתחו את החלונית ' בונה חלבונים ', הזינו את רצף המצע, קבעו את הגיאומטריה כמורחבת ולחצו על ' בנה '. המבנה יוצג בחלון מו.
- מזער את מבנה פפטיד על ידי לחיצה על מזער בלוח. שמור את המבנה כקובץ PDB (איור 6).
- עגן את פפטידים המצע ל VEEV-nsP2 באמצעות PyRx/AutoDock 4.2 (http://autodock.scripps.edu/). פתח את הכלי PyRx, ערוך את הגדרת ההעדפה, הפעל את כל הטורסיות עבור Ligand הכנה. טענו את מולקולת המצע, לחצו לחיצה ימנית על שם המולקולה בחלונית ' ניווט ', בחרו ' הפוך לליגו'כדי להכין את קובץ העגינה. טען את החלבון 2HWK_clean. pdb, ובחר באפשרות ' בצע מקרומולקולה ' כדי להכין את קובץ העגינה pdbqt (איור 7).
- הפעל את אשף העיגון האוטומטי בלוח העגינה שבתחתית. בחר את קבצי הליפה והחלבון המוכנים. הגדר את כיס כריכת החלבון על ידי כוונון ידני של ממד הרשת אשר ממורכז בשאריות קטליטי Cys-477. שימוש בפרמטר הריווח המוגדר כברירת מחדל 0.375 Å. לחץ על הפעל רשת אוטומטית כדי ליצור מפות רשת.
- הפעל את האפשרות הפעלה אוטומטית ובחר בשיטת האלגוריתם הגנטי לאמארקקיאן (lga). לחץ על פרמטרי עגינה ולהגדיר את מספר ה-GA רץ 50. השתמש בפרמטרי ברירת המחדל עבור אחרים. לחץ על קדימה כדי להתחיל את הפעלת העגינה.
- פתחו את החלונית ' ניתוח תוצאות '. בדוק את כל תנוחות האיגוד החזוי. בחר את המודל הטוב ביותר עם האנרגיה הכריכה החזוי הנמוכה ביותר ואינטראקציות מחייבות סבירות בין Cys-477 ומצע באתר המחשוף. שמור את מודל האיגוד כקובץ PDB עבור סימולציות נוספות של MD.
7. MD סימולציות של מתחמי מעוגנים VEEV-מצע
- הכן את קבצי הקלט באמצעות ענבר (http://ambermd.org/). בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי, הדמיות MD מתבצעות עבור דגמי איגוד המצע החזוי באמצעות חבילת ה-AMBER והשדה ff99SB force.
הערה: מערכות מקבילות הם חשופים מזעור אנרגיה יסודית לפני סימולציות MD. תנאי גבול תקופתיים מוחלים על מנת לדמות מערכת רציפה. רשת החלקיקים שיטת אוואלד (PME) הועסק כדי לחשב את האינטראקציות האלקטרוסטטית לטווח ארוך. מערכת הסימולציה התחילה להיות בטמפרטורה הדרגתית להגדיל מ 0 K כדי 300 K מעל 100 ps, ולאחר מכן שיטה עבור 500 ps ב 300 K, ואחריו פועל הייצור של 2 ns אורך בסך הכל.- הפעל את משימת ההדמיה במתקן מחשוב בעל ביצועים גבוהים. הסימולציות שלנו הפועלות באשכול Biowulf (https://hpc.nih.gov/) (איור 8).
- המחש את פלט המסלול באמצעות תוכנית VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). לנתח את האינטראקציות הקשירה ולשנות את השינויים הTRIM14 בתוך האתר הפעיל של nsP2 (איור 9).
Representative Results
SSHHPS ניתוח של ZIKV ns2B/3 פרוטאז מזוהה 4 מטרות חלבון מארח: FOXG1, SFRP1, יחידת משנהאלפא של G מספריית cdna רשתית, ואת מיטוכונדריאל NT5M 5 ', 3 '-nucleotidase (איור 10)6. בעיקר, אין שיטה אחרת ניבא חלבונים אלה כמטרות פוטנציאליות של פרוטאז ZIKV. מוטציות בגן FOXG1 קושרו לתסמונת מולדת המאופיינת על ידי פיתוח לקוי וחריגות המוח מבניים כגון microcephaly. SFRP1 הוא חלבון מופרש הקשור ביניהם (SFRP); אלה קולטנים מסיסים יכולים לאגד בתחרותי Wnt ליגנדס להרגיז ולעכב איתות Wnt. מסלול ה-Wnt איתות מעורב בוויסות התגובה IFN במהלך זיהום36Flavivirus. המחשוף של SFRP1 צפוי לשפר את שכפול וירוס flavivirus. SFRP1 מעורב גם ב Th17-cell בידול37. מערכים הרצף של SSHHPS הראו הבדלים ספציפיים למינים בתוך רצפי האתר מחשוף (איור 10ד). רצף המחשוף בSFRP1 היה זהה בבני אדם ותרנגולות; ZIKV יכול לגרום לתמותה ו microcephaly ב העוברים עוף38. ב מכרסמים, שאריות P1 מאוד שמרו (K/R) R ↓ G הוא הוחלף על ידי גליצין (RGG). זנים אימונומוסמכים של עכברים עמידים בדרך כלל כדי זיהום ZIKV ומחלות39.
יציב המצב הקינטי פרמטרים וקבועים עיכוב ניתן למדוד עבור רצפי פוליפרוטאין נגיפי ועבור רצפי חלבון מארח באמצעות הסדר הרציף בקורא לוחית31,40,41 (איור 11א). למידע על מחשוף איכותי, כגון מחשוף של רצף מסוים או עיכוב של הפרוטאז באמצעות תרכובות שונות, ניתן להשתמש באופן שאינו רציף (איור 11ב).
אופטימיזציה של מספר שאריות בין CFP ו-YFP עשוי להידרש. ניתן לעשות מודל מאוגד מצע באמצעות שיטות סיליקו. מודל מעוגן נציג של צומת nsP1/nsP2 מוצג באיור 9. עבור הפרוטאז VEEV nsP2, המחשוף של 12-אמינו חומצה היער הנגיף (SFV) רצף דווח (Km = 0.58 mM)33. הארכת רצף המצע ל-19, 22, ו -25 שאריות והפחתת החוזק היוני של המאגר הובילה לירידה משמעותית ב-Km. בחינת מבנה הגביש VEEV nsP2 ואריזת הגביש גם הראה שחלק מאחת הצמתים היה ארוז נגד התחום פרוטאז והיה helical. כך, מצעים VEEV ארוך יותר עשויים לאגד טוב יותר בשל הכרה של מוטיב מבניים משני.
עבור TRIM14, הצלחנו Km = 21 μm6,33. Km עבור מצע הנושאת את רצף החלבון המארח היה דומה לערכי Km של מצעים המכילים את המחשוף polyprotein מחשוף האתר (Km(רובוטית v12) = 12 μm ו-Km(V34) = 21 μm). רצפי אתר המחשוף בצמתים nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 ו-nsP3/nsP4 נחתכו ביעילות שונה. בתא, זה נחשב לאפשר מחשוף סדרתי של polyprotein42.
יש לנקוט זהירות בפענוח תוצאות שליליות. אם לא מתרחשת מחשוף, אתר המחשוף עשוי להיות קצר מדי או פרוטאז מטוהר יכול להיות פעיל. עבור מצעים מנותקים, ניסויים נוספים נחוצים כדי לאשר את המחשוף של חלבון אורך מלא או מחשוף בתאים נגועים בווירוס. יש לבחור ניסויים מתאימים למעקב. ניתן לבדוק את ההשפעות של ביטוי יתר או השתקה של חלבון היעד על שכפול נגיפי.
איור 1: שלושה מנגנונים של השתקה. השתקה יכולה להתרחש ברמה של DNA, RNA או חלבון. אלגוריתמים אלה "חיפוש ומחיקה" משתמשים במילת "מילת מפתח" כדי לכוון את המחשוף של קובץ המכיל את המילה. דמות זו השתנתה ממוריאני ואח '32 וההפניות בו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הבדלים ספציפיים למינים בתוך מחשוף ברצפי האתרים. קבוצות המחשבים של TRIM14 homologues מופיעות ביישור. ניתן לזהות את קבוצת המחשבים ' חטט/SPRY ' על-ידי המוטיבים המושמרו המסומנים באפור. האדם TRIM14 הוא נחתך ב q, ↓ G על ידי veev nsP2 ציסטאין פרוטאז. הרצף של SSHHP מוצג בצבע. השאריות הירוקות הן השאריות של P1; בכחול הוא שאריות P4, ו באדום הם שאריות שמרו אחרים בתוך המחשוף מוטיב האתר. הנמל של הסוס גרסה קטומה של TRIM14 חסר את התחום חטט/SPRY. הלויזין המסומן בציאן הוא פולי-אוביקוויל, והוא חשוב להרכבת השלטים המאסיביים. תחום ה-C-terminal לפריצה/SPRY עשוי להיחתך בחריפות על ידי nsP2 פרוטאז כדי לפגוע בתגובה האנטי-ויראלית של המארח intracellularly במהלך זיהום נגיפי חריף. בסוסים, תחום זה תמיד נעדר. זה מרמז כי התחום לחטט/SPRY של TRIM14 עשוי להיות פונקציה מגן נגד זיהומים VEEV. הדמות הזאת שוחזר ממורעזאני ואח '6אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי SSHHPS באמצעות הפיצוץ. המחשוף באתר מוטיב רצף בצומת VEEV nsP1/nsP2 מיושר עם סדרת SSHHP ב חלבון מארח TRIM14. השאריות הצבועות בירוק הוא שארית ה-P1; בכחול הוא שאריות P4 ו אדום הם שאריות שמרו אחרים של המחשוף באתר מוטיב. רוב המערכים הכילו הומולוגיה לאזורים מחוץ למוטיב החיצוני של מוטיב המחשוף או לא כללו את שאריות הקשר של P1/P1 scissile. TRIM14 הראה התאמה 6 שאריות בסדר רציפים שכללו P1 ו P1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: החלבון ורצפי ה-DNA של המצע CFP-רובוטית v12-yfp ל-veev nsP2 ציסטאין פרוטאז. אתרי ההגבלה של NdeI (CATATG) ו-XhoI (CTCGAG) מוצגים באותיות רישיות. באדום הוא רצף באתר המחשוף של polyprotein הנגיפי כי הוא בין nsP1 ו nsP2. שאריות ירוק הוא שאריות P1 ו בכחול הוא שאריות P4 של אתר המחשוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: רצף החלבונים של מבנה פרוטאז של trx-veev-nsP2 ציסטאין. Thioredoxin (Trx) מוצג בצהוב. אתר המחשוף של התרומבין והתג שלו מוצגים בציאן. משפחת מק-הדיקן שלו. מתויג באדום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מבנים פפטיד ב-מו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: עגינה של מצע פפטיד באמצעות PyRx/AutoDock. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: משימות הפועלות באשכול Biowulf. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: מודל של המצע VEEV P12 המכיל את רצף האתר מחשוף בצומת nsP1/nsP2. Cys-477/שלו-546 לדיאד קטליטי מוצג בכחול. הדמות נעשתה באמצעות פימול (https://pymol.org). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: ניתוח SSHHPS של וירוס Zika ns2B/ns3 פרוטאז. (א) החזוי מטרות חלבון מארח של Zikv ns2B/ns3 פרוטאז. שאריות באדום מתאימים. לרצף מחשוף אחד שאריות בירוק נסבלים באתר המשנה ומתאימים לשקעים באתרי מחשוף אחרים. SFRP1 היה המספר הגבוה ביותר של שאריות זהים בסדר רציף. (ב) CFP-מצע-yfp חלבונים (~ 50-60 kda) הביעו ומטוהרים המכיל את רצף SSHHP החזוי מכל חלבון מארח (אנושי). פרוטאז ZIKV לחתוך האדם FOXG1, SFRP1, NT5M ויחידת המשנה Gsאלפא מבודד מספריית cdna רשתית. מוצרי המחשוף הם כ 28-30 kDa. רצפי המצע זמינים ב morazzani ואח '6 (ג) בעוד ns2B הns3 פרוטאז לחתוך SFRP1, זה לא לגזור homologues שלה (SFRP2 ו SFRP4). (ד) היישור של אתרי המחשוף ממינים שונים של בעלי חיים עשוי להועיל בבחירת דגם בעל חיים עבור וירוס הרביעי של הקבוצה. שים לב כי הרצף שמור R ↓ G שונה בין בני אדם ומכרסמים ב SFRP1. איור ששוחזר ממוריאני ואח '6אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: המצב יציב קינטי ניתוח באמצעות assays רציף מתמשך. (א) הנתונים הקינטית המוצגים בטבלה 5 הותוו ב-grafit. הכניסה מראה את העלילה. של לינויבר-בורק (ב) sds-ג'ל עמוד מציג את מוצרי המחשוף של המצע CFP-רובוטית v12-yfp. במשעול 1 הוא המצע "נימול" (48 kDa). במשעול 2 הוא "גזור" מצע (31 kDa ו -27 kDa). בנתיבים 3-9 תרכובות שונות נכללו כדי לבדוק את פעילות העכבות שלהם. ליין 4 מכיל את המעכב. הE64d קוולנטי התגובות הללו התבצעה במשך. הלילה בטמפרטורת החדר הרתיחה של הדגימות היה נדרש כדי להשיג את הדפוס פסים חדים. NsP2 פרוטאז הוא גלוי (56 kDa) בתגובות המכילות אנזים, אבל לא במסלול 1. . ליין 1 "זה בקרת" ללא אנזים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
השמדה ספציפית לרצף של חלבון או חומצת גרעין המודרכת על-ידי רצף זר מראה רק במקרים ספורים בביולוגיה. המנגנונים המוצגים באיור 1 הם מנגנוני הגנה המגנים על המחשב המארח מפני וירוס, או וירוס ממחשב מארח.
שימוש בשיטות ביוטיות ניתן לזהות את המטרות הושמדו על-ידי מערכות אלה. בניתוח שלנו של רצפי SSHHP, גילינו כי רבים מהם ניתן למצוא חלבונים הדרושים כדי ליצור תגובות החיסונית מולדים. חלקם היו תפקידים ברורים כגון mavs ו-trif (טיר-domain-מכיל מתאם אינטרפרון-β), בעוד אחרים היו קשורים לחסינות אף מנגנונים מורכבים יותר (למשל, histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. למידע היעד המאוחסן ברצף SSHHP יש את הפוטנציאל לזהות מסלולים בעלי אפקטים אנטי-ויראליות נגד וירוסים אלה. תגובות אנטי ויראליות ב vivo הם לעתים קרובות לוירוסים מסוימים26,43. לדוגמה, קבוצות מערכות של חלבונים לקצץ יש השפעות אנטי ויראליות על וירוסים שונים43,44,45, כמה הם גורמי הגבלה נגיפית (למשל, HIV ו TRIM5α). הספציפיות של חלבונים לקצץ (~ 70 זוהו) עדיין נבדק44,45. המידע בתוך SSHHPS עשוי לתרום להבנת האופן שבו וירוסים אלה להתחמק תגובות החיסונית מולדים. דפוסים אחרים וקשרי גומלין עלולים להיות נחשפים כמו SSHHPS יותר נבדקים.
הבדלים ספציפיים למינים התבררו בניתוח שלנו (איור 2, איור 10). וירוסים אלה ידועים להשפיע על מינים מסוימים יותר מאשר אחרים. מידע אודות טווח המארח, הרגישות המארחת וההגנות המארחות עשויים להופיע בתוך SSHHPS. לדוגמה, סוסים, המינים הרגישים ביותר לווירוסים דלקת קרום המוח של הסוסים, חסר באזור TRIM14 אנושי שנחתך ברובו על-ידי ה-VEEV nsP2 פרוטאז. בני אדם לעתים נדירות למות מזיהומים VEEV אבל יכול להיות נגוע24. חלבון TRIM14 האנושי נשא מחשוף nsP2 פרוטאז רצף6. הנוכחות של אתר המחשוף מראים כי בני אדם יש מנגנון הגנה נגד וירוסים אלה. ציפורים כבר חשבו להיות מאגרים פוטנציאליים של וירוסים אלה46. רצף SSHHP המקביל בחלבון TRIM14 מתרנגולות שונה מהרצפים שנמצאו בבני אדם ובמינים אחרים. הבדלים עדינים כמו אלה עשויים להפוך חלבון מארח היעד בלתי ניתן לביטול או מאפשר בקלות רבה יותר. אגירי ואח '16 הראה כי מוטציה בלתי מעשית חלבון מחרוזת הנגרמת רמות גבוהות יותר של ifn לאחר זיהום וירוס דנגה, כי עכברים באופן טבעי לשאת גרסה של סטינג כי הוא לא נחתך על ידי Ns2B3 פרוטאז דנגה. חלבון מורטין העוקץ לא נחתך על ידי ZIKV פרוטאז47. בניתוח SSHHPS שלנו, ראינו גם הבדלים של המחשוף ZIKV פרוטאז האתר כאשר השוונו את החלבונים האנושיים עם אלה של מכרסמים6 (איור 10ד). לשחזר את המינים ספציפיים מסוג החיידקים האנטי-חרדה של חלבונים מארחים עשוי להיות חשוב במודלים של חיות המשמשות לווירוסים Group IV. עיכוב של מחשוף חלבון מארח יש גם השלכות בנוגע לפיתוח של מעכבי הקבוצה IV פרוטאז. בפרסום הקודם שלנו, הראנו שאנחנו יכולים לעכב את TRIM14 המחשוף על ידי nsP2 פרוטאז של VEEV באמצעות CA074 מתיל אסתר6. תוצאה זו עולה כי מולקולה קטנה מעכבי של פרוטסים אלה עשויים להיות מסוגלים לווסת את התגובות החיסונית מולדים כי הם מסוגלים לדכא את הזיהום6,31.
וריאציה גנטית בתוך מינים יש גם את הפוטנציאל לייצר הבדלים במחשוף הפרוטחרדה. הבדלים עדינים בשימוש קודון יכול להשפיע על ריבוכמה משהה48. מאז כמה הקבוצה הרביעית הפרוטזיות נגיפי מוטבע קרום ER, הבדלים אלה הפסקות יכול להשפיע על המחשוף של היעד אם המחשוף מתרחשת שיתוף בצורה מבצעית. חלק מאתרי המחשוף שזיהינו היו ברצפי פפטיד אותות (למשל, SFRP1) בעוד שאחרים היו פנימיים.
ניתוח SSHHPS יכול להפיק מידע השונה משיטות אחרות של ניתוחי חלבון מארחים. הניתוח SSHHPS היה זול וקל להעסיק. השימוש במערכת ביטויים חיידקית מאפשר בדיקה של קטעים קצרים (~ 25 חומצות אמינו) של רצפי יונקים ללא שימוש בתרבות התא של היונקים. מצאנו כי מצעים CFP YFP היו מסוגלים לסבול את כל רצפי החלבונים האנושיים נבדק; עם זאת, תשואות מגוונות. ב assays דומה, מצעים המכילים את רצפי החלבון האנושי כל עוד 63 חומצות אמינו הביעו בהצלחה, מטוהרים, ומנוצל עבור ניתוחים קינטי ו מעכבי ההקרנה49,50,51. מאחר שרק כמויות קטנות של המצע נדרשות לצורך הצורך המתמשך, ניתן לחקור מספר רב של מטרות. אחד היתרונות של המערכת היא כי מצעים CFP/YFP ניתן להשתמש עבור SDS-דף ניתוחים ועבור ניתוחים קינטי מורכבים יותר (כלומר, IC50, ki, km, Vמקסימום). לגילוי סמים, תרכובות מעכבות יכולות לייצר פריטים בערוץ הפלורסנט. לפיכך, היכולת המתמדת בשילוב עם שיטת מתמשך מאפשרת לאדם לאשר מחשוף או עיכוב במחשוף. ניתן לקחת את הדגימות של שיטת ה-SDS-PAGE הרציפה ישירות מתוך הצלחות 96-היטב. CFP/YFP מצעים שימשו לסינון ספריה מורכבת52. עם זאת, ניתוחים נוספים נדרשים כדי לקבוע אם מצע מתאים להקרנה בתפוקה גבוהה כגון חישוב Z-factor53.
אתגר אחד בעיצוב מצע מזהה את האזור סביב הקשר scissile כי הוא מאוגד ומזוהה על ידי פרוטאז. בדוגמאות שמוצגות כאן, התחלנו עם 12 רצפי שאריות שהיו ממורכזים סביב הקשר הscissile. לאחר ניתוח של מערכים רצף של אתרי המחשוף הומולוגיה לשקעים N-טרמינל של איגרת החוב הscissile נמצא עבור פרוטאז VEEV, ואילו עבור פרוטאז ZIKV הומולוגיה לכמה שאריות C-terminal נמצאה. במודל סיליקו של המצע העוגן ניתן להשתמש כדי לעצב ניסויים מוטארזיס בבימויו של האתר החוקרים את האתרים המחייבים של המצע. מאז המצע ורצפי אנזימים הם על פלמידים, או יכול להיות מוטציה כדי לבדוק את המודלים סיליקו או מאתר המשנה טולרנסים. הדבר עשוי להיות יתרון אם מבנה גביש של המצע (ים) המאוגד אינו זמין.
ניתוח SSHHPS עשוי גם להניב מידע חדש על המנגנונים שבהם פנוטיפים המושרה על ידי וירוסים מיוצרים על ידי אנזימים ויראליים. אחד היעדים zikv, SFRP1, הוא חלק של wnt איתות מסלול ויש לו תפקידים הן במוח והן בפיתוח העין ואת התגובות החיסונית36,37,54,55,56,57. מצאנו כי רצפי החלבון האחרים שניתן לגזור על ידי ZIKV ns2B/ns3 פרוטאז היו גם חלבונים מעורבים המוח ופיתוח העין; חריגות בשניהם נצפו בתסמונת Zika מולדים נחשבים לחלק הווירוס המושרה פנוטיפ58.
ניתן לנצל את החיזוי של אינטראקציות מארח-פתוגן למגוון יישומים: טיפולים ויראליים ספציפיים למטרה; דה-סיכון חיסונים וירוס חיים; עידון, חיזוי או מבחר של דגמי בעלי חיים; חיזוי של שורה לטווח או רגישות; חיזוי אירועים zoonotic; וחיזוי ההגנות המארחות. מאחר שהשיטות המתוארות הן מבוססות רצף, הן עשויות להיות בעלי ערך שיכללו בעתיד.
Disclosures
הדעות שהוביעו כאן הן אלה של המחברים ואינן מייצגות את אלה של חיל הים האמריקאי, צבא ארה ב, משרד ההגנה של ארה ב, או ממשלת ארה ב.
Acknowledgments
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הסוכנות להפחתת איום הביטחון (DTRA) מספרי הפרויקט CB-SEED-SEED09-2-0061 ו CBCall4-CBM-05-2-0019, ובחלקו על ידי התוכנית הפנים/מחקר אקסטרקיר של NCATS, NIH (XH) ו מחקר הצי בסיס קרנות מעבדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
| 2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
| 4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
| AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
| AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
| Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
| Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
| Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
| Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
| Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| DNAse | Sigma | DN25-1G | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
| Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
| IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
| Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
| Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
| Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
| Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher | ||
| New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
| Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
| pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
| Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
| Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
| Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
| RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
| RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
| RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
| Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
| Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
| SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |
References
- Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
- Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
- Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
- Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
- Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
- Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
- Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
- Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
- Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
- Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
- Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
- Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
- Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
- Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
- Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
- Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934 (2012).
- Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
- Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
- Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
- Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
- Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
- Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
- Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
- Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
- Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
- Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894 (2009).
- Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
- Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
- Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
- Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
- Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
- Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
- Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
- Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
- Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
- Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
- Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
- Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
- Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
- Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16 (2008).
- Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
- van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
- Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347 (2016).
- Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
- Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
- Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
- Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
- Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
- Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
- Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
- Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
- Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
- Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).
