이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.
이 기사에서는 단일 과구(“skinned”) 심근세포를 분리하고 기능적 연구를 수행하기 위해 힘 측정 장치 및 모터에 부착하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 이러한 연구는 심근세포 강성(수동력)과 다른 칼슘(Ca2+)함유 솔루션으로 활성화하여 최대 력 개발, 근안타멘트 Ca2+-감도(pCa50),쿠퍼티움(nHill) 및 힘 재개발 속도(ktr)를 측정할 수 있습니다. 이 방법은 또한 근막에 직접 작용하는 약물의 효과와 심근세포의 활성 및 수동 적 특성모두에 외인성 재조합 단백질의 발현을 가능하게합니다. 임상적으로, 피부 심근 세포 연구는 많은 심근 질환의 병리생리학을 강조하고 myofilaments를 대상으로 치료 개입의 영향의 체외 평가를 허용. 전부, 이 기술은 열린 심혼 또는 이식 수술 도중 얻은 동물 모형 및 인간 조직에서 시험관 내 및 생체 내 파라미터 사이 상관관계를 조사하여 심장 병리생리학의 설명을 가능하게 합니다.
전통적으로 심근 기계적 특성에 대한 평가는 주로 유두 근육 및 trabeculae1,2와같은 다세포제제에서시도되었습니다. 다세포 심장 근육 스트립은 방향 및 힘 생성의 알 수없는 패턴을 가진 수축 심근 세포를 포함하는 세포의 이질적인 인구, 전기 활동 및 스트레스 / 변형 분포뿐만 아니라 주변 결합 조직 매트릭스3,4을포함한다. 콜라겐없이 준비하고 단일 심근 세포를 포함하는 것은 매우 정확하고 제어 된 방식으로 sarcomere 길이와 크로스 브리지 수축 특성의 측정을 허용할것이다5,6. 따라서, 지난 4년 동안, 단일 심근세포6,7의기계적, 수축 및 이완 특성을 조사할 수 있도록 여러 가지 방법론이 개발되었다. 이들 세포의 수축 기능은 사코메 길이 및 크로스 브리지 사이클링 운동학3에크게 의존한다. 따라서, 단 하나 고립 된 심장 세포에서 근육 기능을 직접 조사하는 것이 바람직하다, 그것은 사메레 길이 및 성능뿐만 아니라 크로스 브리지 기능 및 수축 특성을 평가 할 수 있다는 점을 고려. 그러나, μN 수준에서 힘 측정을 기록하는 동안 합리적인 광학 sarcomere 해상도로 기능성 심근세포를 분리하고 부착하는 것은 여전히 도전적이고진화3,6이다. 다른 과제는 갓 수거된 생검에서 심근세포를 분리하기 위해 설치해야 하는 물류입니다. 인간 생검 수집의 예측 불가능성은, 예를 들면, 실험의 타당성을 위태롭게 할 수 있습니다.
더욱이, 과학적 절차에 대한 동물 실험의 교체, 감소 및 정제에 관한 윤리적 관심사 (3R의 원칙)는 세포 및 조직 수준, 바람직하게는 인간의 생검 또는 작은 동물 샘플에서 연구 변화를 촉진했다. 실제로 복잡성의 작은 수준에서 시험관 내 심장 기능을 평가하는 방법론의 점진적 개선은 전신에 결과의 적절한 통합을 허용하고 임상 시나리오7로변환할 수 있습니다. 전부, 심근구를 추출하기 위해 -80°C에 저장된 샘플을 사용하는 것이 매력적인 대안일 수 있다.
심근 조직은 작은 조각으로 절단하고 박격포와 봉제와 균질화된다. 이러한 균질화의 결과는 다양한 정도의 사콜렘말 손상을 가진 피부 뭉닝 및 분리된 세포의 현탁액으로, 이 때 근근증이 입욕 매체에 노출되고 모든 세포 성분이 씻겨나난다. 사콜마에서 멀리 떨어져 있는 근시릴과 같은 구조물은 보존되어 있습니다. 따라서, 근시릴라 장치와 관련된 사컴레 단축 및 기능성 특성은 그대로 유지되며8,9를기록할 수 있다.
심근세포 력 측정 시스템은 심근세포 길이를 조정하는 데 사용되는 전자기 모터와 동급성 심근세포 수축을 측정하는 힘 트랜스듀서로 구성됩니다. 투과, 또는 피부, 심근세포는 편안한 용액 ([Ca2+] < 10 nM)을 포함하는 실험 챔버에 배치되고 실리콘 접착2 얇은 바늘 : 하나는 모터에 부착되고 다른 하나는 힘 트랜스듀서에 부착됩니다. 광학 시스템은 심근세포 형태와 사코프레 길이를 결정하는 데 사용됩니다. 실험 프로토콜은 종종 상이한 Ca2+ 농도를 포함하는 완충액의 일련의 힘 기록, 액틴-미오신 크로스 브리지 운동제의 결정 및 미리 정의된 sarcomere 길이에서 장착된 심근세포의 수동 장력측정(그림 1)으로구성된다. 액체 질소에서 동결된 심근 샘플로부터 의 분리(그리고 이후 -80°C에 저장됨)는 단단 면적당 최대 Ca2+활성화(활성) 힘을 측정하기 위한 세포 역학 및 단백질 생화학을 활용하는 기술입니다(T 활성, kN∙m-2), Ca 2+ 독립(T 활성, kN+m-2), Ca 2+-독립(T 활성, kN+m-2), Ca 2+ 독립(T 활성, kN+m-2), Ca 2+ 독립(T활성,kN+m-2), Ca2+독립(패시브) 장력(T패시브,kN+m-2), 근안회카2+민감도(pCa50),근안회(nHill), 힘 재개발(ktr) 및 T활성,T패시브,pCa50,nHill 및 ktr의 사코머 길이 종속성.
이 프로토콜의 목표는 다른 종에서 냉동 된 샘플에서 분리 된 단일 피부 심근 세포의 기능적 기계적 특성을 평가하는 신뢰할 수있는 절차로 심근 세포 력 측정 시스템의 잠재력을 설명하고 요약하는 것입니다.
피부 심근세포체를 사용하여 심장 기능의 체외 평가는 생리학적(예를 들어, 스트레치) 및 병리학적 문맥(예를 들어, 허혈)에서 심근세포 수준에서 발생하는 수정을 명확히 하는 중요한 기술을 나타냅니다. 이 방법론은 해동 된 샘플에서 얻은 심근세포에서 기능을 평가하기 위해 최소한의 심근을 요구하는 것과 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 광범위한 종(마우스13,쥐1,14,15,토끼16,돼지17,개18,기니피그19 및 인간20)으로부터심근세포및 상이한 심장 위치를 사용하여 아리아, 좌우 심실 또는 경색 심장의 특정 부위를 포함한다. 또한 이 기술은 기본 구성에서 규제 및 수축 구조의 기능을 측정하는 동시에 Ca2+ 및 에너지(ATP)의 특정 농도를 제공할 수 있습니다.
이 기술의 단순성에도 불구하고 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플 수집을 포함하여 처음부터 각 단계의 품질을 보장하는 것이 필수적입니다. 미오필라멘트 단백질은프로테아제(21)에취약하다. 따라서 수집 직후 액체 질소에 샘플을 보관해야 합니다. 이전에 동결되지 않은 신선한 샘플은 훨씬 더 높은 힘을 개발하므로 동일한 프로토콜에서 신선하고 냉동된 샘플에서 수행되는 측정을 혼합하는 것이 좋습니다. 두 번째로 가장 중요한 단계는 심근세포의 추출입니다. 이 절차 동안 대부분의 경우 얼음 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. 프로테아제 억제제 칵테일은추출/투과화(22)동안 단백질 분해의 위험을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 셋째, 이 단계를 무시했을 때 품질 이내 세포가 감소했다고 지적했기 때문에 정확한 메스 움직임을 사용하여 샘플을 작은 조각으로 절단해야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 트리톤을 씻어내고 (세포를 퍼미컬화하지만 그 접착을 촉진) 가능한 한 많은 세포를 유지하는 것 사이의 적절한 균형을 갖기 어렵기 때문에 심근세포를 세척하는 것입니다. 먼저 각 샘플, 종 또는 프로토콜에 대한 추출 및 세척 수를 시도하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 우리의 손에, 우리는 ZSF1 비만 쥐 조직 추출은 “지방” 양상을 가지고 있음을 지적, 접착제 동안 이러한 세포를 더 미끄러운 만든 하지만 측정하기 더 어렵지 않다. 우리가 이 문제를 우회하는 방법은 동물 당 세포의 합리적인 수를 가지고 더 많은 실험을 수행하여이었다. 또한, 접착제좋은 세포를 선택하는 것이 중요합니다, 즉 좋은 줄무늬와 합리적인 길이. 심근 세포에는 이러한 기능이 없는 경우 주로 바늘 끝에서 분리되거나 힘이 없음을 일으킵니다. 또한 세포를 바늘에 붙이는 접착제 의 시간과 효능을 고려하여 심근세포 부착에 올바른 접착제를 사용하는 것도 중요합니다. 우리의 손에, 실리콘 접착제(재료의 테이블)빠른 (10-15 분) 충분히 강한 치료. 마지막으로, 마지막 중요한 단계는 세포를 붙인 후 5 분 심근세포를 조심스럽게 들어 올리고 (커버 슬립에 세포를 붙이는 것을 피하기 위해) 우물로 이동하기 전에 (현미경 단계에 의해 끌리는 세포를 피하기 위해)와 관련이 있습니다. 표 7은 이 기술과 관련된 문제 해결, 그 근본 원인 및 빈번한 문제를 극복할 수 있는 가능한 해결 방법을 요약합니다.
이 방법의 주요 제한은 myofilaments활성화 /비활성화 얼마나 빨리 와 같은 myofilament 수축과 관련된 모든 질문에 대답 할 수 없다는 것입니다. 생체 내 설정에서 막 탈극성, 세포내 Ca2+ 증가 및 근안세포에 대한 확산은 심근세포가 수축하는 반면, 피부심근세포Ca2+ 확산에서 근막에 대한 확산은 세포가 Ca2+ 용액에 침수될 때 즉시 발생합니다. Ca2+ 확산의 이 빠른 속도는 근필라멘트 활성화/비활성화분석(23)을편향시킬 것이다.
이러한 실험은 온도, 용액 pH, 기계적 변속(느슨한 재스트레칭 대 느슨함) 및 세포 부착 절차(핀 넥타이 대 접착제)를 포함한 다양한 요인에 의해 영향을받습니다.
기술의 미래 진행은 투과성 심근세포보다는 그대로 기능적 연구를 수행하는 것을 포함한다. 이 기술은 심근세포가 갓 분리된 것에 의존하는 단점이 있습니다(이전에는 동결되지 않음). 이 방법론과 직접적인 관련이 없는 또 다른 중요한 문제는 샘플 냉동 저장의 최대 기간과 관련이 있는 데 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 구체적으로, 저장 시간 전반에 걸쳐 근안의 분해 정도를 확립하는 것이 필수적이다(즉, 추출된 심근세포로부터 파생된 양질의 기능데이터를 보장하기 위해 냉동 시료를 얼마나 오래 저장할 수 있는지).
The authors have nothing to disclose.
저자는 과학 기술 (FCT), 유럽 연합( EU), 쿼드로 드 Referência 에스트라테기코 나시오날 (QREN), 푼도 유럽 유 데센볼비멘토 지역 (FEDER) 및 Programa Operacional Factores 드 Competitividade (경쟁) UnIC (UID / IC / 00051/ 2013) 연구 단위에 대한 포르투갈어 재단에 감사드립니다. 이 프로젝트는 경쟁 2020 – 프로비타 오페라 경쟁 E Internacionaléação (POCI), 프로젝트 DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003) 포르투갈 2020 파트너십 계약에 의해 지원 , 포르투갈 2020 파트너십을 통해 FEDER에 의해 지원됩니다 유럽 지역 개발 기금(ERDF)을 통해 리스본의 지역 운영 프로그램인 2020년 유럽 구조 및 투자 펀드가 지원하는 프로젝트 NETDIAMOND(POCI-01-0145-FEDER-016385)를 통해. Patrícia 로드리게스FCT (SFRH / BD / 96026/2013)에 의해 투자되었고 주앙 알메이다 – 코엘호는 유니버시다데 두 포르투 / FMUP 및 FSE – 펀도 사회 유럽u에 의해, NORTE 2020-Programa Operacional 지역 도 노르테, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |