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Immunology and Infection

इन विट्रो और सिलिको विधियों का उपयोग करके समूह चतुर्थ वायरल एसएचएचपीएस का विश्लेषण

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60421
Automatic Translation
1, 2, 2
1National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, 2United States Naval Research Laboratory

Summary

हम वायरल पॉलीप्रोटीन में एम्बेडेड समरूप मेजबान-रोगजनक प्रोटीन दृश्यों (एसएचएचपीएस) के छोटे हिस्सों की पहचान करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल पेश करते हैं। SSHHPS वायरल proteases द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है और कई समूह चतुर्थ वायरस द्वारा विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के लक्षित विनाश प्रत्यक्ष ।

Abstract

अल्फावायरल एंजाइमों को एक पॉलीपेप्टाइड में संश्लेषित किया जाता है। गैर संरचनात्मक पॉलीप्रोटीन (एनएसपी) को वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक सक्रिय एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए अपने nsP2 साइस्टीन प्रोटीज द्वारा संसाधित किया जाता है। वायरल प्रोटीज़ अत्यधिक विशिष्ट हैं और संरक्षित दरार साइट आकृति दृश्यों (~ 6-8 अमीनो एसिड) को पहचानते हैं। कई ग्रुप IV वायरस में, एनएसपी प्रोटीज (एस) क्लीवेज साइट आकृति दृश्यों को विशिष्ट मेजबान प्रोटीन में पाया जा सकता है जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने में शामिल होते हैं और कुछ मामलों में, लक्षित प्रोटीन वायरस-प्रेरित फेनोटाइप से जुड़े होते दिखाई देते हैं। ये वायरस मेजबान प्रोटीन के लक्षित विनाश के लिए समरूप मेजबान-रोगजनक प्रोटीन दृश्यों (SSHHPS) के छोटे हिस्सों का उपयोग करते हैं। SSHHPS की पहचान करने के लिए वायरल प्रोटीज़ दरार साइट आकृति दृश्यों विस्फोट में इनपुट किया जा सकता है और मेजबान जीनोम (एस) खोजा जा सकता है । दरार शुरू में शुद्ध nsP वायरल प्रोटीज़ और फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) ई. कोलाईमें किए गए सब्सट्रेट्स का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है । FRET सब्सट्रेट्स में सियान और येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन और क्लीवेज साइट सीक्वेंस (सीएफपी-सीक्वेंस-वाईएफपी) होते हैं। इस प्रोटीज़ परख का उपयोग प्लेट रीडर में या एसडी-पेज जैल में लगातार किया जा सकता है। सब्सट्रेट चयन और म्यूटाजेनेसिस अध्ययन ों का मार्गदर्शन करने के लिए सिलिको में बाउंड पेप्टाइड सब्सट्रेट्स के मॉडल उत्पन्न किए जा सकते हैं। प्रोटीज़ अवरोधकों की पहचान करने के लिए सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स का भी उपयोग किया गया है । इन इन विट्रो और सिलिको तरीकों में सेल आधारित परखके साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए अगर लक्षित मेजबान प्रोटीन वायरल प्रतिकृति को प्रभावित करता है ।

Introduction

वायरस से मेजबान, या वायरस की मेजबानी के लिए क्षैतिज जीन हस्तांतरण के सबूत,जीनोम कीएक किस्म में पाया जा सकता है1,2,3,4। वायरल एंडोजेनाइजेशन के उदाहरण बैक्टीरियल होस्ट जीनोम4में पाए जाने वाले CRISPR स्पेसर सीक्वेंस हैं । हाल ही में, हमें मेजबान प्रोटीन दृश्यों के सबूत मिले हैं जो (+) ssRNA समूह IV वायरस के गैर संरचनात्मक पॉलीप्रोटीन में एम्बेडेड हैं। वायरल जीनोम के कोडिंग क्षेत्रों के भीतर इन दृश्यों को पीढ़ी-पीढ़ी प्रचारित किया जा सकता है। इस वायरस और मेजबान5,6में समरूप मेजबान-रोगजनक प्रोटीन दृश्यों (एसएचएचपीएस) के छोटे हिस्सपाए जाते हैं । SSHHPS संरक्षित दरार साइट आकृति दृश्यों वायरल proteases कि विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के लिए homology है द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । ये दृश्य विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के विनाश को निर्देशित करते हैं।

हमारे पिछले प्रकाशन6में, हमने उन सभी मेजबान प्रोटीनों की एक सूची संकलित की जिन्हें वायरल प्रोटीज़ द्वारा लक्षित किया गया था और पाया गया कि लक्ष्यों की सूची गैर-यादृच्छिक(तालिका 1)थी। दो रुझान स्पष्ट थे । सबसे पहले, वायरल प्रोटीज़ के बहुमत है कि मेजबान प्रोटीन में कटौती समूह चतुर्थ वायरस के थे (25 मामलों में से 24 समूह चतुर्थ वायरल proteases शामिल है), और एक प्रोटीज़ (+) ssRNA समूह छठी रेट्रोवायरस (एचआईवी, मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस)7के थे । दूसरा, मेजबान प्रोटीन लक्ष्य वायरल proteases द्वारा काटा जा रहा है आम तौर पर सहज प्रतिरक्षा सुझाव है कि दरार मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं विरोधी करने का इरादा थे पैदा करने में शामिल थे । वायरल प्रोटीज़ द्वारा लक्षित मेजबान प्रोटीन का आधा सिग्नलिंग कैस्केड के घटक ों को जाना जाता था जो इंटरफेरॉन (आईएफएन) और भड़काऊ साइटोकिन्स(तालिका 1)उत्पन्न करते थे। अन्य लोग मेजबान सेल ट्रांसक्रिप्शन8,9,10 या अनुवाद11में शामिल थे । दिलचस्प बात यहहै कि श्माकोव एट अल 4 ने दिखाया है कि कई CRISPR प्रोटोस्पेसर दृश्य प्लाज्मिड कंजुगन या प्रतिकृति4में शामिल जीन के अनुरूप हैं।

ग्रुप IV में अन्य लोगों के अलावा, फ्लेविरिडी, पिकोरनेविडी, कोरोनाविडी, कैल्सिविरिडी और टोगाविरिडीशामिल हैं। कई नए और उभरते रोगजनक जीका वायरस (जीकेकेवी), वेस्ट नील (WNV), चिकनगुनिया (चिकेवी), गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम वायरस (सार्स) और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम वायरस (मर्स) जैसे ग्रुप IV के हैं । (+) ssRNA जीनोम अनिवार्य रूप से mRNA का एक टुकड़ा है । जीनोम प्रतिकृति के लिए आवश्यक एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए, (+) ssRNA जीनोम पहले अनुवाद किया जाना चाहिए । अल्फावायरस और अन्य समूह चतुर्थ वायरस में, प्रतिकृति के लिए आवश्यक एंजाइमों का उत्पादन एक पॉलीप्रोटीन (यानी, वीईवी के लिए nsP1234) में किया जाता है। एनएसपी 2 प्रोटीज द्वारा सक्रिय एंजाइम12 (चित्रा 1)का उत्पादन करने के लिए गैर संरचनात्मक पॉलीप्रोटीन (एनएसपी) को प्रोटेओलिटिक प्रोसेस (एनएसपी1234 एनएसपी1, एनएसपी2, एनएसपी3, एनएसपी4) द्वारा संसाधित किया जाता है । एनएसपी2 प्रोटीज़ द्वारा पॉलीप्रोटीन का दरार वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक है; यह nsP2 प्रोटीज13,14के सक्रिय साइट साइस्टीन के हटाने और साइट निर्देशित म्यूटेजेनेसिस द्वारा प्रदर्शन किया गया है . विशेष रूप से, वायरल प्रोटीन का अनुवाद जीनोम प्रतिकृति घटनाओं से पहले होता है। उदाहरण के लिए, nsP4 में आरएनए-निर्भर आरएनए बहुलक (+) ssRNA जीनोम को दोहराने के लिए आवश्यक है। जीनोम प्रतिकृति dsRNA मध्यवर्ती का उत्पादन कर सकते हैं; ये मध्यवर्ती मेजबान की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकते हैं। इस प्रकार, ये वायरस अपने प्रभावों को दबाने के लिए संक्रमण की शुरुआत में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन की मेजबानी कर सकते हैं15,16,17।

मुंह में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर हो सकता है। क्या चित्रा 1 में दिखाया मुंह बंद तंत्र में से प्रत्येक के लिए आम है कि कम विदेशी डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन दृश्यों विशिष्ट लक्ष्यों के विनाश का मार्गदर्शन करने के लिए अपने समारोह विरोधी उपयोग कर रहे हैं । मुंह बंद तंत्र तीन अलग-अलग भाषाओं में लिखे गए कार्यक्रमों को "खोज और हटाने" के अनुरूप हैं। लघु दरार साइट अनुक्रम "कीवर्ड" के अनुरूप है। प्रत्येक कार्यक्रम में एक एंजाइम होता है जो छोटे अनुक्रम ("कीवर्ड") के बीच मैच को पहचानता है और "फ़ाइल" में एक शब्द जिसे हटाया जाना है। एक बार मैच मिलने के बाद, एंजाइम बड़ा लक्ष्य अनुक्रम ("हटाता है") काटता है। चित्रा 1 में दिखाए गए तीन तंत्र ों का उपयोग वायरस से मेजबान की रक्षा करने या मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली से वायरस की रक्षा के लिए किया जाता है।

वायरल प्रोटीज़ ~ 2-11 अमीनो एसिड के बीच लघु दरार साइट आकृति दृश्यों को पहचानते हैं; न्यूक्लियोटाइड्स में, यह 6-33 ठिकानों के अनुरूप होगा। तुलना के लिए, CRISPR स्पेसर दृश्य ~ 26-72 न्यूक्लियोटाइड्स हैं और आरएनएआई ~ 20-22 न्यूक्लियोटाइड्स18,19हैं। जबकि ये दृश्य अपेक्षाकृत कम हैं, उन्हें विशेष रूप से पहचाना जा सकता है। अमीनो एसिड की उच्च विविधता को देखते हुए, एक यादृच्छिक दरार घटना की संभावना 6-8 अमीनो एसिड या उससे अधिक समय के प्रोटीन दृश्यों को पहचानने वाले वायरल प्रोटीज़ के लिए अपेक्षाकृत कम है। मेजबान प्रोटीन में SSHHPS की भविष्यवाणी काफी हद तक वायरल प्रोटीज की विशिष्टता पर निर्भर करेगा की जांच की जा रही है । यदि प्रोटीज़ सख्त अनुक्रम विशिष्टता आवश्यकताओं है एक दरार साइट अनुक्रम खोजने का मौका 1/206 = 1 में 64 मिलियन या 1/208 = 1 में 25.6 अरब है; हालांकि, अधिकांश प्रोटीज़ में परिवर्तनीय उपसाइट सहिष्णुता होती है (उदाहरण के लिए, आर या के को S1 साइट पर सहन किया जा सकता है)। नतीजतन, मेजबान बनाम वायरस में पाए जाने वाले दृश्यों के बीच अनुक्रम पहचान के लिए कोई आवश्यकता नहीं है। वायरल प्रोटीज़ के लिए जिनमें लूजर अनुक्रम आवश्यकताएं हैं (जैसे पिकोरनेविडी से संबंधित) एक मेजबान प्रोटीन में दरार साइट खोजने की संभावना अधिक हो सकती है। तालिका 1 में प्रविष्टियों में से कई पिकोरनेविडे परिवार से हैं ।

Schechter और बर्जर नोटेशन20 आमतौर पर एक प्रोटीज़ सब्सट्रेट और उपसाइटों में अवशेषों का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसके लिए वे बांधते हैं, हम इस नोटेशन का उपयोग करते हैं। सब्सट्रेट में अवशेष जो कैंची बांड के एन-टर्मिनल हैं, को P3-P2-P1 के रूप में चिह्नित किया गया है जबकि जो सी-टर्मिनल हैं, उन्हें P1'-P2'-P3 ' के रूप में चिह्नित किया गया है। इन अमीनो एसिड अवशेषों को बांधने वाले प्रोटीज़ में संबंधित उपसाइटक्रमशः S3-S2-S1 और S1'-S2'-S3 ' हैं।

यह निर्धारित करने के लिए कि किस मेजबान प्रोटीन को लक्षित किया जा रहा है, हम वायरल पॉलीप्रोटीन क्लीवेज साइटों में एसएसएचपीएस की पहचान कर सकते हैं और उनमें शामिल मेजबान प्रोटीन की खोज कर सकते हैं। इसके साथ, हम ज्ञात वायरल प्रोटीज़ दरार साइट दृश्यों का उपयोग करएसएस की पहचान करने के लिए प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार करते हैं। जैव सूचना के तरीकों, प्रोटीज़ परख, और सिलिको तरीकों में वर्णित सेल आधारित परख के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना है ।

वायरल प्रोटीज़ द्वारा लक्षित मेजबान प्रोटीन के अनुक्रम संरेखण इन लघु दरार साइट दृश्यों के भीतर प्रजातियों-विशिष्ट मतभेदों का पता चला है । उदाहरण के लिए, वेनेजुएला के घोड़े इंसेफेलाइटिस वायरस (VEEV) nsP2 प्रोटीज़ मानव TRIM14, एक त्रिपक्षीय आकृति (TRIM) प्रोटीन6में कटौती करने के लिए पाया गया था । कुछ ट्रिम प्रोटीन वायरल प्रतिबंध कारक हैं (उदाहरण के लिए, TRIM5α21),अधिकांश को सर्वव्यापी E3 लिगैस माना जाता है। TRIM14 एक अंगूठी (वास्तव में दिलचस्प नए जीन) डोमेन का अभाव है और एक E3 ligase22नहीं सोचा है । TRIM14 को माइटोकॉन्ड्रियल एंटीवायरल सिग्नलोसोम (एमएवीएस)22में एडाप्टर बनने का प्रस्ताव किया गया है, लेकिन अन्य एंटीवायरल कार्य हो सकते हैं23। विभिन्न प्रजातियों से TRIM14 दृश्यों के संरेखण से पता चलता है कि घोड़े दरार साइट की कमी है और TRIM14 के एक छोटा संस्करण है कि सी टर्मिनल PRY/SPRY डोमेन याद आ रही है बंदरगाह । इस डोमेन में एक पॉलीयूब्किशन साइट(चित्रा 2)शामिल है। घोड़े में, ये वायरस अत्यधिक घातक (~ 20-80% मृत्यु दर) हैं जबकि मनुष्यों में केवल ~ 1% वीईवी संक्रमण24से मरते हैं। PRY/SPRY डोमेन के दरार क्षणिक रूप से शॉर्ट सर्किट MAVS संकेत झरना हो सकता है । यह झरना dsRNA द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है और इंटरफेरॉन और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन की ओर जाता है। इस प्रकार, SSHHPS की उपस्थिति यह भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी हो सकती है कि किस प्रजाति में विशिष्ट समूह चतुर्थ वायरस के खिलाफ रक्षा प्रणाली है।

समूह चतुर्थ वायरस में, IFN विरोध तंत्र बेमानी25गुणा माना जाता है । मेजबान प्रोटीन दरार संक्रमण के दौरान क्षणिक हो सकता है और समय के साथ सांद्रता ठीक हो सकती है। हमने कोशिकाओं में पाया कि TRIM14 दरार उत्पादों को एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग (साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर) के साथ ट्रांसफेक्शन (6 एच) के बाद बहुत जल्दी पता लगाया जा सकता है। हालांकि, लंबी अवधि में, दरार उत्पादों का पता नहीं चला। वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में, गतिज अलग थे और दरार उत्पादों 6-48 एच6के बीच पता लगाया जा सकता है । अन्य लोगों ने 3-6 घंटे के बाद संक्रमण9,11के रूप में मेजबान प्रोटीन दरार उत्पादों की उपस्थिति की सूचना दी है ।

कोशिकाओं में प्रोटेलिटिक गतिविधि अक्सर पकड़ना मुश्किल होता है; दरार उत्पादों को उनकी घुलनशीलता, एकाग्रता, स्थिरता, और जीवनकाल में भिन्न हो सकते हैं। सेल आधारित परखों में, यह नहीं माना जा सकता है कि दरार उत्पादों को एक सेल में जमा होगा या कि कटौती और अनकट प्रोटीन के बैंड तीव्रता प्रतिपूरक वृद्धि और कम हो जाती है के रूप में कटौती प्रोटीन बहुत जल्दी अपमानित किया जा सकता है और एक उंमीद आणविक वजन (MW) (जैसे, epitope युक्त क्षेत्र अंय मेजबान protease द्वारा क्लीव्ड किया जा सकता है) दिखाई देगा । यदि वायरल प्रोटीज का सब्सट्रेट एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन है, तो संक्रमण के दौरान इसकी एकाग्रता भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, वायरल संक्रमण से पहले कुछ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन मौजूद होते हैं औरइंटरफेरॉन 26द्वारा आगे प्रेरित होते हैं। इसलिए संक्रमण के दौरान लक्ष्य प्रोटीन की एकाग्रता में उतार-चढ़ाव हो सकता है और संक्रमित कोशिका लिये की तुलना व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, सभी कोशिकाओं को समान रूप से ट्रांससंक्रमित या संक्रमित नहीं किया जा सकता है। इन विट्रो प्रोटीज परख ों में दूसरी ओर ई. कोलाई से शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर कम चर है जिसके लिए नियंत्रित करने के लिए और इस तरह के परखों के बजाय इम्यूनोलॉट ्स-पेज का उपयोग किया जा सकता है । दूषित प्रोटीज को सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट के प्रोटीन शुद्धिकरण के शुरुआती चरणों में बाधित किया जा सकता है, और उत्परिवर्तित वायरल प्रोटीज़ को शुद्ध किया जा सकता है और नियंत्रण के रूप में परीक्षण किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि दरार वायरल प्रोटीज़ या दूषित बैक्टीरियल प्रोटीज के कारण है या नहीं ।

इन विट्रो प्रोटीज परखों की एक सीमा यह है कि उनमें स्तनधारी कोशिका की जटिलता की कमी है। एक एंजाइम के लिए अपने सब्सट्रेट में कटौती करने के लिए, दोनों को सह-स्थानीयकृत किया जाना चाहिए। समूह चतुर्थ वायरल प्रोटीज़ संरचना और स्थानीयकरण में भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, ZIKV प्रोटीज एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली में एम्बेडेड है और साइटोसोल का सामना करता है, जबकि वीईवी एनएसपी2 प्रोटीज़ साइटोप्लाज्म और न्यूक्लियस27में घुलनशील प्रोटीन है। ZIKV SSHHPS विश्लेषण में पाया दरार साइट दृश्यों में से कुछ संकेत पेप्टाइड्स में थे सुझाव है कि दरार सह कुछ लक्ष्यों के लिए अनुवाद हो सकता है । इस प्रकार, कोशिका में प्रोटीज़ और सब्सट्रेट के स्थान पर भी इन विश्लेषणों में विचार करने की आवश्यकता है।

कोशिका आधारित परख संक्रमण में पहचाने गए मेजबान प्रोटीन (एस) के लिए एक भूमिका स्थापित करने के लिए मूल्यवान हो सकता है। ऐसे तरीके जिनका उद्देश्य मेजबान प्रोटीन के वायरल प्रोटीज़ क्लीवेज को रोकना है जैसे कि एक प्रोटीज़ अवरोधक6 या मेजबान लक्ष्य16 में उत्परिवर्तन के अलावा वायरल प्रतिकृति पर उनके प्रभावों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लक्षित प्रोटीन की अति अभिव्यक्ति भी वायरल प्रतिकृति28को प्रभावित कर सकती है । पट्टिका परखया या अन्य तरीकों का उपयोग वायरल प्रतिकृति की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

1. बायोइन्फॉर्मेटिक्स: ब्लास्ट का उपयोग करमेजबान जीनोम में एसएचएचपीएस की पहचान

नोट: प्रोटीन ब्लास्ट blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi पर पाया जा सकता है।

  1. इनपुट ~ 20 अमीनो एसिड वायरल पॉलीप्रोटीन में कैंची बांड आसपास के। खोजे जाने वाले मेजबान जीनोम (जैसे, होमो सेपियंस)में गैर-बेमानी प्रोटीन दृश्यों और प्रकार का चयन करें।
    1. जरूरत पड़ने पर पीएचआई-ब्लास्ट का चयन करें। एक पैटर्न अनुक्रम में टाइप करें (उदाहरण के लिए, नीचे दिखाए गए V12 के 25 अवशेषों के लिए उद्धरण के बिना पैटर्न "एजी" दर्ज करें)।



      नोट: पीएचआई-ब्लास्ट में, स्क्वायर कोष्ठक [XY] से संकेत मिलता है कि अमीनो एसिड एक्स या वाई सबसाइट स्थिति (जैसे, एजी [एसी] [समलैंगिक]) पर हो सकता है।
    2. विस्फोट के परिणामों का निरीक्षण करें और उन हिट ों की पहचान करें जिनके अवशेषों को उच्च अनुक्रम पहचान है जो पॉलीप्रोटीन दरार साइटों (जैसे, त्रिपक्षीय आकृति प्रोटीन 14)(चित्रा 3)में संरक्षित हैं।
      नोट: सेरीन के लिए P1 अवशेषों के उच्च संरक्षण की उम्मीद है, जबकि साइस्टीन के लिए P2 अवशेषों के उच्च संरक्षण की उम्मीद है ।
    3. उन अवशेषों को रंग दें जो दरार साइट अनुक्रम के समान हैं और अनुक्रमिक क्रम (कोई अंतराल नहीं) में हैं। उपस्थल पर सहन किए गए अवशेषों को रंग दें, लेकिन दूसरे रंग में एक अलग दरार साइट में मौजूद हैं।
      नोट: अवशेष जो रूढ़िवादी प्रतिस्थापन (उदाहरण के लिए, एलआईयू बनाम वैल) का प्रतिनिधित्व करते हैं जो वायरल दरार साइट में मौजूद नहीं हैं, वे भी पाए जा सकते हैं और वायरल प्रोटीज द्वारा पहचाना जा सकता है या नहीं भी हो सकता है।
    4. रैंक आदेश ब्लास्ट लगातार समान या सहन अवशेषों की संख्या के आधार पर हिट है जो दरार साइट अनुक्रम से मेल खाते हैं। सूची से, प्रोटीज़ परख में विश्लेषण के लिए 6 समान या समान अवशेषों वाले प्रोटीन का चयन करें।
    5. अन्य दरार साइटों (nsP2/3, nsP3/4, आदि) के लिए प्रक्रिया दोहराएं और पीएचआई-ब्लास्ट पैटर्न में अधिक अत्यधिक संरक्षित अवशेषों को जोड़कर भविष्यवाणी को धीरे-धीरे मजबूत करें।

2. इन विट्रो Assays: डिजाइनिंग और प्रोटीज़ सब्सट्रेट्स की तैयारी

  1. सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) को एन्कोडिंग करने वाले प्लाज्मिड का निर्माण करें, क्लीवेज साइट अनुक्रम के 25 अमीनो एसिड, इसके बाद पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी, जिसे वीनस29के नाम से भी जाना जाता है)।
    नोट: प्लाज्मिड का निर्माण अनुक्रम और लिगेशन स्वतंत्र क्लोनिंग (SLIC)30 या वाणिज्यिक जीन संश्लेषण का उपयोग करके किया जा सकता है। एक pet15b प्लाज्मिड जिसमें चित्रा 4 में दिखाए गए अनुक्रम को व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया गया था और यहां इसका उपयोग किया गया था।
    1. सब्सट्रेट लंबाई को अनुकूलित करने के लिए, 2-खंड अवशेष प्रतिक्रिया का उपयोग करके प्राकृतिक वायरल पॉलीप्रोटीन दरार साइट दृश्यों के 12-25 अमीनो एसिड वाले अतिरिक्त चर लंबाई FRET सब्सट्रेट्स का निर्माण करें। SDS-PAGE जेल आधारित परख का उपयोग करके या नीचे दिए गए तरीकों का उपयोग करके स्थिर राज्य गतिज मापदंडों को मापने के द्वारा दरार का विश्लेषण करें।
      नोट: कुछ मामलों में, दरार साइटों को होमोलॉजी द्वारा ज्ञात दरार साइटों31के लिए पहचाना जा सकता है। यदि पॉलीप्रोटीन जंक्शन दृश्यों वाले सब्सट्रेट्स का दरार नहीं देखा जाता है, तो अतिरिक्त अवशेषों या संरचनात्मक आकृति (जैसे, एक अल्फा हेलिक्स32)की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, शुद्ध वायरल प्रोटीज निष्क्रिय हो सकता है। SSHHPS विश्लेषण का पीछा करने से पहले वायरल पॉलीप्रोटीन दृश्यों के दरार की पुष्टि करें । सब्सट्रेट में अवशेषों की संख्या को वेरिएबल लेंथ सब्सट्रेट्स (12 से 25 अमीनो एसिड) का उपयोग करके वीईवी प्रोटीज़ के लिए अनुकूलित किया गया था जिसके बाद वीमैक्स और केएम32,33का विश्लेषण किया गया था। उदाहरणों में इस्तेमाल किए जाने वाले जीका वायरल ns2B/nsB प्रोटीज़ क्लीवेज साइटों को34,35प्रकाशित किया गया है .
  2. BL-21 (DE3) के 8-20 माइक्रोन को ताजा रूप से बदलकर सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स तैयार करेंE. coliसीएफपी-वी12-वाईएफपी प्लाज्मिड के साथ सक्षम कोशिकाएं निर्माता के निर्देशों और लुरिया बर्टानी (एलबी) एगर प्लेटों पर प्लेट के अनुसार ५० μg/mL Ampicillin (३७ डिग्री सेल्सियस) युक्त ।
    1. ऑटोक्लेव चार 4 एल फ्लैक्स जिसमें एलबी मीडिया (1.5 एल मीडिया प्रति फ्लास्क) और 250 एमएल फ्लास्क में एलबी का 100 एमएल शामिल है। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रत्येक फ्लास्क कैप।
    2. हौसले से बदल बैक्टीरिया की एक कॉलोनी के साथ 100 मिलीआर संस्कृति का टीका और मिलाते हुए (200 आरपीएम) रातोंरात के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने।
    3. सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट बनाने के लिए, एक रात की संस्कृति के 25 mL के साथ चार 4 एल फ्लैक्स का टीका लगाते हैं । 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को हिलाना शुरू करें और 600 एनएम प्रति घंटा पर यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विकास की निगरानी करें।
    4. जब बैक्टीरिया 600 एनएम (लगभग ~ 3-4 घंटे के विकास) पर ~ 1.0 के अवशोषण तक पहुंचते हैं तो प्रति फ्लास्क 1 एम आइसोप्रोपाइल-डी-थियोगालाक्टोसाइड (आईपीटीजी) के 0.5 मीटर जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं। आईपीटीजी जोड़ने के बाद, मिलाते हुए इनक्यूबेटर के तापमान को 17 डिग्री सेल्सियस तक कम करें और अभिव्यक्ति को 17-20 घंटे तक रात भर जारी रखने की अनुमति दें।
    5. 10 मिन (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 7,000 x ग्राम पर उच्च गति से अपकेंद्रित्र का उपयोग करने वाले बैक्टीरिया को गोली मारना और छर्रों को बनाए रखें। तरल मीडिया को हटाएं और त्यागें। छर्रों को तुरंत 80 डिग्री सेल्सियस या लेज पर स्टोर करें।
    6. लाइसिस बफर का 100 मिलीग्राम तैयार करें जिसमें 50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 500 एमएम एनएसीएल, बैक्टीरियल प्रोटीन एक्सट्रैक्शन रिएजेंट का 35 मिलीग्राम, 30 मिलीग्राम लाइसोजाइम, 25 यू ऑफ डैनेस और 1 प्रोट अवरोधक टैबलेट होंगे। एक पिपेट के साथ लिसिस बफर में छर्रों को फिर से निलंबित करें और ~ 25-35 मीटर को 50 मीटर डिस्पोजेबल शंकुई ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    7. ट्यूबों को बर्फ के पानी वाले प्लास्टिक बीकर में रखें। ट्यूबों में सोनिकेटर टिप डालें ताकि टिप ट्यूब के नीचे से ~ 1 सेमी हो और 15 के अंतराल के लिए लेवल 5 पर 10-20 बार लाइसेट्स को सोनिकेट करें जब तक कि लाइसेट तरल पदार्थ और तरलीकृत न हो जाए।
      नोट: सोनिकेशन के दौरान हियरिंग प्रोटेक्शन का इस्तेमाल करें।
    8. लाइसेट को हाई स्पीड सेंट्रलाइज ट्यूब और सेंट्रलाइज को 30 मिन के लिए 20,500 एक्स जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफर करें। स्पिन के बाद, सुपरनेटेंट (~ 100 mL) को बनाए रखें और इसे एक साफ बोतल में स्थानांतरित करें। छर्रों को त्यागें।
    9. बफर ए (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 500 एमएम एनओएल) के 1 एल तैयार करें। बफर बी (50 एम ट्रिस पीएच 7.6, 500 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम इमिडाजोल) के 300 एमएल तैयार करें।
    10. बफर ए के 3 कॉलम वॉल्यूम और 5 mL/min की प्रवाह दर का उपयोग करके 100 मीटर निकल कॉलम को समरूप करें।
    11. 2 से 5 mL/min की प्रवाह दर का उपयोग करनिकल कॉलम पर lysate लोड करें । बफर ए के 2 कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम को धोएं, इसके बाद 20% बफर बी के ~ 5 कॉलम वॉल्यूम । 20% बफर बी वॉश के दौरान, 280 एनएम (ए280)पर अवशोषण में वृद्धि होगी क्योंकि धोने के दौरान कॉलम से संदूषक ों में वृद्धि होगी। कॉलम धोने जारी रखें जब तक कि एल्यूएट का280 बेसलाइन मूल्यों पर लौट न जाए।
    12. 2-5 mL/min की प्रवाह दर का उपयोग कर 100% बफर बी के 2-3 कॉलम संस्करणों के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें और 10 मीटर अंश एकत्र करें। प्रत्येक अंश के एक280 उपाय।
    13. 15 मीटर अपकेंद्रित्र अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट का उपयोग करके280 और 0.1 वाले अंशों को मिलाएं और केंद्रित करें। 15 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों को स्पिन करें और तब तक अंश जोड़ना जारी रखें जब तक कि मात्रा ~ 50-75 मीटर तक कम नहीं हो जाती।
    14. 6-8 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग का 14 इंच का टुकड़ा काटें। डायलिसिस ट्यूबिंग को 10 मीटर के लिए पानी के 300 मिलील में पूरी तरह से जलमग्न करके हाइड्रेट करें। झिल्ली के एक छोर पर एक सुरक्षित गाँठ बांधें। यह सुनिश्चित करने के लिए बैग को डायलिसिस बफर से भरें कि कोई दरार या लीक मौजूद न हो। बैग से बफर निकालें और बैग को डायलिसिस बफर में डूबे रखें।
    15. केंद्रित प्रोटीन को 2.2.13 से डायलिसिस बैग में प्लास्टिक पिपेट के साथ स्थानांतरित करें। बैग से किसी भी हवा बुलबुले निकालें। बैग को दूसरी गाँठ या डायलिसिस क्लिप के साथ बंद करें। 50 एम ट्रिस पीएच 7.6, 5 एम ईटीए (एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड), 250 मीटर नैल में 500 मीटर के 500 मीटर स्नातक सिलेंडर के खिलाफ प्रोटीन को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात स्नातक किया गया।
    16. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एम एम ट्रिस पीएच 7.6 के 500 मीटर के मुकाबले दूसरी बार प्रोटीन को डायलाइज करें।
  3. एनियन एक्सचेंज कॉलम के लिए बफर ए (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6) और 500 एमएम बफर बी (50 एम ट्रिस पीएच 7.6, 1.0 एम नासीएल) के 500 एमएल तैयार करते हैं। बफर ए (2-5 mL/min) के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ 30 एमएल एनिवर्सरी एक्सचेंज कॉलम को समतुल्य करें।
    1. डायलिसिस बैग से प्रोटीन निकालें और एक बोतल में स्थानांतरित करें। बोतल को बर्फ पर रखें। कॉलम (2-5 mL/min) पर डायलाइज्ड प्रोटीन लोड करें ।
      नोट: सीएफपी/वाईएफपी प्रोटीन कॉलम को बांधेगा और दिखने में पीला होगा ।
    2. बफर ए के साथ कॉलम को तब तक धोएं जब तक कि बेसलाइन (5 mL/min) में280 रिटर्न न हो जाए। एक ढाल (0-50% बफर बी, 100 मीटर) का उपयोग कर प्रोटीन को एल्यूट करें और 10 एमएल अंश एकत्र करें।
    3. एसडीएस-पेज का उपयोग करके कॉलम अंशों का निरीक्षण करें। उन लोगों को मिलाएं जो और 95% शुद्ध हैं।
    4. प्रोटीन को 15 mL अपकेंद्रित्र अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट का उपयोगकरके 280 ~ 10-20 पर केंद्रित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ४,५०० x ग्राम पर ध्यान केंद्रित स्पिन और प्रोटीन युक्त अंशों के सभी संयुक्त किया गया है जब तक प्रोटीन जोड़ने के लिए जारी है ।
  4. ध्यान से एक पिपेट के साथ एकाग्रसे प्रोटीन को हटा दें। अलीने प्रोटीन को 1.5 mL माइक्रोसेन्ट्रिकफ्यूज ट्यूब में उद्धृत करें और 80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें। बफर उपयोग से पहले उपयुक्त परख बफर के साथ समतुल्य पीडी-10 कॉलम का उपयोग करके कमरे के तापमान पर प्रोटीन का आदान-प्रदान करता है।
  5. बीयर के कानून का उपयोग करना280 और एक गणना विलुप्त होने गुणांक (उदाहरण के लिए, V12 सब्सट्रेट = 47,790 एम-1 सेमी-1)का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की गणना करता है।
    नोट: विलुप्त होने गुणांक ()) की गणना एक्सपासी प्रोटापरम कार्यक्रम(https://web.expasy.org/protparam/)का उपयोग करके चित्र4 में प्रोटीन अनुक्रम से की जा सकती है।

3. अल्फावायरल nsP2 साइस्टीन प्रोटीज़ की तैयारी

  1. प्रोटीज को एन्कोडिंग करने वाले प्लाज्मिड डिजाइन और निर्माण। साइस्टीन प्रोटीज के लिए, एक थिओरेडॉक्सिन (टीआरएक्स) फ्यूजन प्रोटीन का निर्माण करने के लिए pet32 प्लाज्मिड का उपयोग करें।
    नोट:pet32 प्लाज्मिड थिओरेडॉक्सिन और उसके टैग को हटाने के लिए एक थ्रोम्बिन दरार साइट (एलवीपीआरजीएस) को एन्कोड करता है (चित्रा 5). थिओरेडॉक्सिन अभिव्यक्ति के दौरान सक्रिय साइट साइस्टीन को कम स्थिति में बनाए रखने में मदद करेगा। सेरीन प्रोटीज के लिए, थिओरेडॉक्सिन की आवश्यकता नहीं है और थ्रोम्बिन द्वारा इसे हटाने से जुड़े कदमों को छोड़ा जा सकता है। वीईवी एनएसपी2 प्रोटीज़ अनुक्रम को एक पी32बी प्लाज्मिड में शामिल किया गया था जिसे चुनिंदा एजेंटों को संभालने से बचने के लिए व्यावसायिक रूप से तैयार किया गया था।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए को BL21 (DE3) pLysS ई. कोलाई में बदल ें। एपिसिलिन युक्त एलबी एगर प्लेटों पर बैक्टीरिया प्लेट करें।
      नोट: क्लोरम्फेनिकोल का उपयोग केवल पीलिएसएस प्लाज्मिड ले जाने वाले ई कोलाई उपभेदों के लिए किया जाता है और यदि BL21 (DE3) कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है तो छोड़ दिया जाता है। इस कदम में एलबी एगर प्लेट पर क्लोरम्फेनिकोल को शामिल करना जरूरी नहीं है।
    2. एक 250 मीटर फ्लास्क में एलबी मीडिया (6 एल कुल मात्रा) और एलबी के 100 एमएल के ऑटोक्लेव चार 4 एल फ्लैक्स। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रत्येक फ्लास्क कैप।
    3. थाली से एक कॉलोनी के साथ एलबी/Ampicillin की एक १०० मीटर रातोंरात संस्कृति टीका और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर (२०० आरपीएम) में बढ़ते हैं ।
    4. रातोंरात संस्कृति के 25 mL के साथ 4 एल फ्लैक्स का टीका और उचित एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें ।
      नोट: BL21 (DE3) pLysS पीलॉसी प्लाज्मिड ले जाने वाली मीडिया में 25 μg/mL क्लोरम्फेनिकोल और ५० μg/mL Ampicillin की अंतिम सांद्रता होनी चाहिए ।
    5. 600 एनएम पर अवशोषण 1.0 तक पहुंचने पर संस्कृति में आईपीटीजी के 0.5 मिलील को जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। मिलाते हुए इनक्यूबेटर का तापमान 17 डिग्री सेल्सियस तक कम करें। अभिव्यक्ति को रातोंरात जारी रखने की अनुमति दें (~ 17 एच)।
    6. सेंट्रलाइज्ड (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 7,000 x ग्राम) द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। तरल मीडिया को हटा दें और त्यागें।
      नोट: छर्रों को महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत ले जाए जा सकता है।
    7. लाइसिस बफर (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 500 एमएल एनएसीएल, 2 एमएम बीटा मर्काप्टोथेनॉल (बीएमई), 30 एमजी लाइसोजाइम, 5% ग्लाइसेरोल, 25 यू डीएनएसे, 35 एमएल बैक्टीरियल प्रोटीन एक्सट्रैक्शन रिएजेंट) के 100 मिलील तैयार करें। जोड़ने पर रासायनिक हुड में बीएमई की बोतलें खोलें। इसके लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल लाइसेट रखें और बाद के सभी स्टेप्स।
      नोट: साइस्टीन प्रोटीज के लिए, न्यूक्लियोफिलिक साइस्टीन को कम रखने के लिए 2 एमएम बीएमई शामिल है। कॉलम ठंडा बफ़र्स का उपयोग कर कमरे के तापमान पर चलाया जा सकता है। बफर को कोल्ड डिओनाइज्ड पानी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाना चाहिए।
    8. लिसिस बफर के ~ 25 mL में बैक्टीरियल छर्रों को फिर से निलंबित करें और 4 x 50 मीटर डिस्पोजेबल शंकुट्यूब में लिसेट के ~ 25 mL स्थानांतरित करें। ट्यूबों को बर्फ के पानी से युक्त प्लास्टिक की चोंच में रखें। 15 के अंतराल के लिए लेवल 5 पर 10 बार लाइसेट का टीले का टीलिया करें।
    9. हाई स्पीड सेंट्रलाइज ट्यूब में लाइसेट ट्रांसफर करें। सेंट्रलाइज्ड (30 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,500 x ग्राम) द्वारा लाइसेट को स्पष्ट करें।
    10. बफर ए (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 500 एमएम एनएसीएल, 5% ग्लाइसेरोल, 2 एमएम बीएम बीएमई) और चिल टू 4 डिग्री सेल्सियस के 0.5 एल तैयार करें।
    11. बफर बी (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 500 एमएम एनएसीएल, 5% ग्लाइसेरोल, 2 एमएम बीएमएम बीएमई, 300 एमएम इमिडाजोल) और चिल टू 4 डिग्री सेल्सियस के 250 मीटर तैयार करें।
    12. बफर ए के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ 50 मीटर निकल कॉलम को समतुल्य करें। 2-5 mL/min पर कॉलम पर स्पष्ट लाइसेट लोड करें और छर्रों को त्यागदें।
    13. बफर ए के 2 कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम (2-5 mL/min) को धोएं जिसके बाद बफर ए के 5 कॉलम वॉल्यूम होते हैं जिसमें 20% बफर बी (60 एमएम इमिडाजोल) होता है। 100% बफर बी के साथ प्रोटीन (5 mL/min) को एल्यूट करें और 10 मीटर अंश एकत्र करें।
    14. एक 15 mL अपकेंद्रित्र अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट का उपयोग करके280 ♫ 0.1 वाले प्रोटीज़ वाले अंशों को मिलाएं और केंद्रित करें और 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x ग्राम पर स्पिन करता है। वॉल्यूम को ~ 5 मिलीएल तक कम करने के बाद, बफर प्रोटीन (50 एमएम ट्रिएस पीएच 7.6, 250 एमएएम एनसीएल, 5 एमएम डिथियोथ्रेइटॉल (डीटीटी), 1 एमएम ईडीटीए, 5% ग्लाइसेरोल) में ताजा डायलिसिस बफर जोड़कर एकाग्रता इकाई में प्रोटीन का आदान-प्रदान करता है। 15 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x ग्राम पर फिर से स्पिन; बफर एक्सचेंज चरण को 2-3 बार दोहराएं। थिओरेडॉक्सिन और उसके टैग को हटाने के लिए डायलिसिस से पहले प्रोटीन (1 यूनिट/μL के 20 μL) में थ्रोम्बिन जोड़ें ।
    15. प्रोटीन को डायलिसिस बैग में स्थानांतरित करें और डायलिसिस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के 500 मिलीएल के खिलाफ डायलिसिस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के खिलाफ डायलिज़ को रातोंरात 500 मिलीएम स्नातक सिलेंडर में रखें।
      नोट: एफपीएलसी (फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी) सिस्टम और निकेल कॉलम को एनियन एक्सचेंज कॉलम में आगे बढ़ने से पहले बफर (2 एम एनसीएल, 50 एम ईटीए) को अलग करने के साथ अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए। FPLC लाइनों में किसी भी अवशिष्ट निकल बफर डीटीटी ब्राउन युक्त समाधान जब मिश्रित बदल जाएगा । निकल कॉलम और एफएलसी सिस्टम को पानी के 4 कॉलम वॉल्यूम के साथ धोलें। पंप एफएलसी सिस्टम को पानी से अच्छी तरह धो लें। निकल कॉलम बाद के शुद्धिकरण के लिए रेसिन पर 0.2 एम निकल सल्फेट के 2 कॉलम संस्करणों को बहने से पुनर्जीवित किया जा सकता है।
  2. एनियन एक्सचेंज कॉलम के लिए बफर ए (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 5 एमएम डीटीटी, 5% ग्लाइसेरोल) के 1 एल तैयार करें।
    1. बफर बी (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.6, 5 एमएम डीटीटी, 5% ग्लाइसेरोल, 1.25 एम एनसीएल) के 0.5 एल तैयार करें।
    2. बफर ए (3 कॉलम वॉल्यूम, 2-5 mL/min) के साथ 30 mL एनिवर्सरी एक्सचेंज कॉलम को समतुल्य करें। प्रवाह के संग्रह के लिए अंश कलेक्टर में ट्यूब रखें।
      नोट: वीईवी प्रोटीज़ में 8.7 का एक गणना आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (पीआई) है और यह एनियन एक्सचेंज कॉलम के माध्यम से उपयोग करेगा। पी की गणना प्रोटीन अनुक्रम से एक्सपासी प्रोटापरम कार्यक्रम(https://web.expasy.org/protparam/)का उपयोग करके की जा सकती है।
    3. बफर ए के साथ डायलिसि प्रोटीन 1:3 पतला करें, और फिर प्रोटीन (5 mL/min) लोड करें। 10 मीटर अंशों में प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए।
  3. एफएलसी सिस्टम से एनियन एक्सचेंज कॉलम निकालें। एफएलसी सिस्टम से एक सेशन एक्सचेंज कॉलम कनेक्ट करें। बफर ए (5 mL/min) के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ 30 मीटर का सेशन एक्सचेंज कॉलम को समतुल्य करें ।
    1. 2-5 mL/min पर cation एक्सचेंज कॉलम पर एनियन एक्सचेंज कॉलम के माध्यम से प्रवाह लोड करें । बेसलाइन स्तर पर एक२८० रिटर्न तक बफर ए के साथ कॉलम को धोएं । 100 एमएल ढाल (0-50% बफर बी) के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें और 10 एमएल अंश एकत्र करें।
      नोट: वीईवी प्रोटीज लगभग 0.6 एम एनसीएल पर होगा।
    2. एसडीएस-पेज का उपयोग करके कॉलम अंशों का निरीक्षण करें। उन अंशों को मिलाएं जो और 95% शुद्ध हैं और 15 एमएल अपकेंद्रित्र अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोगकरके 280 रुपये 2 पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एंजाइम को तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रोजन किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

4. एंजाइम लगातार एक प्लेट रीडर का उपयोग कर कह रही

  1. परख बफर (50 mM HEPES पीएच 7.0) के 50 मीटर तैयार करें।
    1. जैसा कि अल्फावायरल प्रोटीज़ में अपेक्षाकृत कम केबिल्ली मूल्य होते हैं, परख बफर में एंजाइम को 4.7 माइक्रोन तक पतला करें (यह मोटे तौर पर ट्राक्स के बिना वीईवी प्रोटीज़ के लिए280 = 0.2 के अनुरूप होगा)।
    2. एंजाइम की गतिविधि को मापने के लिए, 185 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ परख बफर में सब्सट्रेट का स्टॉक तैयार करें; यह मोटे तौर पर एक280 = 9 के अनुरूप होगा। 8 माइक्रोसेंड्रिफ्यूज ट्यूबों में, 185 माइक्रोन सब्सट्रेट स्टॉक और बफर की उपयुक्त मात्रा को जोड़कर तालिका 2 में दिखाए गए प्रतिक्रिया घोला जा सकता है तैयार करें। एक काले आधे क्षेत्र में 96-अच्छी तरह से प्लेट पाइप 45 माइक्रोन प्रतिक्रिया 3 कुओं (कॉलम 1, 2, 3) में घोला जा सकता है। पंक्ति ए में [एस] = 5 माइक्रोएम प्रतिक्रिया मिश्रण होना चाहिए, और पंक्ति एच में [एस] = 140 माइक्रोएम प्रतिक्रिया मिश्रण होना चाहिए।
    3. प्लेट रीडर सेट एक निश्चित फोटोमल्टीक्रेक ट्यूब (पीएमटी) सेटिंग (जैसे, कम) के साथ दो तरंगदैर्ध्य पर एक साथ फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए:
      तरंगदैर्ध्य 1 उत्तेजना = 434 एनएम, उत्सर्जन = 527 एनएम
      तरंगदैर्ध्य 2 उत्तेजना = 434 एनएम, उत्सर्जन = 470 एनएम
    4. 20 मिनट के लिए पढ़ा समय निर्धारित करें (मापने 1 प्रति मिनट पढ़ें) और कुओं का चयन करने के लिए पढ़ा जा सकता है । प्लेट रीडर में प्लेट डालें और 20 मिन के लिए हाइड्रोलिसिस की सहज दर को मापें। उत्सर्जन अनुपात (उत्सर्जन 527/उत्सर्जन पर 470 पर) समय के साथ निगरानी करें।
    5. "अनकट" सब्सट्रेट युक्त प्लेट का एक एंडपॉइंट पढ़ें।
      नोट: इन मूल्यों का उपयोग बाद के डेटा गणना में किया जाएगा। 3 कुओं से उत्सर्जन अनुपात का औसत तालिका 3में टी = 0 पर "अनकट" सब्सट्रेट के मूल्य होंगे।
    6. प्रत्येक कुएं में प्लेट और एंजाइम के 5 μL को हटा दें। 1 प्रति मिनट पढ़ें के साथ 20 मिनट के लिए फिर से थाली पढ़ें। पूर्ण मूल्यों के उत्पादन के लिए प्लेट रीडर सेट करें।
      नोट: इस परख के लिए ढलान नकारात्मक रहेगा। प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा 50 माइक्रोन होगी।
    7. पढ़ने के अंत में, वाष्पीकरण को रोकने के लिए फिल्म के साथ थाली सील। रात भर कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दें ताकि एंजाइम को सब्सट्रेट को पूरी तरह से काटने की अनुमति दी जा ।
    8. ~ 24 घंटे के बाद, सीलिंग फिल्म को हटा दें और पूर्व प्लेटों में उसी पीएमटी का उपयोग करके प्लेट के एक एंडपॉइंट पढ़ें। "कट" के तहत तालिका 3 में इन उत्सर्जन अनुपात और इनपुट का औसत। नीचे वर्णित एसडीएस-पेज असतत परख (चरण 5.1.) का उपयोग करके सब्सट्रेट के दरार की पुष्टि करें।
    9. डेटा को स्प्रेडशीट पर निर्यात करें। 2 तरंगदैर्ध्य(तालिका 4)के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर फ्लोरेसेंस इकाइयों का उत्पादन करें।
    10. सब्सट्रेट के एनमोल की गणना करें जो समीकरण (1) का उपयोग करके समय टी में कटौती की गई है, जहां एक्स उत्सर्जन अनुपात (527 एनएम/470 एनएम) एक निश्चित समय बिंदु पर है, नेग टी = 0 पर "अनकट" सब्सट्रेट का उत्सर्जन अनुपात है, और पीओएस कटिंग(टेबल 3)के 24 एच के बाद मापा गया पूरी तरह से "कट" सब्सट्रेट का उत्सर्जन अनुपात है।



      नोट: प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस डेटा तालिका 4में 80 माइक्रोन सब्सट्रेट (एस प्रति कुएं के 4 एनएम) वाले एक अच्छी तरह से (अच्छी तरह से E7) के लिए दिखाया गया है। गणना थाली में प्रत्येक अच्छी तरह के लिए किया गया ।
    11. प्रत्येक कुएं के लिए, साजिश nmol बनाम समय (मिन) और y = mx + बी के लिए डेटा फिटिंग द्वारा प्रारंभिक वेग (ढलानों) प्राप्त करें । 4.1.5 में एकत्र किए गए आंकड़ों के लिए, प्रत्येक कुएं के लिए प्लॉट नमोल बनाम समय (मिन)। ढलान प्रति मिनट उत्पादित नमोल उत्पाद के बराबर होगा। एंजाइम-उत्प्रेरक प्रतिक्रिया दरों(तालिका 5)से 4.1.5 में मापी गई हाइड्रोलिसिस की सहज दरों को घटाएं।
      नोट: प्लेट रीडर में प्लेट की आवाजाही के कारण यदि यह वास्तव में उच्च है तो पहले पढ़ा डेटा से काटा जा सकता है।
    12. प्रत्येक कुएं में जोड़े गए एमजी में एंजाइम की मात्रा की गणना करें (उदाहरण के लिए, 0.0009 मिलीग्राम)। एक इकाई को प्रति मिनट उत्पादित उत्पाद के μmol (μmol/min) के रूप में परिभाषित किया गया है । एमयू/एमजी प्राप्त करने के लिए कुएं में मौजूद एंजाइम के मिलीग्राम द्वारा nmol/मिन को विभाजित करें; यू/एमजी प्राप्त करने के लिए १,००० से विभाजित करें ।
    13. वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और यू/एमजी पर प्लॉट [एस] माइक्रोन और वीमैक्स और केएमप्राप्त करने के लिए माइकलिस-मेनटेन समीकरण के लिए डेटा फिट करें । यह सॉफ्टवेयर (जैसे, ग्रैफिट) में किया जा सकता है।

5. एसडीएस-पेज विश्लेषण का उपयोग करके एंजाइम को अकारण परमानेंस कहना

  1. एंजाइम और लेबल के स्थान पर 10 μM सब्सट्रेट और बफर वाली 50 माइक्रोन प्रतिक्रिया "अनकट" के रूप में तैयार करें।
    नोट: सब्सट्रेट और बफर की मात्रा तालिका 2में दिखाई जाती है । अगर लगातार परख चलाई गई है तो नमूनों का इस्तेमाल सीधे 96 वेल प्लेट से किया जा सकता है।
    1. 10 μM सब्सट्रेट और 5 μL एंजाइम और लेबल के रूप में "कट" युक्त 50 μL प्रतिक्रिया तैयार करें। जब एंजाइम को सब्सट्रेट में जोड़ा जाता है तो टाइमर शुरू करें।
      नोट: अवरोधकों को एंजाइम और सब्सट्रेट युक्त अतिरिक्त ट्यूबों में जोड़ा जा सकता है। अवरोधक की अतिरिक्त मात्रा की भरपाई के लिए अतिरिक्त बफर की मात्रा को समायोजित करें। डीएमएसओ की सांद्रता 2% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
    2. कमरे के तापमान (22 ± 3 डिग्री सेल्सियस) पर ~ 15-24 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें। 2x Laemelli बफर के ५० μL जोड़कर प्रतिक्रियाओं को रोकें । प्रतिक्रिया फोड़ा रोकने के बाद, 3-10 0 0 0 के लिए प्रत्येक ट्यूब।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल टैंक को इकट्ठा करें। एक 17 अच्छी तरह से पूर्व कास्ट 12% पॉलीएक्रिलामाइड जेल कैसेट और दूसरी तरफ एक बफर बांध डालें। बफर कैसेट के शीर्ष तक पहुंचने तक 1x एसडीएस रनिंग बफर के साथ सेल के आंतरिक जलाशय को भरें। बाहरी जलाशय को एक ही बफर से आधा भरा भरें।
    4. असतत परख का उपयोग कर दरार का विश्लेषण करने के लिए, "अनकट" प्रतिक्रिया के साथ शुरू होने वाले एसडीएस-पेज जेल की एक लेन में प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 μL लोड करें। पहली या आखिरी लेन में आणविक वजन मार्कर शामिल करें।
    5. जेल टैंक के इलेक्ट्रोड को बिजली आपूर्ति में संलग्न करें और उत्पादों को 60 किमी के लिए 110 वी पर अलग करें। प्लेटों के बीच क्रैकिंग टूल डालकर कैसेट से जेल को हटा दें। जेल को प्लास्टिक की ट्रे में रखें और जेल धुंधला समाधान के 5-10 मीटर में जेल को जलमग्न कर दें; बैंड 30 मिनट के भीतर दिखाई देगा। 1-24 घंटे के बाद अतिरिक्त दाग को हटा दें, जेल को पानी में डूब जाएं और जेल की तस्वीर लेने के लिए जेल इमेजर का उपयोग करें।

6. वीईवी-एनएसपी2 साइस्टीन प्रोटीज़ के लिए डॉकिंग सब्सट्रेट पेप्टाइड्स

  1. पीडीबी(https://www.rcsb.org/)से वीईवी साइस्टीन प्रोटीज के लिए समन्वय फ़ाइल डाउनलोड करें। पीडीबी कोड 2एचडब्ल्यूके है। 2HWK.pdb के रूप में फ़ाइल को बचाओ।
    1. मो(https://www.chemcomp.com/)का उपयोग करप्रोटीन संरचना तैयार करें। प्रोटीन पीडीबी फाइल को एमओ ई में लोड कर दें। राइट हैंड साइड बार पर सिलेक्ट और सॉल्वेंट पर क्लिक करें और सॉल्वेंट डिलीट कर दें।
    2. शीर्ष मेनू बार प्रोटीनसे संरचना तैयारी पैनल खोलें। सही पर क्लिक करके और प्रोटोनेट 3 डीपर क्लिक करके संरचना को प्रोटोनेट करके सभी संरचनात्मक वस्तुओं को स्वचालित रूप से सही करें। आंशिक शुल्क पैनल खोलकर प्रोटीन में आंशिक शुल्क जोड़ें और एंबर 99 का चयन करके और आवश्यकतानुसार हाइड्रोजन और लोन जोड़े को समायोजित करें। अंत में, संरचना फ़ाइल को "2HWK_dock.pdb" के रूप में सहेजें।
  2. एमओई का उपयोग करके सब्सट्रेट पेप्टाइड्स (एनएसपी12, एनएसपी23, एनएसपी34) और TRIM14 के लिए संरचना का निर्माण करें। प्रोटीन बिल्डर पैनल खोलें, सब्सट्रेट अनुक्रम दर्ज करें, ज्यामिति को विस्तारित के रूप में सेट करें, और बिल्ड पर क्लिक करें। संरचना एमओई विंडो में दिखाई जाएगी।
    1. पैनल पर कम से कम क्लिक करके पेप्टाइड संरचना को कम करें। एक पीडीबी फ़ाइल(चित्रा 6)के रूप में संरचना को बचाओ ।
  3. पाइरेक्स/ऑटोडॉक 4.2(http://autodock.scripps.edu/)का उपयोग करके वीईवी-एनएसपी2 को सब्सट्रेट पेप्टाइड्स को डॉक करें। पाइरेक्स टूल खोलें, वरीयता सेटिंग को संपादित करें, लिगामेंट तैयारी के लिए सभी टोरशन को निष्क्रिय करें। सब्सट्रेट अणु लोड करें, नेविगेटर पैनल पर अणु नाम पर सही क्लिक करें, लिगामेंट डॉकिंग फ़ाइल तैयार करने के लिए लैंड करें। प्रोटीन 2HWK_clean.pdb लोड, और pdbqt डॉकिंग फ़ाइल(चित्रा 7)तैयार करने के लिए मैक्रोमॉलिक्यूल बनाओ का चयन करें ।
    1. नीचे डॉकिंग पैनल पर ऑटोडॉक जादूगर शुरू करें। तैयार लिगामेंट और प्रोटीन फाइल्स का चयन करें। ग्रिड आयाम को मैन्युअल रूप से समायोजित करके प्रोटीन बाध्यकारी जेब को परिभाषित करें जो उत्प्रेरक अवशेष ों Cys-477 पर केंद्रित है। डिफ़ॉल्ट अंतर पैरामीटर 0.375 Å. ग्रिड नक्शे उत्पन्न करने के लिए रन ऑटोग्रिड पर क्लिक करें।
    2. ऑटोडॉक चलाएं और लैमरकिशियन जेनेटिक एल्गोरिदम (एलजीए) विधिका चयन करें। डॉकिंग मापदंडों पर क्लिक करें और जीए की संख्या 50 तक निर्धारित करें। दूसरों के लिए डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग करें। डॉकिंग रन शुरू करने के लिए आगे क्लिक करें ।
    3. विश्लेषण परिणाम पैनल खोलें। सभी भविष्यवाणी बाध्यकारी बन गया है निरीक्षण। सबसे कम भविष्यवाणी की बाध्यकारी ऊर्जा और Cys-477 के बीच उचित बाध्यकारी बातचीत और दरार साइट पर सब्सट्रेट के साथ सबसे अच्छा मॉडल का चयन करें। आगे एमडी सिमुलेशन के लिए पीडीबी फ़ाइल के रूप में बाध्यकारी मॉडल सहेजें।

7. डॉक्ड वीईवी-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के एमडी सिमुलेशन

  1. एंबर(http://ambermd.org/)का उपयोग कर इनपुट फ़ाइलों को तैयार करें। मानक प्रोटोकॉल के बाद, एमडी सिमुलेशन एम्बर पैकेज और ff99SB बल क्षेत्र का उपयोग कर भविष्यवाणी की सब्सट्रेट बाध्यकारी मॉडल के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं।
    नोट: सोलवेट सिस्टम एमडी सिमुलेशन से पहले पूरी तरह से ऊर्जा न्यूनीकरण के अधीन होते हैं। एक सतत प्रणाली का अनुकरण करने के लिए आवधिक सीमा शर्तें लागू की जाती हैं। कण जाल Ewald (PME) विधि लंबी दूरी की इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत की गणना करने के लिए नियोजित किया गया था । नकली प्रणाली को पहले 100 पीएस से अधिक 0 K से 300 K तक क्रमिक तापमान वृद्धि के अधीन किया गया था, और फिर 300 K पर 500 पीएस के लिए समान किया गया था, इसके बाद कुल 2 एनएस लंबाई का उत्पादन चलता है।
    1. एक उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग सुविधा पर सिमुलेशन नौकरी चलाते हैं। हमारे सिमुलेशन बायोवुल्फ क्लस्टर(https://hpc.nih.gov/)(चित्रा 8)पर चलाए गए थे ।
    2. वीएमडी कार्यक्रम(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)का उपयोग करके प्रक्षेपवक्र आउटपुट की कल्पना करें। एनएसपी 2(चित्रा 9)की सक्रिय साइट के भीतर सब्सट्रेट्स और TRIM14 के बाध्यकारी बातचीत और संरचना परिवर्तनों का विश्लेषण करें।

Representative Results

ZIKV ns2B/3 प्रोटीज़ के SSHHPS विश्लेषण ने 4 मेजबान प्रोटीन लक्ष्यों की पहचान की: FOXG1, SFRP1, एक रेटिना सीडीएनए लाइब्रेरी से एक जीएस अल्फा सबयूनिट, और NT5M माइटोकॉन्ड्रियल 5', 3'-नाभिका(चित्रा 10)6। विशेष रूप से, किसी अन्य विधि ने इन प्रोटीनों को ZIKV प्रोटीज़ के संभावित लक्ष्यों के रूप में भविष्यवाणी नहीं की थी। FOXG1 जीन में उत्परिवर्तन एक जन्मजात सिंड्रोम बिगड़ा विकास और माइक्रोसेफली जैसे संरचनात्मक मस्तिष्क असामान्यताओं की विशेषता से जोड़ा गया है । SFRP1 एक स्रावित फ्रिजमेंड से संबंधित प्रोटीन (SFRP) है; ये घुलनशील रिसेप्टर्स प्रतिस्पर्धी रूप से Wnt ligands को विरोधी और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग को बाधित करने के लिए बाध्य कर सकते हैं। डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग पाथवे फ्लेविवायरस संक्रमण36के दौरान आईएफएन प्रतिक्रिया के नियमन में शामिल है। SFRP1 के दरार से फ्लेविवायरस प्रतिकृति में वृद्धि होने की उम्मीद होगी । SFRP1 भी Th17-सेल भेदभाव37में शामिल है। SSHHPS के अनुक्रम संरेखण दरार साइट दृश्यों में प्रजातियों विशिष्ट मतभेदों को दिखाया(चित्रा 10डी)। SFRP1 में दरार साइट अनुक्रम मनुष्यों और मुर्गियों में समान था; ZIKV चिकन भ्रूण38में मृत्यु दर और माइक्रोसेफली प्रेरित कर सकते हैं . कृन्तकों में, अत्यधिक संरक्षित पी 1 अवशेष (K/R) आर जी को ग्लाइसिन (RGG) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। चूहों के इम्यूनोसक्षम उपभेद आम तौर पर जीकेवी संक्रमण और रोग39के लिए प्रतिरोधी होते हैं।

स्थिर राज्य गतिज मापदंडों और अवरोध स्थिरता वायरल पॉलीप्रोटीन दृश्यों के लिए और मेजबान प्रोटीन दृश्यों के लिए एक प्लेट रीडर31,40,41 (चित्रा 11ए)में निरंतर परख का उपयोग कर के लिए मापा जा सकता है। गुणात्मक दरार जानकारी के लिए, जैसे किसी विशेष अनुक्रम का दरार या विभिन्न यौगिकों द्वारा प्रोटीज़ का अवरोध, असतत परख का उपयोग किया जा सकता है(चित्रा 11बी)।

सीएफपी और वाईएफपी के बीच में अवशेषों की संख्या के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सिलिको विधियों का उपयोग करके एक सब्सट्रेट-बाउंड मॉडल बनाया जा सकता है। एनएसपी 1/एनएसपी2 जंक्शन का एक प्रतिनिधि डॉक्ड मॉडल चित्र9में दिखाया गया है । वीईवी एनएसपी2 प्रोटीज़ के लिए, 12-अमीनो एसिड सेमोलिकी वन वायरस (एसएफवी) अनुक्रम के दरार की सूचना दी गई थी (कश्मीरएम = 0.58 mM)33। सब्सट्रेट अनुक्रम को 19, 22 और 25 अवशेषों तक लंबा करना और बफर की आयनिक ताकत को कम करने सेकेएममें काफी कमी आई । वीईवी एनएसपी2 क्रिस्टल संरचना और क्रिस्टल पैकिंग की जांच से यह भी पता चला कि जंक्शनों में से एक का एक हिस्सा प्रोटीज़ डोमेन के खिलाफ पैक किया गया था और पेचियल था। इस प्रकार, अब वीईवी सब्सट्रेट्स एक माध्यमिक संरचनात्मक आकृति की मान्यता के कारण बेहतर हो सकते हैं।

TRIM14 के लिए, हमने एक कश्मीरएम = 21 माइक्रोन6,33प्राप्त किया। मेजबान प्रोटीन अनुक्रम ले जाने वाले सब्सट्रेट के लिए केएम वायरल पॉलीप्रोटीन क्लीवेज साइट दृश्यों (केएम(V12) = 12 μM और Km(V34) = 21 μM युक्त सब्सट्रेट्स के कश्मीरएम मूल्यों के बराबर था। एनएसपी1/एनएसपी2, एनएसपी 2/एनएसपी3 और एनएसपी3/एनएसपी4 जंक्शनों पर दरार साइट दृश्यों को विभिन्न क्षमताओं के साथ काटा गया । कोशिका में, यह पॉलीप्रोटीन42के अनुक्रमिक दरार के लिए अनुमति देने के लिए सोचा जाता है।

नकारात्मक परिणामों की व्याख्या करने में सावधानी बरतनी चाहिए। यदि कोई दरार नहीं होती है, तो दरार साइट बहुत कम हो सकती है या शुद्ध प्रोटीज निष्क्रिय हो सकती है। कटौती की जाती है कि सब्सट्रेट्स के लिए, वायरस संक्रमित कोशिकाओं में पूर्ण लंबाई प्रोटीन या दरार के दरार की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की जरूरत है । उचित अनुवर्ती प्रयोगों को चुना जाना चाहिए। वायरल प्रतिकृति पर लक्ष्य प्रोटीन के अतिअभिव्यक्ति या मुंह को बंद करने के प्रभाव ों का भी परीक्षण किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: मुंह बंद करने के तीन तंत्र। मुंह में डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन के स्तर पर हो सकता है। ये "खोज और हटाएं" एल्गोरिदम प्रत्येक शब्द युक्त फ़ाइल के दरार को निर्देशित करने के लिए "कीवर्ड" का उपयोग करते हैं। इस आंकड़े को मोराज्यानी एट अल32 और उसमें के संदर्भों में संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दरार साइट दृश्यों में प्रजातियों-विशिष्ट अंतर। TRIM14 होमोलॉग के सी-टर्मिनल PRY/SPRY डोमेन संरेखण में दिखाए गए हैं। PRY/SPRY डोमेन ग्रे में प्रकाश डाला संरक्षित रूपांकनों द्वारा पहचाना जा सकता है । मानव TRIM14 VEEV nsP2 साइस्टीन प्रोटीज़ द्वारा QEAGA में काटा जाता है। एसएचएचपी सीक्वेंस को रंग में दिखाया गया है। हरे रंग में अवशेष P1 ' अवशेष है; नीले रंग में P4 अवशेष है, और लाल रंग में दरार साइट आकृति अनुक्रम के भीतर अन्य संरक्षित अवशेष हैं। घोड़े को PRY/SPRY डोमेन की कमी TRIM14 का एक छोटा संस्करण बंदरगाह । सियान में हाइलाइट किया गया लिसिन पॉली-सर्वव्यापी है और एमएवीएस सिग्नलोसोम की असेंबली के लिए महत्वपूर्ण है। सी-टर्मिनल PRY/SPRY डोमेन को एक तीव्र वायरल संक्रमण के दौरान मेजबान की एंटीवायरल प्रतिक्रिया को इंट्रासेलर रूप से ख़राब करने के लिए nsP2 प्रोटीज द्वारा क्षणिक रूप से काटा जा सकता है । घोड़े में, यह डोमेन हमेशा अनुपस्थित रहता है। इससे पता चलता है कि TRIM14 के PRY/SPRY डोमेन VEEV संक्रमण के खिलाफ एक सुरक्षात्मक कार्य हो सकता है । इस आंकड़े को मोराजनी एट अल से पुन: पेश किया गया है।6कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: SSHHPS ब्लास्ट का उपयोग कर पहचान । वीईवी एनएसपी1/एनएसपी2 जंक्शन पर क्लीवेज साइट मोटिफ सीक्वेंस मेजबान प्रोटीन TRIM14 में एसएचएचपी अनुक्रम के साथ गठबंधन है । हरे रंग में रंग का अवशेष P1 'अवशेष है; नीले रंग में P4 अवशेष है और लाल रंग में दरार साइट आकृति अनुक्रम के अन्य संरक्षित अवशेष हैं। अधिकांश संरेखण संरक्षित दरार साइट आकृति के बाहर क्षेत्रों के लिए homology निहित या P1/P1 ' कैंची बांड अवशेषों में शामिल नहीं था । TRIM14 अनुक्रमिक क्रम में 6 अवशेषों के लिए एक मैच दिखाया है कि P1 और P1 ' शामिल हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: वीईवी nsP2 साइस्टीन प्रोटीज के लिए सीएफपी-वी12-वाईएफपी सब्सट्रेट के प्रोटीन और डीएनए दृश्य। NdeI (CATATG) और XhoI (CTCGAG) प्रतिबंध साइटों पूंजी पत्र में दिखाया गया है । लाल रंग में वायरल पॉलीप्रोटीन से दरार साइट अनुक्रम है जो एनएसपी 1 और एनएसपी 2 के बीच में है। हरे रंग में अवशेष P1 ' अवशेष है और नीले रंग में दरार साइट के P4 अवशेष है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Trx-VEEV-nsP2 cysteine प्रोटीज़ का प्रोटीन अनुक्रम निर्माण । थिओरेडॉक्सिन (टीआरएक्स) पीले रंग में दिखाया गया है। थ्रोम्बिन क्लीवेज साइट और उसका टैग सियान में दिखाया गया है। सीवाईएस-उसके डाड को लाल रंग में लेबल किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: मो में पेप्टाइड संरचनाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: PyRx/AutoDock का उपयोग कर सब्सट्रेट पेप्टाइड की डॉकिंग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: बायोवुल्फ क्लस्टर पर चल रही नौकरियां । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: एनएसपी1/nsP2 जंक्शन पर दरार साइट अनुक्रम युक्त VEEV P12 सब्सट्रेट का मॉडल । Cys-477/His-546 उत्प्रेरक dyad नीले रंग में दिखाया गया है। पाइमोल (https://pymol.org) का उपयोग करके चित्रा बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: जीका वायरस ns2B/ns3 प्रोटीज का SSHHPS विश्लेषण । (A)ZIKV ns2B/ns3 प्रोटीज के मेजबान प्रोटीन लक्ष्यों की भविष्यवाणी की । लाल रंग में अवशेष एक दरार साइट अनुक्रम से मेल खाते हैं। हरे रंग में अवशेषों को उपस्थल पर सहन किया जाता है और अन्य दरार स्थलों पर अवशेषों से मेल खाता है। SFRP1 में लगातार क्रम में समान अवशेषों की संख्या सबसे अधिक थी। (ख)सीएफपी-सब्सट्रेट-वाईएफपी प्रोटीन (~ 50-60 केडीए) को व्यक्त किया गया और प्रत्येक मेजबान प्रोटीन (मानव) से भविष्यवाणी एसएसएचपी अनुक्रम युक्त शुद्ध किया गया। ZIKV प्रोटीज़ ने रेटिना सीडीएनए लाइब्रेरी से अलग मानव FOXG1, SFRP1, NT5M और एक जीएसअल्फा सबयूनिट में कटौती की। दरार उत्पाद लगभग 28-30 केडीए हैं। सब्सट्रेट सीक्वेंस मोराज्यानी एट अलअल 6(सी)में उपलब्ध हैं जबकि ns2B/ns3 प्रोटीज़ कट SFRP1, यह अपने homologues (SFRP2 और SFRP4) में कटौती नहीं की । (D)विभिन्न पशु प्रजातियों से दरार साइटों का संरेखण एक समूह चतुर्थ वायरस के लिए एक पशु मॉडल का चयन करने में उपयोगी हो सकता है । ध्यान दें कि संरक्षित आर जी अनुक्रम SFRP1 में मनुष्यों और कृंतकों के बीच अलग है। मोराज्जानी एट अल से पुन: पेश किया गया चित्रा6कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्रा 11: सतत और असतत परख का उपयोग कर स्थिर राज्य गतिज विश्लेषण । (A)टेबल 5 में दिखाए गए गतिज डेटा को ग्रैफिट में प्लॉट किया गया था । इनसेट लाइनबुनकर-बुर्क प्लॉट को दिखाता है । (ख)एसडीएस-पेज जेल सीएफपी-वी12-वाईएफपी सब्सट्रेट के क्लीवेज उत्पादों को दिखाता है। लेन 1 में "अनकट" सब्सट्रेट (48 केडीए) है। लेन 2 में "कट" सब्सट्रेट (31 केडीए और 27 केडीए) है। गलियों में 3-9 विभिन्न यौगिकों को उनकी निरोधात्मक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए शामिल किया गया था । लेन 4 में E64d सहसंयोजक अवरोधक शामिल है। इन प्रतिक्रियाओं को कमरे के तापमान पर ~ 17 घंटे के लिए रात भर चला रहे थे । तेज बैंडिंग पैटर्न को हासिल करने के लिए नमूनों का उबलना जरूरी था। एनएसपी2 प्रोटीज एंजाइम युक्त प्रतिक्रियाओं में (56 केडीए) दिखाई देता है, लेकिन लेन 1 में नहीं। लेन 1 "कोई एंजाइम" नियंत्रण है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एक प्रोटीन या एक विदेशी अनुक्रम द्वारा निर्देशित एक नाभिक एसिड के अनुक्रम विशिष्ट विनाश केवल जीव विज्ञान में कुछ मामलों में देखा जाता है । चित्रा 1 में दिखाए गए तंत्र रक्षात्मक तंत्र हैं जो एक वायरस से मेजबान की रक्षा करते हैं, या मेजबान से वायरस।

बायोइन्फॉर्मेटिक तरीकों का उपयोग करके हम इन प्रणालियों द्वारा नष्ट किए गए लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं। SSHHP दृश्यों के हमारे विश्लेषण में, हमें पता चला कि उनमें से कई प्रोटीन में पाया जा सकता है सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है । कुछ ऐसे MAVS और TRIF (TIR-डोमेन युक्त एडाप्टर-उत्प्रेरण इंटरफेरॉन-ο) के रूप में स्पष्ट भूमिकाएं थीं, जबकि अन्य प्रतिरक्षा से संबंधित थे, हालांकि अधिक जटिल तंत्र (जैसे, हिस्टोन H3, SFRP1, FOXG1)8,9। एसएचएचपी अनुक्रम में संग्रहित लक्षित जानकारी में उन रास्तों की पहचान करने की क्षमता है जिनका इन वायरसों के खिलाफ एंटीवायरल प्रभाव पड़ता है। वीवो में एंटीवायरल प्रतिक्रियाएं अक्सर वायरस विशिष्ट26,43होती हैं । उदाहरण के लिए, ट्रिम प्रोटीन के सबसेट में विभिन्न वायरस43,44,45पर एंटीवायरल प्रभाव पड़ता है, कुछ वायरल प्रतिबंध कारक हैं (जैसे, एचआईवी और TRIM5α)। ट्रिम प्रोटीन (~ 70 की पहचान कर ली गई है) की विशिष्टता अभी भी44,45की जांच की जा रही है। SSHHPS के भीतर जानकारी कैसे इन वायरस सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के बारे में हमारी समझ में योगदान कर सकते हैं । अन्य पैटर्न और सहसंबंधों का पर्दाफाश किया जा सकता है क्योंकि अधिक एसएचएचपीएस की जांच की जाती है।

हमारे विश्लेषणों में प्रजातियों के विशिष्ट अंतर स्पष्ट थे(चित्र ा 2, चित्रा 10)। ये वायरस दूसरों की तुलना में कुछ प्रजातियों को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं। मेजबान रेंज, मेजबान संवेदनशीलता और मेजबान सुरक्षा के बारे में जानकारी SSHHPS के भीतर मौजूद हो सकती है। उदाहरण के लिए, घोड़े, सबसे अतिसंवेदनशील प्रजातियों के लिए इंसेफेलाइटिस वायरस घोड़े, मानव TRIM14 के क्षेत्र है कि क्षणिक VEEV nsP2 प्रोटीज़ द्वारा काटा गया था कमी रह गई थी । मनुष्य शायद ही कभी VEEV संक्रमण से मर जाते हैं, लेकिन24संक्रमित किया जा सकता है । मानव TRIM14 प्रोटीन एक nsP2 प्रोटीज़ दरार अनुक्रम6किया । दरार साइट की उपस्थिति का सुझाव है कि मनुष्य इन वायरस के खिलाफ एक रक्षा तंत्र है । पक्षियों को इन वायरसों के संभावित जलाशय माना गयाहै। मुर्गियों से TRIM14 प्रोटीन में इसी SSHHP अनुक्रम मनुष्यों और अन्य प्रजातियों में पाया दृश्यों से मतभेद । इस तरह के सूक्ष्म मतभेद एक लक्ष्य मेजबान प्रोटीन अंकल या अधिक आसानी से क्लीव्ड कर सकते हैं । Aguirre एट अल16 से पता चला है कि एक चाचा उत्परिवर्तित स्ट्रिंग प्रोटीन डेंगू वायरस संक्रमण के बाद IFN के उच्च स्तर को प्रेरित किया और चूहों स्वाभाविक रूप से डंक का एक संस्करण है कि डेंगू ns2B3 protease द्वारा कटौती नहीं है ले । मिमूत्र स्टिंग प्रोटीन को जीकेवी प्रोटीज़47द्वारा नहीं काटा गया था . हमारे SSHHPS विश्लेषण में, हमने ZIKV प्रोटीज़ क्लीवेज साइट दृश्यों में अंतर भी देखा जब हमने मानव प्रोटीन की तुलना कृंतक6 (चित्रा 10डी)के साथ की। मेजबान प्रोटीन की प्रजातियों-विशिष्ट प्रोटेलियोलिटिक क्लीवेज को पुन: उत्पन्न करना समूह चतुर्थ वायरस के लिए उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडलों में महत्वपूर्ण हो सकता है। मेजबान प्रोटीन दरार के अवरोध भी समूह चतुर्थ प्रोटीज़ अवरोधकों के विकास के संबंध में निहितार्थ है । हमारे पिछले प्रकाशन में, हमने दिखाया कि हम CA074 मिथाइल एस्टर6का उपयोग करके VEEV nsP2 प्रोटीज़ द्वारा TRIM14 दरार को बाधित कर सकते हैं। इसपरिणाम से पता चलता है कि इन प्रोटीज़ के छोटे अणु अवरोधक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मिलासकते हैं जो संक्रमण को दबाने में सक्षम हैं।

एक प्रजाति के भीतर आनुवंशिक भिन्नता में प्रोटेलिटिक क्लीवेज में अंतर पैदा करने की क्षमता भी होती है। कोडन के उपयोग में सूक्ष्म अंतर राइबोसोम रुके48को प्रभावित कर सकता है . चूंकि कुछ समूह चतुर्थ वायरल प्रोटीज़ ईआर झिल्ली में एम्बेडेड होते हैं, इसलिए इन ठहरावमें अंतर एक लक्ष्य के दरार को प्रभावित कर सकता है यदि दरार सह-अनुवादात्मक रूप से होती है। दरार साइटों है कि हम की पहचान की कुछ भविष्यवाणी संकेत पेप्टाइड दृश्यों में थे (जैसे, SFRP1) जबकि अंय आंतरिक थे ।

SSHHPS विश्लेषण ऐसी जानकारी का उत्पादन कर सकता है जो मेजबान प्रोटीन विश्लेषण के अन्य तरीकों से अलग है। SSHHPS विश्लेषण सस्ती और रोजगार के लिए आसान था । एक जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग ने स्तनधारी कोशिका संस्कृति के उपयोग के बिना स्तनधारी दृश्यों के छोटे खंडों (~ 25 अमीनो एसिड) के परीक्षण की अनुमति दी। हमने पाया कि सीएफपी-वाईएफपी सब्सट्रेट्स सभी परीक्षण किए गए मानव प्रोटीन दृश्यों को बर्दाश्त करने में सक्षम थे; हालांकि, पैदावार विविध। इसी तरह के परखों में, मानव प्रोटीन दृश्यों युक्त सब्सट्रेट्स जब तक 63 अमीनो एसिड सफलतापूर्वक व्यक्त किए गए, शुद्ध, और गतिज विश्लेषण और अवरोधक स्क्रीनिंग49,50,51के लिए उपयोग किया गया. चूंकि असतत परख के लिए केवल थोड़ी मात्रा में सब्सट्रेट की जरूरत होती है, इसलिए बड़ी संख्या में लक्ष्यों का पता लगाया जा सकता है । प्रणाली का एक लाभ यह है कि सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स का उपयोग एसडीएस-पेज विश्लेषणों के लिए और अधिक विस्तृत गतिज विश्लेषणों (यानी आईसी50,केआई,केएम,वीमैक्स)के लिए किया जा सकता है। दवा की खोज के लिए, निरोधात्मक यौगिक फ्लोरोसेंट चढ़ाई में कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं । इस प्रकार, एक सतत परख के साथ संयोजन में असतत परख एक दरार या दरार के निषेध की पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है । असतत एसडीएस-पेज परख के लिए नमूने सीधे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में से लिए जा सकते हैं । कंपाउंड लाइब्रेरी स्क्रीनिंग५२के लिए सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स का इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, अतिरिक्त विश्लेषण ों के लिए निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि क्या एक सब्सट्रेट उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है जैसे कि जेड-फैक्टर53की गणना।

एक सब्सट्रेट डिजाइन करने में एक चुनौती कैंची बांड है कि बाध्य है और प्रोटीज़ से मांयता प्राप्त है चारों ओर क्षेत्र की पहचान है । यहां दिखाए गए उदाहरणों में, हमने 12 अवशेष दृश्यों के साथ शुरुआत की जो कैंची बांड के चारों ओर केंद्रित थे। स्क्रूटनी साइटों होमोलॉजी के अवशेषों के अनुक्रम संरेखण का विश्लेषण करने के बाद कैंची बांड के एन-टर्मिनल वीईवी प्रोटीज़ के लिए पाया गया था, जबकि जीकेवी के लिए कई सी-टर्मिनल अवशेषों को होमोलॉजी का रूप पाया गया था। डॉक्ड सब्सट्रेट के सिलिको मॉडल में साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जो सब्सट्रेट की बाध्यकारी साइटों की जांच करते हैं। चूंकि सब्सट्रेट और एंजाइम दृश्य प्लाज्मिड पर हैं, या तो सिलिको मॉडल या सबसाइट सहिष्णुता में परीक्षण करने के लिए उत्परिवर्तित किया जा सकता है। यदि बाध्य सब्सट्रेट (एस) की क्रिस्टल संरचना उपलब्ध नहीं है तो यह लाभप्रद हो सकता है।

SSHHPS विश्लेषण भी तंत्र है जिसके द्वारा वायरस प्रेरित फेनोटाइप वायरल एंजाइमों द्वारा उत्पादित कर रहे है के बारे में नई जानकारी उपज हो सकता है । ZIKV लक्ष्यों में से एक, SFRP1, WNt सिग्नलिंग मार्ग का हिस्सा है और मस्तिष्क और आंख दोनों के विकास में भूमिकाएं है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में36,37,54, 55,56,57. हमने पाया कि ZIKV ns2B/ns3 प्रोटीज़ द्वारा काटे जा सकने वाले अन्य प्रोटीन दृश्य भी मस्तिष्क और नेत्र विकास में शामिल प्रोटीन में थे; दोनों में असामान्यताओं जन्मजात Zika सिंड्रोम में मनाया गया है और वायरस का हिस्सा माना जाता है फेनोटाइप58प्रेरित .

मेजबान रोगजनक बातचीत की पूर्वानुमेयता अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए शोषण किया जा सकता है: लक्ष्य विशिष्ट कैंसरवायरल चिकित्सा; जीका वायरस के टीके को खतरे में डालना; पशु मॉडल का परिष्करण, भविष्यवाणी या चयन; मेजबान-रेंज या संवेदनशीलता की भविष्यवाणी; ज़ूनोटिक घटनाओं की भविष्यवाणी; और मेजबान सुरक्षा की भविष्यवाणी । चूंकि वर्णित विधियां अनुक्रम-आधारित हैं, इसलिए भविष्य में सॉफ्टवेयर में शामिल करने के लिए वे मूल्य के हो सकते हैं।

Disclosures

यहां व्यक्त राय लेखकों के उन है और अमेरिकी नौसेना, अमेरिकी सेना, अमेरिकी रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार के उन लोगों का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।

Acknowledgments

इस काम को रक्षा खतरा न्यूनीकरण एजेंसी (DTRA) परियोजना संख्या सीबी-बीज-SEED09-2-0061 और CBCall4-CBM-05-2-0019 द्वारा समर्थित किया गया था, और भाग में इंट्राम्यूरल/NCATS, NIH (XH) और नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला आधार कोष के Extramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

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References

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934 (2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894 (2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16 (2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347 (2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).

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इन विट्रो और सिलिको विधियों का उपयोग करके समूह चतुर्थ वायरल एसएचएचपीएस का विश्लेषण
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Hu, X., Compton, J. R., Legler, P.… More

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

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