Summary
ウイルス性ポリタンパク質に埋め込まれた相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチを同定するための一般的なプロトコルを提示する。SSHHPSはウイルスプロテアーゼによって認識され、いくつかのグループIVウイルスによって特定の宿主タンパク質の標的破壊を指示する。
Abstract
アルファウイルス酵素は、単一のポリペプチド中で合成される。非構造性ポリタンパク質(nsP)は、ウイルス複製に不可欠な活性酵素を生成するために、そのnsP2システインプロテアーゼによって処理されます。ウイルスプロテアーゼは、非常に特異的であり、保存された切断部位モチーフ配列(〜6〜8アミノ酸)を認識する。いくつかのグループIVウイルスでは、nsPプロテアーゼ(複数)切断部位モチーフ配列は、自然免疫応答の生成に関与する特定の宿主タンパク質で見つけることができ、場合によっては、標的タンパク質がウイルス誘発表現型に関連しているように見える。これらのウイルスは、相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチを利用して、宿主タンパク質の標的破壊を行う。SSHHPSを同定するために、ウイルスプロテアーゼ切断部位モチーフ配列をBLASTに入力することができ、宿主ゲノムを検索することができる。切断は、最初に大腸菌で作られた精製nsPウイルスプロテアーゼおよび蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)基質を用いて試験することができる。FRET基質は、シアンおよび黄色蛍光タンパク質および切断部位配列(CFP配列-YFP)を含む。このプロテアーゼアッセイは、プレートリーダーで連続的に使用することも、SDS-PAGEゲルで不連続に使用することもできます。結合ペプチド基質のモデルは、基質選択および突然変異誘発研究を導くためにシリコで生成することができる。CFP/YFP基質は、プロテアーゼ阻害剤を同定するためにも利用されている。これらのin vitroおよびin silico法は、標的宿主タンパク質がウイルス複製に影響を与えるかどうかを決定するために、細胞ベースのアッセイと組み合わせて使用することができます。
Introduction
ウイルスから宿主、または宿主からウイルスへの水平遺伝子導入の証拠は、種々のゲノム1、2、3、4で見つけることができる。ウイルス内因性化の例は、細菌宿主ゲノム4に見られるCRISPRスペーサー配列である。最近、(+)ssRNAグループIVウイルスの非構造性ポリタンパク質に埋め込まれた宿主タンパク質配列の証拠が見つかりました。ウイルスゲノムのコード領域内でこれらの配列を世代的に伝播させることができる。相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチは、ウイルスおよび宿主5、6に見出される。SSHHPSは、特定の宿主タンパク質に相同性を有するウイルスプロテアーゼによって認識される保存された切断部位モチーフ配列である。これらの配列は、特定の宿主タンパク質の破壊を指示する。
前回の出版物6では、ウイルスプロテアーゼの標的となったすべての宿主タンパク質のリストをまとめ、標的のリストが非ランダムであることを発見した(表1)。2つの傾向が明らかになった。まず、宿主タンパク質を切断したウイルスプロテアーゼの大部分は、グループIV型ウイルス(25例中24例が第4種ウイルスプロテアーゼを含む)に属し、かつ1つのプロテアーゼが(+)ssRNA群VIレトロウイルス(HIV、ヒト免疫不全ウイルス)7に属していた。第二に、ウイルスプロテアーゼによって切断される宿主タンパク質標的は、一般に、切断が宿主の免疫応答に拮抗することを意図していることを示唆する自然免疫応答の生成に関与していた。ウイルスプロテアーゼを標的とする宿主タンパク質の半数は、インターフェロン(IFN)および炎症性サイトカインを生成するシグナル伝達カスケードの既知の成分であった(表1)。他の宿主細胞転写8、9、10または翻訳11に関与した。興味深いことに、Shmakov et al.4は、多くのCRISPRプロトスペーサー配列がプラスミド結合または複製4に関与する遺伝子に対応することを示している。
第4族は、とりわけ、フラビウイルス科、ピコルナビリダ科、コロナウイルス科、カルシウイルス科、およびトガウイルス科を含む。ジカウイルス(ZIKV)、西ナイル(WNV)、チクングニア(CHIKV)、重症急性呼吸器症候群ウイルス(SARS)および中東呼吸器症候群ウイルス(MERS)などのグループIVに属するいくつかの新しい新しい病原体。(+)ssRNAゲノムは本質的にmRNAの一部である。ゲノム複製に必要な酵素を作製するには、まず(+)ssRNAゲノムを翻訳する必要があります。アルファウイルスおよび他のグループIV型ウイルスでは、複製に必要な酵素が単一のポリタンパク質(すなわち、VEEVの場合はnsP1234)で産生される。非構造性ポリタンパク質(nsP)は、nsP2プロテアーゼによってタンパク質分解能処理される(nsP1234 nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)活性酵素12を生成する(図1)。nsP2プロテアーゼによるポリタンパク質の切断は、ウイルス複製に不可欠です。これは、nsP2プロテアーゼ13、14の活性部位システインの欠失および部位特異的突然変異誘発によって実証された。特に、ウイルスタンパク質の翻訳はゲノム複製イベントに先行します。例えば、nsP4は(+)ssRNAゲノムを複製するのに必要なRNA依存性RNAポリメラーゼを含む。ゲノム複製はdsRNA中間体を産生することができる。これらの中間体は、宿主の自然免疫応答を引き起こす可能性があります。したがって、これらのウイルスは、感染の早期に宿主の自然免疫応答タンパク質を切断し、その効果を抑制するために15、16、17を抑制し得る。
サイレンシングは、DNA、RNA、およびタンパク質のレベルで発生する可能性があります。図1に示す各サイレンシング機構に共通しているのは、短い外来DNA、RNA、またはタンパク質配列が、その機能に拮抗するために特定の標的の破壊を導くために使用されることです。サイレンシングメカニズムは、3つの異なる言語で書かれた「検索と削除」プログラムに似ています。短い切断部位配列は「キーワード」に類似している。各プログラムには、短いシーケンス (「キーワード」) と削除される 「ファイル」内の単語との一致を認識する酵素があります。一致が見つかると、酵素は大きなターゲット配列をカット(「削除」)します。図 1に示す 3 つのメカニズムは、ホストをウイルスから防御したり、ホストの免疫系からウイルスを防御したりするために使用されます。
ウイルスプロテアーゼは、〜2〜11アミノ酸間の短い切断部位モチーフ配列を認識します。ヌクレオチドでは、これは6〜33塩基に対応するであろう。比較のために、CRISPRスペーサー配列は〜26〜72ヌクレオチドであり、RNAiは〜20〜22ヌクレオチド18、19である。これらの配列は比較的短いが、具体的に認識することができる。アミノ酸の多様性が高いことを考えると、6~8アミノ酸以上のタンパク質配列を認識するウイルスプロテアーゼに対して、ランダム切断事象の確率は比較的低い。宿主タンパク質中のSSHHPSの予測は、検査中のウイルスプロテアーゼの特異性に大きく依存する。プロテアーゼが厳密な配列特異性要件を持っている場合、切断部位配列を見つける可能性は6400万で1/206 = 1、1/208 = 1 256億で;しかしながら、ほとんどのプロテアーゼは可変サブサイト公差を有する(例えば、RまたはKはS1部位で許容され得る)。したがって、ホストで検出されたシーケンスとウイルスの間のシーケンス ID の要件はありません。より緩い配列要件を有するウイルスプロテアーゼ(ピコルナビリダエに属するものなど)の場合、宿主タンパク質中に切断部位を見つける確率は高くなる可能性がある。表1のエントリの多くは、ピコルナビリダ科のものです。
シェヒター&ベルガー表記20は、プロテアーゼ基質およびそれらが結合するサブサイトにおける残基を記述するために一般的に使用され、我々はこの表記法を全体に利用する。生体結合のN末端である基板中の残基はP3-P2-P1と表記され、C末端である残基はP1'-P2'-P3'と表記されます。これらのアミノ酸残基を結合するプロテアーゼ中の対応するサブ部位は、それぞれS3-S2-S1およびS1'-S2'-S3'である。
標的とされている宿主タンパク質を特定するために、ウイルス性ポリタンパク質切断部位でSSHHPSを同定し、それらを含む宿主タンパク質を探します。本明細書では、既知のウイルスプロテアーゼ切断部位配列を用いてSSHHPSを同定するための手順を概説する。バイオインフォマティクス法、プロテアーゼアッセイ、および記載のシリコ法は、細胞ベースのアッセイと組み合わせて使用することを意図している。
ウイルスプロテアーゼを標的とする宿主タンパク質の配列アライメントは、これらの短い切断部位配列内の種特異的な相違を明らかにした。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)nsP2プロテアーゼは、ヒトTRIM14、三者間モチーフ(TRIM)タンパク質6を切断することが分かった。いくつかのTRIMタンパク質は、ウイルス制限因子(例えば、TRIM5α21)であり、ほとんどがユビキチンE3リガーゼであると考えられている。TRIM14は、RING(本当に興味深い新しい遺伝子)ドメインを欠き、E3リガーゼ22であるとは考えされていません。TRIM14は、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達薬(MAVS)22においてアダプタであることが提案されているが、他の抗ウイルス機能を有していてもよい23。様々な種からのTRIM14配列のアライメントは、馬が切断部位を欠き、C末端PRY/SPRYドメインが欠落しているTRIM14の切り捨てられたバージョンを収容することを示しています。このドメインには、ポリユビキチン化サイトが含まれています (図 2)。馬では、これらのウイルスは非常に致死性(〜20〜80%の死亡率)であるのに対し、ヒトではVEEV感染24から死ぬのはわずか1%である。PRY/SPRYドメインの切断は、MAVSシグナリングカスケードを一時的に短絡し得る。このカスケードはdsRNAによって引き起こされ、インターフェロンおよび炎症性サイトカインの産生につながる。したがって、SSHHPSの存在は、どの種が特定のグループIVウイルスに対する防御システムを有するかを予測するのに有用であり得る。
グループIVウイルスでは、IFN拮抗メカニズムは冗長25を掛けると考えられている。宿主タンパク質の切断は、感染中に一過性であり、濃度は時間の経過とともに回復することがある。TRIM14切断産物は、プロテアーゼ(サイトメガロウイルスプロモーター)をコードするプラスミドでトランスフェクション(6時間)の後に非常に早期に検出できることを細胞で発見した。しかし、より長い期間では、切断産物は検出されなかった。ウイルス感染細胞では、動態が異なり、切断産物は6〜48時間6の間で検出することができた。他の人は、早期に3-6時間ポスト感染9、11として宿主タンパク質切断産物の出現を報告している。
細胞内のタンパク質分解活性は、多くの場合、捕まえるのが困難です。切断製品は、その溶解性、濃度、安定性、および寿命が変化する可能性があります。細胞ベースのアッセイでは、切断産物が細胞内に蓄積したり、切断タンパク質とカットタンパク質のバンド強度が、切断タンパク質が非常に迅速に分解され、予想される分子量(MW)でウェスタンブロットで検出できない可能性があるため、切断産物が細胞内に蓄積されると仮定することはできません(例えば、エピトープを含む領域は、他の宿主によって切断され得る)。ウイルスプロテアーゼの基質が自然免疫応答タンパク質である場合、その濃度は感染時に変化し得る。例えば、一部の自然免疫応答タンパク質は、ウイルス感染の前に存在し、インターフェロン26によってさらに誘導される。したがって、標的タンパク質の濃度は、感染中に変動し、未感染細胞リサートと感染した細胞リサートの比較は解釈が困難な場合がある。さらに、すべての細胞が均一にトランスフェクトまたは感染しないことがある。一方、大腸菌由来の精製タンパク質を用いたインビトロプロテアーゼアッセイは、免疫ブロットではなくSDS-PAGEを用いて制御やアッセイを制御する変数が少なくなっています。汚染プロテアーゼは、CFP/YFP基質のタンパク質精製の初期段階で阻害することができ、変異したウイルスプロテアーゼを精製し、切断がウイルスプロテアーゼまたは汚染細菌プロテアーゼによるものかどうかを判断するための制御として試験することができる。
インビトロプロテアーゼアッセイの1つの制限は、哺乳動物細胞の複雑さを欠いているということです。酵素がその基質を切断するには、2つを共に局在させる必要があります。第4族ウイルスプロテアーゼは構造と局在化が異なる。例えば、ZIKVプロテアーゼは小胞体(ER)膜に埋め込まれ、細胞質に面するのに対し、VEEV nsP2プロテアーゼは細胞質および核27中の可溶性タンパク質である。ZIKV SSHHPS分析で見つかった切断部位配列のいくつかは、いくつかの標的に対して切断が共翻訳で起こりう可能性があることを示唆するシグナルペプチドにあった。したがって、細胞内のプロテアーゼおよび基質の位置も、これらの分析において考慮する必要がある。
細胞ベースのアッセイは、感染において同定された宿主タンパク質の役割を確立するために貴重であり得る。プロテアーゼ阻害剤6または宿主標的16への突然変異などの宿主タンパク質のウイルスプロテアーゼ切断を停止することを目的とする方法は、ウイルス複製に対するそれらの影響を調べるために使用することができる。標的タンパク質の過剰発現はまた、ウイルス複製28に影響を及ぼし得る。プラークアッセイまたは他の方法は、ウイルス複製を定量するために使用することができる。
Protocol
1. バイオインフォマティクス:BLASTを用いた宿主ゲノムにおけるSSHHPSの同定
注:プロテインBLASTはblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで見つけることができます。
- ウイルス性ポリタンパク質中の生体結合を取り巻く約20アミノ酸を入力する。非冗長タンパク質配列を選択し、検索する宿主ゲノムにタイプを入力します(例えば、ホモ・サピエンス)。
- 必要に応じて、PHI-BLAST を選択します。パターン配列を入力します(例えば、以下に示すV12の25残基については、引用符なしでパターン「AG」を入力します)。
注:PHI-BLAST において、角括弧[XY]は、アミノ酸XまたはYがサブサイト位置(例えば、AG[AC][GAY])にできることを示す。 - BLASTの結果を検査し、ポリタンパク質切断部位に保存されている残基に対して高い配列同一性を有するヒットを同定する(例えば、三者間モチーフタンパク質14)(図3)。
注:セリンプロテアーゼの場合、P1残基のより高い保存が期待される一方、システインプロテアーゼに対しては、P2残基のより高い保存が期待される。 - 切断部位配列と同一で、順番に並んでいる残基に色を付けます(ギャップなし)。サブサイトで許容される残基を着色するが、第2の色で異なる切断部位に存在する。
注:ウイルス切断部位に存在しない保存的置換(例えば、Leu対Val)を表す残基も、ウイルスプロテアーゼによって認識され得るし、または認識されない場合がある。 - ランク順序は、切断部位配列に一致する連続した同一または許容残基の数に基づいてBLASTがヒットする。リストから、プロテアーゼアッセイにおける分析のために≥6同一または類似の残基を含むタンパク質を選択します。
- 他の切断部位(nsP2/3、nsP3/4など)に対してこの手順を繰り返し、PHI-BLASTパターンに保存性の高い残基を追加して、徐々に予測を強化します。
- 必要に応じて、PHI-BLAST を選択します。パターン配列を入力します(例えば、以下に示すV12の25残基については、引用符なしでパターン「AG」を入力します)。
2. インビトロアッセイ:プロテアーゼ基板の設計と準備
- シアン蛍光タンパク質(CFP)をコードするプラスミドを構築し、切断部位配列の≤25アミノ酸、続いて黄色蛍光タンパク質(YFP、金星29とも呼ばれる)を構築する。
注:プラスミドは、配列およびライゲーション独立クローニング(SLIC)30または市販遺伝子合成を用いて構築することができる。図4に示す配列を含むpet15bプラスミドを市販して合成し、ここで使用した。- 基質の長さを最適化するために、2フラグメントSLIC反応を用いて天然ウイルスポリタンパク質切断部位配列の12〜25アミノ酸を含む追加の可変長FRET基質を構築する。SDS-PAGEゲルベースのアッセイを用いた切断を解析するか、以下の方法を用いて定常運動パラメータを測定する。
注:場合によっては、切断部位は、既知の切断部位31に対する相同性によって同定することができる。ポリタンパク質接合配列を含む基質の切断が観察されない場合、追加の残基または構造モチーフ(例えば、αらせん32)の要件がある場合がある。あるいは、精製されたウイルスプロテアーゼは不活性であってもよい。SSHHPS分析を追求する前に、ウイルス性ポリタンパク質配列の切断を確認します。基質中の残基数は、可変長基質(12〜25アミノ酸)を用いてVEEVプロテアーゼ用に最適化され、続いてVmaxおよびKm32、33の分析を行った。実施例で使用されるジカウイルスns2B/nsBプロテアーゼ切断部位は、34、35として公開されている。
- 基質の長さを最適化するために、2フラグメントSLIC反応を用いて天然ウイルスポリタンパク質切断部位配列の12〜25アミノ酸を含む追加の可変長FRET基質を構築する。SDS-PAGEゲルベースのアッセイを用いた切断を解析するか、以下の方法を用いて定常運動パラメータを測定する。
- BL-21(DE3)の8-20°Lを新たに変換してCFP/YFP基板を準備するE. coli50 μg/mL アンピシリン (37 °) を含むルリア ベルタニ (LB) 寒天プレート上のメーカーの指示とプレートに従って CFP-V12-YFP プラスミドを有する有能な細胞。
- 250 mL フラスコにLBメディア(フラスコあたり1.5Lメディア)と100 mLのLBを含む4つの4つのLフラスコをオートクレーブ。各フラスコをアルミホイルでキャップします。
- 新たに変換された細菌のコロニーで100mL培養物を接種し、一晩振とう(200rpm)で37°Cで成長する。
- CFP/YFP基板を作るために、4つの4つのLフラスコを25mLの一晩培養で接種する。37°Cで培養物の振とうを始め、1時間に600nmでUV-vis分光法で成長を監視します。
- 細菌が600nm(約3〜4時間の成長)で〜1.0の吸光度に達すると、フラスコあたり1Mイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)の0.5 mLを加えてタンパク質発現を誘導する。IPTGを加えた後、振とうインキュベーターの温度を17°Cに下げ、17〜20時間一晩続ける発現を可能にする。
- 7,000 x gの高速遠心分離機を使用して細菌をペレットに10分間(4°C)させ、ペレットを保持します。液体媒体を取り外して廃棄します。ペレットを-80°Cで保管するか、直ちにlyseに保管してください。
- 50 mM Tris pH 7.6、500 mM NaCl、35 mLの細菌タンパク質抽出試薬、30mgのリソザイム、25UのDNase、および1プロテアーゼ阻害剤錠剤を含む100mLのリシス緩衝液を調製する。ピペットでリシスバッファー内のペレットを再スムードし、〜25-35 mLを50 mLの使い捨て円錐管に移します。
- 氷水を含むプラスチック製のビーカーにチューブを入れます。超音波処理器の先端をチューブに挿入して、先端がチューブの底部から約1cmになるようにし、リサートが流体になって液化するまで15s間隔でレベル5で10〜20回リサートを超音波処理します。
注:超音波処理中に聴覚保護を使用してください。 - lysateを高速遠心管に移し、遠心分離機を20,500 x gで4°Cで30分間移します。スピン後、上清(約100mL)を保持し、清潔なボトルに移します。ペレットを捨てます。
- バッファAの1 L(50 mMトリスpH 7.6、500 mM NaCl)を準備します。バッファー B の 300 mL を準備します (50 mM トリス pH 7.6, 500 mM NaCl, 300 mM イミダゾール).
- バッファAの3列容積と5 mL/分の流量を使用して、100 mLニッケルカラムを平衡化します。
- 流量2~5mL/分を使用してニッケルカラムに溶解物をロードします。20%バッファーB洗浄中、280nm(A280)での吸光度は、洗浄中にカラムから溶出する汚染物質として増加します。溶出物のA280がベースライン値に戻るまで、カラムの洗浄を続けます。
- 2-5 mL/minの流量を使用して、100%バッファーBの2-3カラム体積でタンパク質を溶出し、10 mLの分数を収集します。各分数のA280を測定します。
- 15 mL遠心限外濾過ユニットを使用して、A280 > 0.1 を含む画分を組み合わせて濃縮します。限外濾過ユニットを5,000 x gで15分間回転させ、体積が~50~75mLになるまで分数を加え続けます。
- 6-8 kDaの分子量カットオフ(MWCO)で14インチの透析チューブをカットします。透析チューブを沸騰させて300mLの水に10分間完全に沈み、膜の一端に安全な結び目を結びます。袋に透析バッファを詰め込み、ひび割れや漏れがないようにします。袋からバッファを取り出し、袋を透析バッファーに沈めたままにしておきます。
- 濃縮タンパク質を2.2.13からプラスチックピペットで透析袋に移します。袋から気泡を取り除きます。2 番目のノットまたは透析クリップでバッグを閉じます。50 mMトリスpH 7.6、5 mM EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)の500 mLに対してタンパク質を透析し、500 mLで250 mM NaClを4°Cで一晩等級シリンダーに入れます。
- タンパク質を50mMトリスpH7.6の500 mLに対して2回透析し、2時間。
- 陰イオン交換カラムの場合、バッファA(50mM Tris pH 7.6)および500 mLバッファB(50mMトリスpH 7.6、1.0 M NaCl)の500mLを用意します。バッファA(2-5 mL/分)の3列の容積を持つ30 mLアニオン交換カラムを平衡化します。
- 透析袋からタンパク質を取り出し、ボトルに移します。瓶を氷の上に置いておきなさい。透析タンパク質をカラムにロードします(2-5 mL/分)。
注:CFP/YFPタンパク質はカラムを結合し、外観が黄色になります。 - A280がベースライン(5 mL/min)に戻るまで、バッファ A でカラムを洗浄します。勾配(0-50%バッファーB、100 mL)を使用してタンパク質を溶出し、10 mLの画分を収集します。
- SDS-PAGE を使用して列分数を調べます。>95% 純粋なものを組み合わせます。
- タンパク質を15mL遠心限外濾過ユニットを使用してA 280~10-20に濃縮します。4°Cで4,500 x gでコンセントレータを10分間回転させ、タンパク質含有画分がすべて組み合わされるまでタンパク質を加え続けます。
- 透析袋からタンパク質を取り出し、ボトルに移します。瓶を氷の上に置いておきなさい。透析タンパク質をカラムにロードします(2-5 mL/分)。
- ピペットで濃縮器からタンパク質を慎重に取り除きます。タンパク質を1.5mLマイクロ遠心管にアリコートし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、-80°Cで長期保存します。使用前に適切なアッセイバッファーを平衡化したPD-10カラムを用いて室温でタンパク質を緩衝交換する。
- ビールの法則を使用して、A280と計算された消滅係数(例えば、V12基板の場合は、47,790 M-1 cm-1)を使用してタンパク質濃度を計算します。
注:絶滅係数(・https://web.expasy.org/protparam/)を用いて図4のタンパク質配列から計算できます。
3. アルファウイルスnsP2システインプロテアーゼの調製
- プロテアーゼをコードするプラスミドを設計および構築する。システインプロテアーゼの場合は、pet32プラスミドを使用してチオレドキシン(Trx)融合タンパク質を構築します。
メモ：pet32プラスミドは、チオレドキシンおよびヒスタグを除去するためのトロンビン切断部位(LVPRGS)をコードする(図 5).チオレドキシンは、発現中に還元状態で活性部位システインを維持するのに役立つ。セリンプロテアーゼの場合、チオレドキシンは必要とされず、トロンビンによる除去を伴うステップは省略できる。VEEV nsP2プロテアーゼ配列をpet32bプラスミドに組み込み、セレクト剤の取り扱いを避けるために市販品を調製した。- メーカーの指示に従って、プラスミドDNAをBL21(DE3)pLysS大腸菌に新たに変換します。アンピシリンを含むLB寒天プレートに細菌をプレートします。
注:クロラムフェニコールは、pLysSプラスミドを運ぶ大腸菌株にのみ使用され、BL21(DE3)細胞を使用する場合は省略されます。このステップでは、LB寒天プレートにクロラムフェニコールを含める必要はありません。 - 250 mL フラスコに 1.5 L の LB メディア (6 L 総ボリューム) と 100 mL の LB の 4 つの L フラスコ 4 つの 4 L。各フラスコをアルミホイルでキャップします。
- プレートからのコロニーでLB/アンピシリンの100 mLの一晩培養を接種し、37°Cで揺れるインキュベーター(200 rpm)で成長する。
- 一晩培養の25 mLで4Lフラスコを接種し、適切な抗生物質を加える。
注:PET32プラスミドを運ぶBL21(DE3)pLysS細胞の媒体は、25μg/mLクロラムフェニコールと50 μg/mLアンピシリンの最終濃度を有する必要があります。 - 600nmでの吸光度が1.0に達したときに培養物に0.5mLのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導する。振とうインキュベーターの温度を17°Cに下げます。式を一晩 (~17 時間) 続けることを許可します。
- 遠心分離によって細胞をペレット(4°Cで10分間7,000 x g)。液体メディアを取り外して廃棄します。
注:ペレットは-80°Cで数ヶ月間保存するか、すぐにlysedすることができます。 - 溶解緩衝液の100 mLを調製する(50 mM Tris pH 7.6、500 mL NaCl、2 mM βメルカプトエタノール(BME)、30mgリソチーム、5%グリセロール、25 U DNase、35 mL細菌タンパク質抽出試薬)。添加時に化学フードにBMEのボトルを開きます。これ以降のすべてのステップのために、氷または4 °Cで細菌のリサートを保ちます。
注:システインプロテアーゼの場合、2mM BMEは、求核性システインを減少させ続けるために含まれる。カラムは、冷却されたバッファを使用して室温で実行できます。緩衝液は、4°Cに冷却された冷たい脱イオン水で作られるべきです。 - リシス緩衝液の約25mLで細菌ペレットを再懸濁し、4 x 50 mLの使い捨て円錐管にリサートの〜25 mLを移します。氷水を含むプラスチックビーカーにチューブを入れます。15 s間隔でレベル 5 で 10 回リサートを超音波処理します。
- 高速遠心管にリサートを移します。遠心分離によってリサートを明らかにする(30分、4°Cで20,500 x g)。
- バッファーA(50mMトリスpH 7.6、500 mM NaCl、5%グリセロール、2 mM BME)を調製し、4°Cまで冷やします。
- バッファーB(50 mMトリスpH 7.6、500 mM NaCl、5%グリセロール、2 mM BME、300 mM イミダゾール)を250mL調製し、4°Cまで冷やします。
- バッファAの3列容積を有する50 mLニッケルカラムを平衡化し、2-5 mL/分でカラムに透明化されたリサートをロードし、ペレットを廃棄します。
- 20%バッファB(60 mM イミダゾール)を含むバッファAの5カラムボリュームの後に、2カラム(2-5 mL/min)を洗浄します。タンパク質(5 mL/min)を100%バッファーBで溶出し、10mLの画分を集めます。
- 15 mL遠心限外濾過ユニットを使用し、4°Cで5,000 x gで15分スピンを使用して、A280 ≥ 0.1を有するプロテアーゼを含む画分を組み合わせ、濃縮します。体積が〜5mLに減少した後、タンパク質に新鮮な透析バッファー(50 mM Tris pH 7.6、250 mM NaCl、5 mMジチオトライトール(DTT)、1 mM EDTA、5%グリセロール)を加えて濃度単位内のタンパク質を緩衝交換する。4 °Cで5,000 x gで再び15分間スピン;バッファ交換ステップを2~3回繰り返します。透析の前にタンパク質にトロンビン(1単位/μLの20°L)を加え、チオレドキシンとHisタグを除去します。
- タンパク質を透析袋に移し、500 mLの等級シリンダーで500mLの透析バッファー(4°)に対して透析液を一晩で下します。
注:FPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィー)システムとニッケルカラムは、陰イオン交換カラムに進む前にストリッピングバッファ(2 M NaCl、50 mM EDTA)で完全に洗浄する必要があります。FPLC ラインに残留ニッケルを加えると、混合時に DTT ブラウンを含むバッファー溶液が回転します。ニッケルカラムとFPLCシステムを4カラムの水で洗浄します。ポンプは、水で徹底的にFPLCシステムを洗浄します。ニッケルカラムは、その後の精製のために樹脂上に0.2 M硫酸ニッケルの2カラム容積を流すことによって再生することができます。
- メーカーの指示に従って、プラスミドDNAをBL21(DE3)pLysS大腸菌に新たに変換します。アンピシリンを含むLB寒天プレートに細菌をプレートします。
- アニオン交換カラムの場合、バッファAの1L(50 mMトリスpH 7.6、5 mM DTT、5%グリセロール)を調製します。
- バッファー B の 0.5 L を準備します (50 mM トリス pH 7.6, 5 mM DTT, 5% グリセロール, 1.25 M NaCl)
- バッファ A (3 列のボリューム、2 ~ 5 mL/分) で 30 mL のアニオン交換列を平衡化します。流れの収集のための分数コレクターに管を置きます。
注:VEEVプロテアーゼは、8.7の計算された等電点(pI)を有し、カチオン交換カラムを結合しますが、アニオン交換カラムを流れます。pIは、Expasy ProtParamプログラム(https://web.expasy.org/protparam/)を使用してタンパク質配列から計算することができます。 - 透析タンパク質をバッファー A で 1:3 希釈し、タンパク質をロードします (5 mL/分)。10 mL の分数でフロースルーを収集します。
- FPLC システムからアニオン交換カラムを取り外します。カチコン交換列を FPLC システムに接続します。30 mL のカチカチ交換カラムをバッファー A (5 mL/min) の 3 列のボリュームで平衡化します。
- 2-5 mL/minのカチオン交換カラムにアニオン交換カラムのフローをロードします。100 mL勾配(0-50%バッファーB)でタンパク質を溶出し、10 mLの分画を収集します。
注:VEEVプロテアーゼは約0.6 M NaClで溶出します。 - SDS-PAGE を使用して列分数を調べます。15 mL遠心限外濾過ユニットを使用して、純粋で280 ≥2に濃縮された画分を組み合わせます。酵素は液体窒素中でフラッシュ凍結し、-80°Cで保存することができる。
- 2-5 mL/minのカチオン交換カラムにアニオン交換カラムのフローをロードします。100 mL勾配(0-50%バッファーB)でタンパク質を溶出し、10 mLの分画を収集します。
4. プレートリーダーを用いた酵素の継続的なアッサリング
- 50 mL のアッセイ バッファーを準備します (50 mM HEPES pH 7.0)。
- アルファウイルスプロテアーゼは比較的低いk猫値を有するので、アッセイバッファー内の酵素を4.7μMに希釈する(これは、Trxを使用しないVEEVプロテアーゼのA280 = 0.2にほぼ対応する)。
- 酵素の活性を測定するために、185μMの濃度でアッセイバッファーに基質のストックを調製する。これは、ほぼ A280 = 9 に対応します。8マイクロ遠心管で、185μM基板ストックおよび緩衝液の適切な容積を組み合わせて表2に示す反応ミックスを調製する。黒い半面積96ウェルプレートピペット45μLで反応が3つのウェル(カラム1、2、3)に混合される。行 A には [S] = 5 μM 反応ミックスを含み、行 H には [S] = 140 μM 反応ミックスが含まれている必要があります。
- 固定光電子増倍管(PMT)設定(例えば、低い)を持つ2つの波長で同時に蛍光を検出するようにプレートリーダーを設定します。
波長 1 励起 = 434 nm,放出 = 527 nm
波長 2 励起 = 434 nm,放出 = 470 nm - 読み取り時間を 20 分 (1 分あたり 1 回の読み取りを測定) に設定し、読み取るウェルを選択します。プレートリーダーにプレートを挿入し、20分間の加水分解の自発速度を測定します。
- 「UNCUT」基板を含むプレートのエンドポイント読み取りを実行します。
注:これらの値は、後続のデータ計算で使用されます。3つの井戸からの発光比の平均は、表3のt=0における「UNCUT」基板の値となる。 - プレートとピペット5°Lの酵素を各ウェルに取り出します。1分間に1回読み取り、20分間プレートをもう一度読んでください。プレートリーダーを絶対値を出力するように設定します。
注:このアッセイでは、斜面は負になります。各井戸には50°Lの総容積が含まれます。 - 読み取りの最後に、蒸発を防ぐためにフィルムでプレートを密封します。プレートを室温に一晩放置して、酵素が基板を完全に切断できるようにします。
- 〜24時間後、シールフィルムを取り外し、前のプレートと同じPMTを使用してプレートの端点読み取りを行う。これらの発光率を平均し、「CUT」の下の表3に入力します。後述するSDS-PAGE不連続アッセイを用いて基板の切断を確認する(ステップ5.1.)。
- データをスプレッドシートにエクスポートします。2波長について各時点で蛍光単位を出力する(表4)。
- Xが所定の時点における発光比(527 nm/470 nm)、ネグがt=0の「UNCUT」基板の発光比、posが24時間の切断後に測定した完全に「CUT」基板の発光比である式(1)を用いて、時間tで切断された基板のnmolを計算する(表3)。
注:代表的な蛍光データは、表4に80μM基板(ウェル当たり4nmolのS)を含む1つのウェル(ウェルE7)について示されている。計算は、プレート内の各ウェルに対して行われました。 - 井戸ごとに、nmol対時間(分)をプロットし、y = mx + bにデータを当てはめることによって初期速度(勾配)を得る。4.1.5で収集されたデータについて、各ウェルのnmol対時間(分)をプロットします。傾斜は、毎分生産nmol製品に等しくなります。酵素触媒反応率から4.1.5で測定した加水分解の自発率を差し引く(表5)。
注:プレートがプレートリーダーに移動したために実際に高い場合、最初の読み取りはデータから切り取ることができます。 - 各ウェルに添加した酵素量をmgで計算する(例えば、0.0009 mg)。単位は、毎分生産される製品のμmol(μmol/min)として定義されます。井戸に存在する酵素のmgでnmol/minを割り、mU/mgを得る。1,000 で除算して U/mg を取得します。
- x軸に[S]μMをプロットし、Y軸にU/mgをプロットし、そのデータをミカエリス・メンテン方程式に適合させ、VmaxとKmを得る。これは、ソフトウェア(例えば、GraFit)で行うことができます。
5. SDS-PAGE分析を用いた酵素の不連続なアッベル
- 酵素と標識の代わりに10μMの基質と緩衝液を含む50μL反応を「UNCUT」として調製します。
注:基板およびバッファの体積を表2に示す。連続アッセイが実行されている場合、サンプルは96ウェルプレートから直接使用することができます。- 10μM基質と5μL酵素を含む50μL反応を調製し、「CUT」とラベルを付けます。酵素が基質に加されたときにタイマーを開始します。
注:阻害剤は、酵素および基質を含む追加のチューブに添加することができる。追加されたバッファーの体積を調整して、阻害剤の追加体積を補正します。DMSOの濃度は2%を超えるべきである。 - 室温(22±3°C)で~15〜24時間の反応をインキュベートします。2x Laemelliバッファーの50 μLを加えて反応を停止します。反応沸騰を停止した後、各チューブを3〜10分間行う。
- メーカーの指示に従ってゲルタンクを組み立てます。17ウェルプレキャスト12%ポリアクリルアミドゲルカセットとバッファダムを反対側に挿入します。バッファーがカセットの上部に達するまで、セルの内部貯蔵所に 1x SDS ランニング バッファーを埋めます。外部貯蔵所を同じバッファで半分いっぱいにします。
- 不連続アッセイを用いて切断を解析するには、各反応混合物の5μLを「UNCUT」反応から始まるSDS-PAGEゲルのレーンにロードする。最初または最後のレーンに分子量マーカーを含めます。
- ゲルタンクの電極を電源に取り付け、110 Vで60分間分離します。プラスチックトレイにゲルを入れ、ゲル染色溶液の5〜10 mLにゲルを沈めます。バンドは30分以内に表示されます。1~24時間後に余分な汚れを取り除き、ゲルを水に沈め、ゲルイメージャーを使用してゲルの写真を撮ります。
- 10μM基質と5μL酵素を含む50μL反応を調製し、「CUT」とラベルを付けます。酵素が基質に加されたときにタイマーを開始します。
6. VEEV-nsP2システインプロテアーゼへの基質ペプチドのドッキング
- PDB(https://www.rcsb.org/)から VEEV システインプロテアーゼの座標ファイルをダウンロードします。PDB コードは 2HWK です。ファイルを 2HWK.pdb という名前で保存します。
- MOE ( https://www.chemcomp.com/ ) を使用してタンパク質構造を準備します。プロテイン PDB ファイルを MOE にロードします。右側のバーの[選択と溶媒]をクリックし、溶剤を削除します。
- 上部のメニューバー 「タンパク質」から「構造準備」パネルを開きます。[修正] をクリックしてすべての構造項目を自動的に修正し、Protonate3Dをクリックして構造をプロトネートします。部分電荷パネルを開き、アンバー99を選択し、必要に応じて水素とローンのペアを調整することにより、タンパク質に部分的な電荷を追加します。最後に、構造ファイルを "2HWK_dock.pdb" という名前で保存します。
- MOEを使用して、基質ペプチド(nsP12、nsP23、nsP34)およびTRIM14の構造を構築します。プロテインビルダーパネルを開き、基板シーケンスを入力し、ジオメトリを拡張として設定し、「ビルド」をクリックします。構造が MOE ウィンドウに表示されます。
- パネルの[最小化]をクリックして、ペプチド構造を最小化します。構造を PDB ファイルとして保存します (図 6)。
- PyRx/オートドック 4.2 (http://autodock.scripps.edu/) を使用して、基質ペプチドを VEEV-nsP2 にドッキングします。PyRxツールを開き、環境設定を編集し、リガンド準備のすべてのトーションを無効にします。基板分子をロードし、ナビゲータパネルで分子名を右クリックし、「リガンドを作成」を選択してリガンドドッキングファイルを準備します。タンパク質2HWK_clean.pdb をロードし、[高分子を作成する] を選択して pdbqt ドッキング ファイルを準備します (図 7)。
- 下部のドッキング パネルでAutoDock ウィザードを起動します。調製したリガンドおよびタンパク質ファイルを選択します。触媒残基Cys-477を中心とするグリッド寸法を手動で調整してタンパク質結合ポケットを定義します。既定の間隔パラメータ 0.375 Å を使用して、[オートグリッドの実行] をクリックしてグリッド マップを生成します。
- AutoDock を実行し、ラマルキア遺伝的アルゴリズム (LGA) メソッドを選択します。[ドッキング パラメータ]をクリックし、[GA 実行数]を50 に設定します。他のパラメータにはデフォルトのパラメータを使用します。[進む] をクリックして、ドッキングの実行を開始します。
- [結果の分析]パネルを開きます。予測されたすべてのバインディング ポーズを検査します。切断部位のCys-477と基質との間の最も低い予測結合エネルギーと合理的な結合相互作用を有する最良のモデルを選択します。さらに MD シミュレーションを行うために、バインド モデルを PDB ファイルとして保存します。
7. ドッキングVEEV基板複合体のMDシミュレーション
- オレンジ (http://ambermd.org/) を使用して入力ファイルを準備します。標準プロトコルに続いて、AMBERパッケージとff99SB力場を使用して予測された基板結合モデルに対してMDシミュレーションを実行します。
注:溶媒和システムは、MDシミュレーションの前に徹底したエネルギー最小化を受けます。周期境界条件は、連続システムをシミュレートするために適用されます。粒子メッシュEwald(PME)法は、長距離静電相互作用を計算するために採用された。シミュレートされたシステムは、最初に100psを超える0 Kから300 Kへの徐々に温度上昇を行い、次いで300Kで500 psの平衡化を行い、その後、合計で2nsの長さの生産を実行しました。- 高性能コンピューティング施設でシミュレーション ジョブを実行します。シミュレーションは Biowulf クラスター (https://hpc.nih.gov/) で実行されました (図 8)。
- VMD プログラム(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ ) を使用して軌道出力を視覚化します。nsP2のアクティブ部位内の基板とTRIM14の結合相互作用および立体構造変化を分析する(図9)。
Representative Results
ZIKV ns2B/3プロテアーゼのSSHHPS分析は、4つの宿主タンパク質標的を同定した:FOXG1、SFRP1、網膜cDNAライブラリーからのGsアルファサブユニット、およびNT5Mミトコンドリア5',3'-核体質体素(図10)6。特に、ZIKVプロテアーゼの潜在的な標的としてこれらのタンパク質を予測した他の方法は他になかった。FOXG1遺伝子の突然変異は、小頭症などの発達障害および構造脳異常を特徴とする先天性症候群に関連している。SFRP1は分泌されたフリル関連タンパク質(SFRP);。これらの可溶性受容体は、Wntリガンドを拮抗し、Wntシグナル伝達を阻害するために競合的に結合することができます。Wntシグナル伝達経路は、フラビウイルス感染36時のIFN応答の調節に関与する。SFRP1の切断は、フラビウイルス複製を増強することが期待されるであろう。SFRP1はまた、Th17細胞分化37に関与する。SSHHPSの配列アライメントは、切断部位配列における種特有の差異を示した(図10D)。SFRP1の切断部位配列は、ヒトとニワトリにおいて同一であった。ZIKVは、鶏胚における死亡率および小頭症を誘発することができる38.げっ歯類では、高度に保存されたP1残基(K/R)R↓Gはグリシン(RGG)によって置換される。マウスの免疫担当株は、一般にZIKV感染および疾患39に対して耐性である。
定常状態運動パラメータおよび阻害定数は、プレートリーダー31、40、41における連続アッセイを用いたウイルスポリタンパク質配列および宿主タンパク質配列について測定することができる(図11A)。特定の配列の切断や種々の化合物によるプロテアーゼの阻害などの定性的切断情報については、不連続アッセイを用いることができる(図11B)。
CFPとYFPの間の残基数の最適化が必要な場合があります。基板結合モデルは、in silicoメソッドを使用して行うことができます。nsP1/nsP2ジャンクションの代表的なドッキングモデルを図9に示します。VEEV nsP2プロテアーゼについて、12アミノ酸セムリキ森林ウイルス(SFV)配列の切断が報告されていた(Km=0.58mM)33.基板配列を19、22、および25残基に延長し、緩衝液のイオン強度を低下させ、Kmの有意な減少につながった。VEEV nsP2結晶構造および結晶パッキングの検討はまた、接合片の一部がプロテアーゼドメインに対して充詰され、らせらであることを示した。したがって、VEEV基板が長いほど、二次構造モチーフの認識によりより良く結合し得る。
TRIM14については、Km =21μM6、33を得た。宿主タンパク質配列を担持する基質のKmは、ウイルスポリタンパク質切断部位配列(Km(V12)=12μM及びKm(V34)=21μM)を含む基質のKm値に匹敵した。nsP1/nsP2、nsP2/nsP3、nsP3/nsP4ジャンクションの切断サイトシーケンスは、異なる効率で切断されました。細胞において、これはポリタンパク質42の逐次切断を可能にすると考えられている。
否定的な結果を解釈する際には注意が必要です。切断が発生しない場合、切断部位が短すぎるか、精製されたプロテアーゼが不活性である可能性があります。切断された基質の場合、ウイルス感染細胞における全長タンパク質の切断または切断を確認するために、追加の実験が必要である。適切なフォローオン実験を選択する必要があります。標的タンパク質の過剰発現またはサイレンシングがウイルス複製に及ぼす影響も試験することができる。
図 1: サイレンシングの 3 つのメカニズムサイレンシングは、DNA、RNA、またはタンパク質のレベルで発生する可能性があります。これらの「検索と削除」アルゴリズムは、それぞれ「キーワード」を使用して、単語を含むファイルの切断を指示します。この図は、モラッツァーニら32およびその中の参照から改変された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:切断部位配列における種特異的な相違点TRIM14ホモローグのC末端PRY/SPRYドメインがアライメントに表示されます。PRY/SPRYドメインは、グレーで強調表示された保存モチーフによって識別できます。ヒトTRIM14は、VEEV nsP2システインプロテアーゼによってQEAGA↓Gで切断される。SSHHP シーケンスは色で表示されます。緑色の残基はP1'残基です。青色ではP4残基であり、赤色では切断部位モチーフ配列内の他の保存残基である。馬はPRY/SPRYドメインを欠いているTRIM14の切り捨てられたバージョンを港。シアンで強調されたリジンは、ポリユビキチン化され、MAVSシグナルソームの組み立てにとって重要です。C末端PRY/SPRYドメインは、急性ウイルス感染時に細胞内で宿主の抗ウイルス応答を損なうためにnsP2プロテアーゼによって一時的に切断され得る。馬では、このドメインは常に存在しません。これは、TRIM14のPRY/SPRYドメインがVEEV感染に対する保護機能を有する可能性があることを示唆している。この図はモラザンニら6から再現されています 6この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:BLASTを使用したSSHHPS識別VEEV nsP1/nsP2接合部における切断部位モチーフ配列は、ホストタンパク質TRIM14のSSHHP配列と整列される。緑色で着色された残基はP1'残基です。青色ではP4残基であり、赤色では切断部位モチーフ配列の他の保存残基である。ほとんどのアライメントは、保存された切断部位モチーフの外側の領域に相同性を含んでいたか、P1/P1の生体結合残基を含みませんでした。TRIM14は、P1及びP1'を含む順次6残基との一致を示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:VEEV nsP2システインプロテアーゼに対するCFP-V12-YFP基質のタンパク質およびDNA配列。NdeI (CATATG) および XhoI (CTCGAG) の制限サイトは大文字で示されています。赤色では、nsP1とnsP2の間にあるウイルスポリタンパク質からの切断部位配列である。緑色の残基はP1'残基であり、青色では切断部位のP4残基である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Trx-VEEV-nsP2システインプロテアーゼ構築物のタンパク質配列。チオレドキシン(Trx)は黄色で示されている。トロンビン切断部位とヒスタグはシアンで示されている。サイス・ヒス・ダイアドには赤いラベルが付いています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:MOEにおけるペプチド構造この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:PyRx/オートドックを用いた基質ペプチドのドッキングこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: Biowulf クラスターで実行されているジョブこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:nsP1/nsP2接合部における切断部位配列を含むVEEV P12基板のモデル。Cys-477/His-546触媒ダイアドは青色で表示されています。図はピモール(https://pymol.org)を用いて作製した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:ジカウイルスns2B/ns3プロテアーゼのSSHHPS解析(A)ZIKV ns2B/ns3プロテアーゼの宿主タンパク質標的を予測した。赤色の残基は、単一の切断部位配列と一致する。緑色の残基は、サブサイトで許容され、他の切断部位の残基と一致する。SFRP1は連続した順序で同一残基の数が最も多かった。(B)CFP基質-YFPタンパク質(〜50〜60kDa)を発現し、各宿主タンパク質(ヒト)からの予測SSHHP配列を含む精製した。ZIKVプロテアーゼは、網膜cDNAライブラリーから分離されたヒトFOXG1、SFRP1、NT5MおよびGsアルファサブユニットを切断した。切断製品は約28-30 kDaです。基質配列は、Morazzani etal. 6 (C) ns2B/ns3プロテアーゼカットSFRP1では利用可能であるが、そのホモローグ(SFRP2およびSFRP4)を切断しなかった。(D)異なる動物種からの切断部位のアライメントは、グループIVウイルスの動物モデルを選択する際に有用であり得る。保存されたR↓G配列は、SFRP1におけるヒトとげっ歯類の間で異なであることに注意してください。モラッツァーニら6から再現された図はこちらをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。
図11:連続および不連続アッセイを用いた定常運動解析。(A) 表5に示す運動データをGraFitにプロットした。差し込みは、ラインウィーバーバークプロットを示しています。(B)CFP-V12-YFP基板の切断産物を示すSDS-PAGEゲル。レーン1では「UNCUT」基板(48kDa)である。レーン2では「CUT」基板(31kDa及び27kDa)である。レーン3〜9では、その阻害活性を試験するために異なる化合物が含まれていた。レーン4にはE64d共有阻害剤が含まれている。これらの反応を室温で〜17時間一晩行った。鋭いバンディングパターンを達成するためにサンプルの沸騰が必要であった。nsP2プロテアーゼは酵素を含む反応では(56kDa)見えるが、レーン1には見えない。レーン1は「酵素なし」対照である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
異物の配列によって導かれるタンパク質または核酸の配列特異的破壊は、生物学においていくつかの場合にしか見られない。図 1に示すメカニズムは、ホストをウイルスから保護する防御メカニズム、またはホストからのウイルスです。
バイオインフォマティクス法を用いて、これらのシステムによって破壊される標的を特定することができます。SSHHP配列の分析では、その多くが自然免疫応答を生成するために必要なタンパク質に含まれることがわかりました。MAVSやTRIF(TIRドメイン含有アダプタ誘導インターフェロンβ)などの明白な役割を持つものもあれば、より複雑なメカニズム(例えば、ヒストンH3、SFRP1、FOXG1)8、9.などの明らかな役割を果たしたものもあります。SSHHP配列に格納された標的情報は、これらのウイルスに対して抗ウイルス作用を有する経路を同定する可能性を有する。生体内での抗ウイルス応答は、多くの場合、ウイルス特異的な26、43.例えば、TRIMタンパク質のサブセットは、異なるウイルスに対する抗ウイルス作用を有する43、44、45、ウイルス制限因子(例えば、HIVおよびTRIM5α)である。TRIMタンパク質の特異性(約70が同定されている)は、まだ44、45を調べられている。SSHHPS内の情報は、これらのウイルスが自然免疫応答を回避する方法の理解に貢献する可能性があります。より多くのSSHHPSが調べられるにつれて、他のパターンおよび相関関係が明らかになるかもしれない。
種固有の違いは、我々の分析で明らかでした(図2、図10)。これらのウイルスは、他のものよりもいくつかの種に影響を与することが知られています。ホスト範囲、ホストの感受性、およびホスト防御に関する情報は、SSHHPS 内に存在する場合があります。例えば、馬脳炎ウイルスの最も影響を受けやすい種であるウマは、VEEV nsP2プロテアーゼによって一過性に切断されたヒトTRIM14の領域を欠いていた。ヒトがVEEV感染で死亡することはめったにないが、感染することは24.ヒトTRIM14タンパク質は、nsP2プロテアーゼ切断配列6を運んだ。切断部位の存在は、人間がこれらのウイルスに対する防御メカニズムを持っていることを示唆している。鳥は、これらのウイルスの潜在的な貯水池であると考えられてきた46.鶏由来のTRIM14タンパク質中の対応するSSHHP配列は、ヒトおよび他の種に見られる配列とは異なった。このような微妙な違いは、標的宿主タンパク質を不作とするか、またはより容易に切断させる可能性がある。Aguirre et al.16は、デングウイルス感染後に不死状態の変異型STRINGタンパク質がIFNのより高いレベルを誘導し、マウスがデングns2B3プロテアーゼによって切断されないSTINGのバージョンを自然に運ぶことを示した。マウスSTINGタンパク質は、ZIKVプロテアーゼ47によって切断されなかった。SSHHPS分析では、ヒトタンパク質とげっ歯類6のタンパク質を比較した際のZIKVプロテアーゼ切断部位配列の違いも観察した(図10D)。宿主タンパク質の種特異的タンパク質分解切断を再現することは、グループIVウイルスに使用される動物モデルにおいて重要である可能性がある。宿主タンパク質切断の阻害は、グループIVプロテアーゼ阻害剤の開発にも影響を及ぼす。前回の発表では、CA074メチルエステル6を用いたVEEV nsP2プロテアーゼによるTRIM14切断を阻害できることを示した。この結果は、これらのプロテアーゼの小分子阻害剤が、感染を抑制することができる自然免疫応答を調節することができることを示唆している。
種内の遺伝的変異はまた、タンパク質分解切断の違いを生成する可能性を有する。コドンの使用の微妙な違いは、リボソームの一時停止に影響を与える可能性があります48.一部のグループIVウイルスプロテアーゼはER膜に埋め込まれているため、切断が共に翻訳された場合、これらの一時停止の違いが標的の切断に影響を及ぼす可能性があります。我々が同定した切断部位のいくつかは、予測されたシグナルペプチド配列(例えば、SFRP1)にあったが、他のものは内部であった。
SSHHPS分析は、ホストタンパク質分析の他の方法とは異なる情報を生成することができます。SSHHPS分析は安価で使いやすいものでした。細菌発現系の使用は、哺乳動物細胞培養を使用せずに哺乳動物配列の短いセグメント(〜25アミノ酸)の試験を可能にした。我々は、CFP-YFP基質が試験されたヒトタンパク質配列のすべてを許容できることを発見した;しかし、収量はさまざまです。同様のアッセイにおいて、63個のアミノ酸であればヒトタンパク質配列を含む基質が、運動学的分析および阻害剤スクリーニングに正常に発現、精製、および利用された49、50、51である。不連続アッセイには少量の基板しか必要としないため、多数の標的を探索できます。このシステムの利点の1つは、CFP/YFP基板をSDS-PAGE解析およびより精巧な運動解析(すなわち、IC50、Ki、Km、Vmax)に使用できることです。創薬のために、阻害性化合物は蛍光アッセイでアーティファクトを産生することができる。したがって、連続アッセイと組み合わせた不連続アッセイは、切断または切断の阻害を確認することを可能にする。不連続なSDS-PAGEアッセイのサンプルは96ウェルプレートから直接取り出すことができます。CFP/YFP基板は、化合物ライブラリースクリーニング52に使用されている。しかし、Z係数53の計算などの高スループットスクリーニングに基板が適しているかどうかを判断するには、追加の分析が必要である。
基板を設計する際の課題の1つは、プロテアーゼによって結合および認識される生体結合の周りの領域を特定することです。ここに示す例では、生体結合を中心とした12個の残基配列から始めました。切断部位の配列アライメントを分析した後、生まれ関債の残基N末端に相同性がVEEVプロテアーゼに対して発見されたのに対し、一方、いくつかのC末端残基に対するZIKVプロテアーゼ相同位について発見された。ドッキング基板のインシリコモデルは、基板の結合部位をプローブする部位特異的突然変異誘発実験を設計するために使用することができる。基質および酵素配列はプラスミド上にあるので、インシリコモデルまたはサブサイト公差を試験するために変異させることができる。これは、結合基板の結晶構造が利用できない場合に有利であり得る。
SSHHPS分析はまた、ウイルス誘発表現型がウイルス酵素によって産生されるメカニズムに関する新しい情報を生み出す可能性がある。ZIKV標的の1つであるSFRP1は、Wntシグナル伝達経路の一部であり、脳および眼の発達および免疫応答36、37、54、55、56、57の両方において役割を有する。我々は、ZIKV ns2B/ns3プロテアーゼによって切断することができる他のタンパク質配列も脳および眼の発達に関与するタンパク質にあったことを発見した。両方の異常は先天性ジカ症候群で観察されており、ウイルス誘発表現型58の一部であると考えられている。
宿主と病原体の相互作用の予測可能性は、標的特異的のオンコ分解ウイルス療法という様々な用途に利用される可能性がある。危険を冒すライブウイルスワクチン;動物モデルの精製、予測または選択;宿主範囲または感受性の予測;人獣共通事象の予測;ホスト防御の予測。説明する方法はシーケンスベースであるため、将来的にソフトウェアに組み込む価値があるかもしれません。
Disclosures
ここで表明された意見は著者のものであり、アメリカ海軍、アメリカ陸軍、米国国防総省、米国政府の意見を表すものではありません。
Acknowledgments
この研究は、防衛脅威低減庁(DTRA)プロジェクト番号CB-SEED-SEED09-2-0061とCBCall4-CBM-05-2-0019、およびNCATS、NIH(XH)および海軍研究所基地資金の内壁/壁外研究プログラムによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
| 2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
| 4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
| AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
| AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
| Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
| Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
| Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
| Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
| Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| DNAse | Sigma | DN25-1G | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
| Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
| IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
| Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
| Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
| Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
| Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher | ||
| New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
| Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
| pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
| pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
| Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
| Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
| Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
| RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
| RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
| RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
| Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
| Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
| SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |
References
- Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
- Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
- Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
- Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
- Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
- Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
- Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
- Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
- Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
- Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
- Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
- Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
- Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
- Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
- Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
- Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934 (2012).
- Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
- Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
- Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
- Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
- Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
- Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
- Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
- Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
- Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
- Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894 (2009).
- Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
- Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
- Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
- Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
- Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
- Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
- Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
- Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
- Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
- Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
- Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
- Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
- Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
- Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16 (2008).
- Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
- van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
- Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347 (2016).
- Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
- Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
- Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
- Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
- Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
- Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
- Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
- Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
- Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
- Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).
