Summary
Vi beskriver en tuberkulose molekylær bakteriel belastning assay test udført efter varme inaktivering af spyt. Varmeinaktivering gør spytprøver ikke-infektiøse og overflødiggør behovet for indeslutningsniveau 3 laboratorier for tuberkulose molekylære test.
Abstract
Tuberkulose er forårsaget af Mycobacterium tuberkulose (Mtb), et patogen klassificeret af Fn (FN) som et farligt biologisk stof i kategori B. Af hensyn til arbejdstagernes sikkerhed skal håndtering af alle prøver, der formodes at bære Mtb, udføres i et indeslutningsniveau (CL) 3 laboratorium. TB molekylære bakterielle belastning assay (TB-MBLA) test er en omvendt transkantificeret polymerase kædereaktion (RT-qPCR) test, der kvantificerer Mtb bakteriebelastning ved hjælp af primere og dobbelt-mærket sonder for 16S rRNA. Vi beskriver brugen af varmeinaktivering til at gøre TB-prøver ikke-infektiøse, samtidig med at RNA bevares for TB-MBLA. En 1 ml aliquot af spytprøven i tætlukkede 15 ml centrifugerør koges i 20 min ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C for at inaktivere Mtb bacilli. Dyrkning af varmeinaktiverede og kontrol (levende) prøver i 42 dage bekræftede død TB. Den inaktiverede prøve tilsat 100 μL af ekstraktionskontrollen og RNA ekstraheres efter standard-RNA-isolationsproceduren. Der blev ikke observeret vækst i de varmebehandlede prøvers kulturer. Det isolerede RNA udsættes for RT-qPCR i realtid, som forstærker et specifikt mål i Mtb 16S rRNA-genet, hvilket giver resultater i form af kvantificeringscyklusser (Cq). En standardkurve bruges til at oversætte Cq til bakteriebelastning eller estimerede kolonidannende enheder pr. ml (eCFU/ml). Der er en omvendt sammenhæng mellem Cq og den bakterielle belastning af en prøve. Begrænsningen er, at varmeinaktivering lyser nogle celler, udsætter RNA til RNases, der forårsager et tab på <1 log10eCFU/mL (dvs. <10 CFU/mL). Yderligere undersøgelser vil bestemme andelen af patienter med meget lav byrde, der forårsager falske negative resultater på grund af varmeinaktivering.
Introduction
Forårsaget af Mycobacterium tuberkulose (Mtb), over 7 x 106 nye tilfælde af tuberkulose (TB) er rapporteret globalt, hvoraf over 1 x 106 dør om året1,2. For at vende tendensen lancerede Verdenssundhedsorganisationen (WHO) en tilgang med tre søjler, herunder udvikling af effektive diagnose- og behandlingsværktøjer3. Klassificeret som et farligt biologisk stof B af FN, arbejder med prøver formodes positiv for Mtb kræver en indeslutning niveau (CL) på 3. CL3 laboratorier er dyre at bygge og vedligeholde. Derfor har de fleste lande centraliseret tb-kulturtjenester på regionalt eller nationalt plan. Det betyder, at smear mikroskopi er det mest tilgængelige diagnostiske værktøj i de perifere sundhedsfaciliteter.
Der er WHO's godkendelse til at gennemføre hurtige molekylære test som Xpert MTB/RIF på niveau 4 sundhedsfaciliteter, for det meste beliggende på distriktsniveau4,5. Nogle distrikter er ret store og mindre tilgængelige for nogle mennesker. Mens gavnlige, Xpert MTB / RIF virker ved at opdage Mtb DNA. DNA er et stabilt molekyle , der overlever længe efter, at cellerne er døde, og som derfor ikke er en god standard for måling af levedygtige celler, der er afgørende for overvågning af behandlingsrespons5,6. RNA-baserede analyser er et alternativ til nøjagtig måling af levedygtige celler7,8,9,10,11,12,13. RNA findes i forskellige arter med varierende stabilitet: ribosomal RNA (rRNA), overførsel RNA (tRNA), og messenger RNA (mRNA). Messenger RNA er forbundet med genekspression og dermed den tættest forbundet med celleaktivitet og levedygtighed14. Det er vigtigt at bemærke, at fravær af genekspression ikke svarer til celledød , fordi patogener som Mtb vides at eksistere i inaktive (hvilende), men levedygtige tilstande15,16. Stabile RNA-arter såsom rRNA er derfor bedre markører for både aktive og inaktive tilstande af levedygtige celler.
Ved hjælp af Escherichia coliviste Sheridan , at 16S rRNA proportionalt steg med bakterievækst målt ved kolonidannende enheder (CFU) tæller17. Der var et samtidig tælling i CFU-tal og 16S rRNA, når E. coli bakterier blev udsat for antibiotika. Faldet i rRNA efter celledød var en indikator for , at det kunne anvendes som markør forcellelevedygtigheden 13,17. Ved at trække på dette princip blev tb molekylære bakterielle belastning assay (TB-MBLA) udviklet til målretning M. tuberkulose 16S rRNA til at måle levedygtige TB bacillary belastning som en markør for behandlingsrespons for patienter på anti-TB behandling11,18,19. Vi har videreudviklet og optimeret TB-MBLA til at indarbejde en cellulær ekstraktionskontrol, der afspejler lysis af M. tuberkulose bacilli og er robust i forskellige miljømæssige indstillinger20. TB-MBLA-proceduren kræver, at de første trin af RNA-isolation fra Mtb udføres i et CL3-laboratorium, indtil Mtb-cellerne er helt lysed for at sikre arbejdstagernes sikkerhed. Den omfatter også konservering af prøver med henblik på retrospektiv batchanalyse, der skal holdes på -80 °C i guanidinthiocyanat, et niveau 4-giftigt stof. Til dette formål har vi brugt varme til at inaktivere Mtb og gøre prøver sikkert for TB-MBLA, der skal udføres i smear mikroskopi niveau laboratorier.
Brug af varme i laboratorie-og kliniske anvendelser har eksisteret i århundreder21,22. Men nogle mikroorganismer som Mtb er svære at dræbe, og kortere udsættelse for varme er utilstrækkelig til at dræbe alle cellerne23,24. En undersøgelse viste, at 20 min opvarmning af TB kulturer ved 80 °C dræbt alle Mtb bacilli uden at ødelægge DNA er nødvendige for PCR25. Efterfølgende opvarmes en række dna-ekstraktionsteknikker i laboratoriet i øjeblikket til 95 °C. Vi har anvendt det samme princip for at vise, at kogende TB-prøver ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C inaktiverer Mtb, samtidig med at der bevares tilstrækkeligt RNA til at udføre TB-MBLA. Inaktiveret kultur eller spyt kan holdes i tæt lukkede beholdere ved stuetemperatur eller nedkølet i 7 dage uden at reducere mængden af kvantificerbar rRNA.
TB-MBLA, der i øjeblikket anvendes som en forskningsanvendelse (RUO) test er fleksibel og er blevet anvendt til forskellige prøvetyper, herunder spyt, lungevæv, og cerebral spinalvæske. Det er endnu ikke anvendt på bronkialveolær væske, blod, og andre prøvetyper. Ved hjælp af spyt som prøve viser resultater fra multisite evaluering i Afrika (ikke-offentliggjorte data) og tidligere publikationer18,26, at følsomheden af MBLA er i overensstemmelse med mycobacterium vækst indikatorrør (MGIT) flydende kultur. Men, TB-MBLA er hurtigere, hvilket giver resultater i timer i modsætning til dage eller uger af kultur, specifikke, ikke påvirket af ikke-TB mikroorganismer i prøven, og giver et kvantitativt mål for sygdommens sværhedsgrad. WHO har for nylig anerkendt TB-MBLA som en kandidat til at erstatte smøre mikroskopi og kultur til overvågning af TB behandling2.
I denne artikel beskriver vi i detaljer varmen inaktivering og TB-MBLA protokol offentliggjort i Sabiiti et al.27. Denne detaljerede protokol vil give en one-stop visuel ressource for TB-MBLA brugere over hele kloden.
Protocol
1. Forberedelse af prøver
-
Kultur
- Arbejde på en ren bænk eller klasse 1 kabine, høste 1 ml aliquots af eksponentiel fase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kultur i 15 ml plast centrifuge rør. Luk rørene tæt.
BEMÆRK: For at behandle en hel 5 ml prøve kræves der fem 15 ml centrifugerør.
FORSIGTIG:Et biosikkerhedsskab er påkrævet, når der arbejdes med tb-kultur.
- Arbejde på en ren bænk eller klasse 1 kabine, høste 1 ml aliquots af eksponentiel fase Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kultur i 15 ml plast centrifuge rør. Luk rørene tæt.
-
Patient spytprøve
- Arbejde i et godt ventileret rum og iført en nasal maske, omhyggeligt åbne prøvekoppen, pipette 1 ml aliquots i 15 ml plast centrifuge rør og tæt lukke rørene.
BEMÆRK: En bred mund spids anbefales at pipette spyt. Brug en saks, klip den fine del af 1 ml spids munden for at skabe en bredere mund.
- Arbejde i et godt ventileret rum og iført en nasal maske, omhyggeligt åbne prøvekoppen, pipette 1 ml aliquots i 15 ml plast centrifuge rør og tæt lukke rørene.
2. Varme inaktivering
- Før prøvetilberedningen indstilles vandbadet til 95 °C.
BEMÆRK: 95 °C temperaturen øger chancen for at reducere RNase aktivitet og dermed bevare mere RNA for downstream TB-MBLA. - Prøveglassene overføres til en holderholder, der er nedsænket i vandbadet. Sørg for, at tre fjerdedele af hvert prøverør er nedsænket i vandet.
- Kog ved 95 °C i 20 min, og overfør derefter rørene til bænken for at køle ved stuetemperatur i 5 minutter, før RNA-ekstraktionen påbegyndes.
BEMÆRK: Komplet varmeinaktivering af M. tuberkulose bacilli og BCG blev verificeret ved inkubering af varmeinaktiverede prøver og kontrollerved 37 °C i 42 dage for at kontrollere væksten. Der blev foretaget en optisk massefyldesmåling ved 600 nm (OD600) ved baseline og derefter ugentligt i inkubationsperioden på 42 dage.
3. RNA-ekstraktion
BEMÆRK: Den RNA-ekstraktionsproces, der er beskrevet her, er for RNA-sættet, der er opført i materialetabellen. Andre egnede RNA ekstraktionssæt fra forskellige producenter kan anvendes.
- Ekstraktionskontrol (EF) tilsætning
- 1 ml prøver af varmeinaktiverede prøver overføres til 1,5 ml rør. Spike 100 μL af EF i hver prøve, luk røret, og bland ved at vende røret på hovedet 3x.
BEMÆRK: EF leveres med TB-MBLA vitale bakterier kit (Tabel af materialer).
- 1 ml prøver af varmeinaktiverede prøver overføres til 1,5 ml rør. Spike 100 μL af EF i hver prøve, luk røret, og bland ved at vende røret på hovedet 3x.
- Sedimentering af celler
- Brug en microcentrifuge på bænket, der centrifugeres ved 20.000 x g i 10 min ved stuetemperatur. Pipetter af supernatanten, hvilket efterlader 50 μL sediment.
- Sedimentet suspenderes i 950 μL lysisbuffer ved at pipettere op og ned, og hele suspensionen overføres til lysingmatrixrøret, der følger med RNA-ekstraktionssættet (Materialetabel). Sørg for, at rørene er tæt lukket og mærk både låget og siden af røret.
- Ved cellelysis overføres rørene fra trin 3.2.2 til en homogenisator. Prøverne homogeniseres i 40 s ved 6.000 omdrejninger i minuttet.
- Rensning af nukleinsyre
- Lysatet centrifugeres fra trin 3.3 ved 12.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Der fremstilles friske 1 ml rør, og der tilsættes 300 μL chloroform i hvert rør.
- Ved hjælp af en 1 ml spids forsigtigt pipette off supernatanten uden at røre lysing matrix.
- Supernatanten overføres til chloroformindeholdende rør og vortex i 5 s. Lad røret afregne i 5 min eller længere, indtil tre faser (øvre, midterste og nederste) er klart synlige.
- Centrifuger ved 12.000 x g i 5 min ved stuetemperatur. Forsigtigt pipette den øverste fase og overføres til friske 1,5 ml rør.
- Til rørene i trin 3.4.5 tilsættes 500 μL iskold 100% ethanol, rør lukkes, og blandes ved forsigtigt at vende på hovedet 3x. Rørene inkuberes ved -80 °C i 15 min eller -20 °C i 30 min. og ekstraktionen fortsættes, eller der hengår til den ene dag til den anden for at fuldende ekstraktionen den følgende dag.
- Mikrocentrifugen indstilles til 4 °C, og der afkøles til mindst 12 °C, inden centrifugering påbegynder. Lad rørene i mikrocentrifugen og centrifuger i 20 min ved 13.000 x g. Supernatanten kasseres, erstattes med 70% iskold ethanol, og centrifuger i yderligere 10 minutter ved 13.000 x g.
BEMÆRK: De 70% ethanol bør foretages med molekylær kvalitet nuclease gratis vand. - Supernatanten kasseres fra trin 3.4.7, og rørene overføres til en rugemaskine, der er indstillet til 50 °C. Inkuber i 20 minutter for at tørre RNA/DNA-pelleten. Hold rørene delvist åbne for at muliggøre fordampning af al ethanol.
- Der tilsættes 100 μL nucleasefrit vand til den tørre pellet og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Vortex for 3 s at blande indholdet.
BEMÆRK: På dette stadium kan ekstraktet opbevares 2−3 dage i køleskabet eller længere ved -80 °C, indtil punkt 3.5 er udført.
- DNA-fjernelse
BEMÆRK: Dette trin er afgørende, fordi tilstedeværelsen af DNA i ekstraktet ugyldiggør MBLA-resultatet. Dette afsnit er baseret på et DNA-fjernelsessæt (Materialetabel).- Der fremstilles en blanding af enzymet DNase I 10x buffer og DNase I-enzym for antallet af prøver (10 μL buffer og 1 μL DNase pr. prøve) plus 10 % ekstra til dækning af tab af pipettering. Der blandes ved vortexing og derefter pipette 11 μL i hvert rør, der indeholder RNA ekstrakt.
- Bland ved vortexing 3 s og drej derefter kortvarigt (10 s ved 13.000 x g) for at fjerne eventuelle dråber på væggene. Inkuber ved 37 °C i 30 min i den varme blok eller inkubatoren. Der tilsættes yderligere 1 μL DNase I-enzym direkte i hvert rør, blandes godt ved vortexing, og inkuberes i yderligere 30 min ved 37 °C.
- Tø DNase inaktiveringsreagens op 10 minutter før afslutningen af DNase-inkubationen. Vortex 20 s for at sikre en homogen, mælkeagtig suspension og derefter tilføje 10 μL DNase inaktivering reagens i hver RNA ekstrakt fra trin 3.5.2.
- Blandingen inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Vortex 3x under 5 min inkubationstrinnet.
- Blandingen centrifugeres ved 13.000 x g i 2 min. Overfør forsigtigt supernatanten til 1,5 ml RNase frie rør uden at røre nogen af inaktiveringsmatrixen.
- Opbevar RNA-ekstraktet i køleskabet, hvis RT-qPCR køres samme dag eller ved -80 °C til langtidsopbevaring.
4. Omvendt transskriptase qPCR
- For ukendte prøver fortyndes alle RNA-ekstrakter, der skal anvendes i et 1:10-forhold i RNase frit vand. Bland godt ved vortexing for 5 s og kort spin ned for at fjerne eventuelle dråber eller luftbobler.
- For standardprøver til en standardkurve tages Mtb- og EC RNA-standarderne fra fryseren -80 °C og tø op ved stuetemperatur. Der forekommer henholdsvis syv og seks 10 gange fortyndinger af Mtb- og EF-standardprøver. Skift spidserne, før blandingen overføres fra et rør til et andet.
BEMÆRK: Standardprøverne leveres med TB-MBLA-sættet. -
Master mix forberedelse
BEMÆRK: Master mix (MM) er en opløsning af PCR-reagenser, der er tilstrækkelige til at forstærke alle prøver, standarder og vand til en no template control (NTC). Det vand, der anvendes som NTC, skal være det samme vand, der anvendes i ekstraktionen, og til klargøring af MM. Sørg for, at standarderne, hver RNA-prøve og dens decimalfortynding forstærkes 2x for den omvendte transkriptasepositive (RT+) reaktion og 1x for den omvendte transkriptosenegative (RT-) reaktion. RT-reaktionen er en kontrol til bestemmelse af effektiviteten af dna-fjernelse (tabel 1).- 16 μL MM overføres til hvert PCR-reaktionsrør.
- Der tilsættes 4 μL RNA-ekstrakt i hvert RT+ og RT-reaktionsrør og vand i NTC-reaktionsrørene.
- Reaktionsrørene anbringes i en PCR-maskine i realtid, og PCR-betingelserne indstilles således: 50 °C i 30 min. 95 °C i 15 min. 40x cykler ved 94 °C i 45 s og 60 °C i 1 min med tillæsning med fluorophorer, der absorberer i grønne og gule kanaler.
BEMÆRK: Den grønne kanal er Mtb detektion fluorophore og den gule er udvinding kontrol detektion fluorophore.
-
Resultatfortolkning
BEMÆRK: Sørg for, at de dobbelte reaktioner fra den samme prøve ikke afviger med mere end 1 standardafvigelse. Mtb- og EC Cq-værdier, der er højere end 30, betragtes som negative. Se yderligere fortolkningsdetaljer i tabel 2.- For at fortolke behandlingsresponsen konverteres Cq-værdierne til bakteriebelastning (eCFU/ml) ved hjælp af standardkurven. Læs behandlingsresponsen som ændringen i bakteriebelastningen i løbet af behandlingsopfølgningsperioden.
BEMÆRK: Faldet i bakteriebelastningen efter behandling betyder en positiv reaktion (dvs. anti-TB-lægemidler, der dræber TB-bakterierne), mens ingen ændring eller stigning i bakteriebelastning ender med en negativ reaktion, hvilket kan betyde resistens af TB-bakterier over for anti-TB-lægemidler, eller patienten ikke korrekt overholder deres behandlingsdosis. Faldet i bakteriebelastningen målt ved TB-MBLA korrelerer med stigningen i MGIT-tid til dyrkningspositivitet (TTP).
- For at fortolke behandlingsresponsen konverteres Cq-værdierne til bakteriebelastning (eCFU/ml) ved hjælp af standardkurven. Læs behandlingsresponsen som ændringen i bakteriebelastningen i løbet af behandlingsopfølgningsperioden.
5. Transmission Elektron mikroskopi
- 2 ml aliquots af varmeinaktiverede kulturer og kontroller overføres til 2 ml mikrocentrifugerør. Centrifuger i 10 min ved 20.000 x g.
- Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes i 700 μL cellefikseringsbuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter for at fikse cellerne.
- Suspensionen centrifugeres i 30 min ved 16.000 x g for at opnå en hård pellet. Supernatanten kasseres, og der udskiftes med 1% saccharose i fosfat-buffered saltvand (PBS). Pillerne opbevares i saccharose ved 4 °C, indtil de er blevet snittet til elektronmikroskopi.
-
Skæring og TEM
BEMÆRK: Nedenstående protokol er tilpasset fra Griffiths et al.28.- Kryobeskytte cellen pellet ved at integrere det i 2,1 M saccharose i PBS natten over ved 4 °C. Vask 3x med iskoldt vand.
- Afkøl de kryobeskyttede cellepiller i flydende nitrogen og monter dem kryomikrotomi stubbe. Brug af kryomikrotom, skæres ultratynde sektioner på 90 nm.
- Hent de afskårne sektioner ved hjælp af wolfram wire sløjfer af 1:1 blanding af 2% methyl cellulose og 2,1 M saccharose i PBS.
- Sektionerne overføres til pioloformbelagte 150 mesh sekskantede kobber TEM-understøtninger (gitre) og opbevares ved 4 °C eller fortsætte til trin 5.4.5.
- Kontrast gitrene i uranylacetat og lufttørre i en film af methylacetat. Gitrene vaskes med iskoldt vand efterfulgt af to dråber PBS over 5 min. og tørres i 15−30 min. Undersøg sektionerne under TEM efter producentens retningslinjer.
BEMÆRK: Alle mærkningstrin blev udført ved istemperatur (væsketemperatur) bortset fra vasketrinnene, som blev udført ved omgivelsestemperatur.
Representative Results
Varme inaktiverer alle M. tuberkulose bacilli
Den optiske tæthed (OD) af kontroller (levende celler) steg over tid (0,04OD-0,85OD), og der blev ikke observeret nogen OD-ændring i varmeinaktiverede prøver, hvilket betød vækst og ingen vækst henholdsvis (Figur 1)27. På samme måde blev det kliniske spyt, der blev kontrolleret, positivt dag 3 i MGIT, mens varmeinaktiverede kliniske prøver ikke flagede positivt før afslutningen af inkubationen. Væksten i Mtb i MGIT blev bekræftet af Ziehl-Neelsen smear mikroskopi og antigenMPT6429.
RNA i inaktiverede prøver er stabil ved 37 °C i 4 dage
Varmeinaktiverede prøver blev inkuberet ved 37 °C for at afgøre, om RNA nedbrydes efter varmeinaktivering af celler. Der blev ikke fundet nogen forskel mellem det RNA, der blev høstet ved dag (D) 0 umiddelbart efter varmeinaktivering, og RNA isoleret ved D1, 2, 3 og 4 i begge BCG-kulturer (figur 2A-C) og TB positiv spyt ( Figur2D).
Eksogen RNase øger hastigheden af RNA-nedbrydning i de varmeinaktiverede fraktioner
For at afgøre, hvorfor RNA ikke var nedværdigende, blev RNase A enzym eksogent tilsat ved 1.000 U/ml før og/eller efter varmeinaktivering. Dette forårsagede RNA-tab svarende til bakteriebelastning en bakteriebelastning på henholdsvis 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 - og 1,3 ± 0,1 – log10 eCFU/ml ved 80 °C, 85 °C og 95 °C over 4 dages inkubation. Der var forskel på RNA-nedbrydes i prøver, hvor RNase blev tilsat før og/eller efter varmeinaktivering (Figur 3A-C).
Tilstrækkeligt RNA bevares til TB-MBLA ved hjælp af 16S rRNA som referencemarkør
Effekten af varmeinaktivering på rRNA blev målt i BCG-kulturer og spyt fra TB-positive patienter. Den målte bakteriebelastning af BCG-kultur, 5,3 ± 0,2 log10 eCFU/ml, var 0,2 ± 0,1 log10 eCFU/ml højere end den kombinerede 5,1 ± 0,3 log10 eCFU/ml af varmeinaktiveret kultur (ANOVA p < 0,0001) ved 80 °C, 85 °C og 95 °C (Figur 4A)27. Tilsvarende var den bakterielle belastning af kontrol patienten sputum, 7,1 log10 eCFU /ml, 0,8 ± 0,1 log10 eCFU/ml højere end den kombinerede 6,3 ± 0,41 log10eCFU/ml ved 80 °C, 85 °C, og 95 °C (Figur 4B)27. Den bakterielle belastning reduktion var <1log i de to typer af testede prøver.
Sidaks flersammenligningstest viste en signifikant forskel mellem bakteriebelastningen ved 95 °C i forhold til 80 °C og 85 °C (p = 0,001). Der blev ikke fundet nogen forskel i TB-prøver ved alle temperaturer, p = 0,8.
Cellevægintegritet ender ikke med varme i de fleste Mtb-celler
Ved hjælp af transmission elektron mikroskopi (TEM) undersøgte vi, om cellerne blev lysed af varme inaktivering. Tynde dele af paraformaldehyd faste pellets af celler blev foretaget og indlejret i en elektron rige medium forud for undersøgelse af TEM. Inspektion af cellerne ved lavere og højere forstørrelse afslørede intakt cellevæg og synlige intracellulære lipidorganer. Celler morfologisk syntes aflange, men ikke lysed. Figur 5 illustrerer morfologien af mycobacteriumceller ved forskellige forstørrelser. De to øverste paneler afslører intracellulære lipid organer og uhindret reb-lignende snor, en morfologisk egenskab typisk for mycobacterium arter. De nederste to paneler er højere forstørrelse udvide visningen af lipid organer og afslører nogle mikro-intracellulære strukturer.
Bakteriel belastning målt ved TB-MBLA er omvendt korreleret til MGIT kultur tid til positivitet
For patienter, der reagerer på behandling, falder bakteriebelastningen ved gennemsnitligt 1 log10 eCFU/ml om ugen i løbet af behandlingen. Hurtige respondenter klare hurtigere, konvertere til negative (nul bakteriel belastning) med 2 ugers behandling. Faldet i bakteriebelastningen målt ved TB-MBLA svarede til stigningen i MGIT-kulturtiden til positivitet (TTP). Figur 6 viser den omvendte korrelation, der findes mellem bakteriebelastning og MGIT TTP. Forskellen er imidlertid, at TB-MBLA resultater er tilgængelige i 4 timer og time-to-result er uafhængig af niveauet af bakteriel belastning. Dette er i modsætning til 5-25 dage for MGIT kultur test. Kontaminering med ikke-TB-bakterier kompromitterer resultaterne fra dyrkningstest yderligere.
Figur 1: Verifikation af BCG inaktivering ved 80 °C (punktmønsterkurve), 85 °C (prik-dash mønsterkurve) og 95 °C (stregmønsterkurve). Kontrollen (sort kurve) var levende (uopvarmet) BCG kultur podet i samme vækstmedium. Væksten i kontrollen blev bekræftet af stigningen i kulturens OD i inkubationstiden. Dette tal er ændret fra Sabiiti et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Stabilitet af kvantificerbar RNA i varmeinaktiveret prøve inkuberet ved 37 °C i 4 dage (D0-D4). (A), (B) og (C) viser BCG-kulturer inaktiveret ved henholdsvis 80 °C, 85 °C og 95 °C. (D) viser TB-sputum inaktiveret ved 80 °C. Kontrolelementet er den ubehandlede (levende) del af den samme prøve. Fejllinjer = standardafvigelse. Tre gentagelser, ni replikater pr. løb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Højere RNA-nedbrydning efter eksogen tilsætning af RNase A-enzym. (A) Varmeinaktivering (HI) ved 80 °C, (B) HI ved 85 °C ogc) HI 95 °C. Fejllinjer = standardfejl for middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Bevarelse af tilstrækkelig RNA til måling af tb-Mbla-bakteriebelastning ved hjælp af 16S rRNA som markør. (A) Bakteriebelastning anslået fra in vitro BCG kulturer. BB) Bakteriebelastning estimeret ud fra tuberkulosepositiv spyt. Fejllinjer = standardfejl for middelværdien (n = 18 og 20 replikater for henholdsvis A og B). Dette tal er ændret fra Sabiiti et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Elektronmikrografer af intakt Mtb bacilli efter inaktivering ved 95 °C i 20 min. Der blev observeret klare intakte cellevægog sammenørebare lipidlegemer med TEM. Top: lav forstørrelse billeder af en gruppe af celler afslører uhindret mykobakterielle reb-lignende ledning morfologi og intracellulære lipid organer. Bund: høj forstørrelse af de øverste paneler til at udvide visningen af lipid organer og afslører nogle mikro-intracellulære strukturer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: 12 ugers behandlingsresponskurven for en patient i anti-TB-behandling, der viser en omvendt korrelation mellem TB-MBLA målt bakteriebelastning og MGIT TTP. Bakteriebelastningen (blå kurve) falder, mens TTP stiger (rød kurve), mens patienten reagerer på behandlingen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Master mix | RT positiv reaktion | RT negativ reaktion |
| Volumen pr. reaktion x nej. af reaktioner + 5 | Volumen pr. reaktion x nej. af reaktioner + 5 | |
| Quantitect mix | 10,0 μL | 10,0 μL |
| Mtb16S primer mix (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| Mtb16S sonde | 0,2 μL | 0,2 μL |
| EF primer mix (F + R) | 0,4 μL | 0,4 μL |
| EF-sonde | 0,2 μL | 0,2 μL |
| RT enzym | 0,2 μL | ------- |
| RNase frit vand | 4,6 μL | 4,8 μL |
| Volumen i alt | 16 μL | 16 μL |
Tabel 1: Master mix forberedelse guide til TB-MBLA qPCR.
| Type | MTB-kanal | EF-kanal | Fortolkning |
| Prøve | Positive | Positive | Gyldig |
| Prøve | Positive | Negative | Ubestemt |
| Prøve | Negative | Positive | Gyldig |
| Prøve | Negative | Negative | Ugyldig |
| MTB + Kontrol | Positive | Negative | Gyldig |
| Ekstraktionskontrol (EF) | Negative | Positive | Gyldig |
| DNA-kontrol | Negative | Negative | Gyldig |
| Negativ kontrol (NTC) | Negative | Negative | Gyldig |
Tabel 2: TB-MBLA resultater fortolkning guide.
Discussion
Denne artikel viser, at varmebehandling i 20 min ved 80 °C, 85 °C og 95 °C inaktiverer tuberkuloseprøverne effektivt, hvilket gør det muligt at udføre TB-MBLA på et ikke-CL3-anlæg uden risiko for infektion hos laboratoriearbejdere. Resultaterne bekræfter observationer foretaget i tidligere undersøgelser , mens de står i kontrast til nogle om effektiviteten af varmeinaktivering af Mtb25,30. F.eks. viser nogle rapporter, at opvarmning ved 80 °C ikke er effektiv ved prøver af høj bakteriebelastning25,31,32,33. Den høje massefylde inokulum effekt blev undgået i vores undersøgelse ved at sikre, at alle spyt og rene kulturer blev opvarmet ved en 1 ml volumen pr 15 ml centrifuge rør giver tilstrækkelig plads til at udsætte hver del af prøven til kogning27.
RNA-konservering efter varmeinaktivering gør det muligt at udføre TB-MBLA. Dette fund er i strid med to undersøgelser , der viste RNA-konservering efter varmeinaktivering12,34. Vi viste, at RNA i varmeinaktiverede prøver er stabil ved 37 °C i 4 dage, hvilket indebærer, at laboratorierne kunne batchtest ved at opretholde inaktiverede prøver ved stuetemperatur i en uge. Ved at anvende RNA-ekstraktionssæt, der kræver køling eller frysning, opfylder evnen til at opretholde varmeinaktiverede prøver ved stuetemperatur behovet for, at både kølekæden og kategori 3-laboratorier ne udfører TB-MBLA i begrænsede ressourceindstillinger.
Mindre end 1log bakteriel belastning gik tabt ved hjælp af 16S rRNA som markør. Selv om der var en forskel mellem levende og varme inaktiveret prøve, mængden tabt til varme inaktivering er for lille til at kompromittere downstream resultater. Stigende temperatur øgede ikke mængden af tabt RNA, hvilket betyder, at det observerede tab er uafhængigt af varmebehandlingen. Varmebehandling ved høje temperaturer forårsager sandsynligvis cellelyse, hvilket udsætter RNA for nedbrydning af RNases. Faktisk øgede udefrakommende tilsætning af RNase A til varmen inaktiveret fraktion hastigheden af RNA nedbrydning. Kogning reducerede ikke aktiviteten af RNase, hvilket indebærer, at det er et meget modstandsdygtigt protein.
Det er vigtigt at bemærke, at en gennemsnitlig RNA-nedbrydning på 1,5 log10 eCFU/ml ikke er et stort tab. Til dette formål antager vi, at opvarmning en lille del af Mtb bacilli, og dermed udsætter en lille mængde RNA for RNase. Ved hjælp af TEM viste vi, at Mtb celle morfologi og integritet af cellevæggene er næppe påvirket af opvarmning ved 95 °C. Det betyder , at det kan kræve forskellige fysiologiske faktorer og tilstrækkelig forsyning af RNases såsom i værten til væsentligt nedbrydeRNA35,36. Desuden er en strukturel ribosom, 16S rRNA er potentielt mindre modtagelige for RNase37,38. En enkelt Mtb celle indeholder ~ 700 ribosomer/0,1 mm3 af cytoplasma37,hvilket indebærer, at der er større mængder af rRNA per celle. Således kan mindre mængder af RNase have en mindre virkning38. Tilstedeværelsen af et stort antal ribosomer giver TB-MBLA en fordel med hensyn til følsomhed og evne til at opdage patienter med lav byrde.
Der var en stærk sammenhæng mellem bakteriel belastning målt ved TB-MBLA og MGIT kultur TTP. Dette bekræfter bakteriel belastning som føreren af kultur positivitet til en vis grad. Fordelen ved TB-MBLA er imidlertid, at det direkte kvantificerer den bakiliære belastning, der er til stede i prøven, og ikke kræver Mtb-celleproliferation før påvisning. Dette står i kontrast til kultur, hvis tid til positivitet afhænger af niveauet af bakteriel belastning og hastigheden af Mtb celleproliferation. Fremtidige undersøgelser vil evaluere TB-MBLA arbejdsgangen, herunder varme inaktivering, i rutinemæssige kliniske indstillinger. Undersøgelsen vil også undersøge prøver med en række bakterielle belastninger for at forstå det antal, der kan ændre sig fra positiv til negativ (dvs. dem med færre bakterier efter varme inaktivering).
TB-MBLA-protokollen for molekylær kvantificering af bakteriebelastningen er den første af sin art i bakteriologi. Metoden kvantificerer direkte Mtb-bakteriebelastningen fra patientspyt og kræver ingen kultur at gøre det. Dette gør det hurtigere og øger dens potentiale til at informere en klinisk beslutning om patientens fremskridt. Varmeinaktiveringstrinnet reducerer risikoen for infektion og øger anvendeligheden af TB-MBLA i indstillinger, der ikke har et kategori 3-laboratorium. Efter varmeinaktivering af prøven er der tre protokoltrin til at opnå TB-MBLA-resultater: RNA-ekstraktion, omvendt transkriptase (RT)-qPCR og qPCR-resultatanalyse.
Jo højere effektiviteten af isolering af Mtb RNA fra en patientprøve, jo højere kvalitet af resultaterne. Det er vigtigt at bemærke, at kvaliteten af spytprøven påvirker mængden af RNA isoleret. For eksempel betragtes spytspyt spyt spyt sputum som lav kvalitet og har været forbundet med lav bacillary belastning. Det betyder, at det er vigtigt at uddanne patienten til kvalitetssputumexpectoration. For at vurdere ekstraktionsprocessens effektivitet tilsættes der en ekstraktionskontrol (dvs. det kendte antal ikke-Mtb-celler) i prøven før RNA-ekstraktion. Udtagning af ekstraktionskontrollen bekræfter effektiviteten af RNA-ekstraktionsprocessen. RNA-isolationsprocessen kan ikke være gyldig, medmindre ekstraktionskontrollen er hentet. I betragtning af, at Mtb er en modstandsdygtig organisme gør mekanisk lysis en afgørende del af processen. Homogenisering af prøven ved høj hastighed (600 rpm) ved tilstedeværelse af perler (dvs. lysing matrix) effektivt lyser cellerne. Rensning af lysatet giver et ekstrakt, der indeholder både RNA og DNA. Fjernelse af DNA er et afgørende sidste skridt i RNA-ekstraktionen. TB-MBLA har til formål at måle levedygtige bacilli ved at kvantificere RNA. Således, manglende fjernelse genomisk DNA betyder, at resultaterne vil have et signal fra DNA, som ikke er en god markør for celle levedygtighed6.
RT-qPCR er en duplex, der kører dobbeltmærkede sonder til Mtb og sudsugningskontrol. Det omfatter tre trin: 30 min omvendt transskription ved omvendt transkriptase ved 50 °C, 15 min denaturering ved 95 °C og 40 cyklusser af forstærkning ved 94 °C og 60 °C. Erhvervelse af fluorescens fra sonderne sker ved 60 °C (dvs. fragmentetforlængelsesstadiet). Det er vigtigt at bemærke, at TB-MBLA er blevet optimeret ved hjælp af en bestemt qPCR-maskine, så operatører, der bruger andre qPCR-platforme, bør optimere forholdene for deres udstyr. Effektiviteten af DNA-fjernelse kontrolleres ved at køre en enkelt reaktion pr. prøve i mangel af RT. Et positivt resultat af denne reaktion betyder ufuldstændig fjernelse af DNA. Høj byrde prøver, der har store mængder af DNA kan kræve dobbelt så meget DNase enzym til helt at fjerne DNA. Heldigvis, i høj bacillary belastning prøver, tilstedeværelsen af små mængder af DNA er mindre tilbøjelige til at påvirke resultatet fra RNA. Ribosomal RNA, TB-MBLA målet, forekommer naturligt i dobbelt så meget DNA37. I PCR, en no template control (NTC), som er det vand, der anvendes til at opløse PCR reagenser, kontrol for krydskontaminering med udefrakommende DNA eller RNA. Et positivt signal i NTC indebærer krydskontaminering og resultatet betragtes som ugyldigt. Det betyder, at alle løsninger, der er sammensat ved hjælp af dette vand, skal kasseres, og at nye er fremstillet med et friskt glas vand. Det er tilrådeligt at holde PCR vand i separate aliquots for at undgå forurening af alt vandet. En positiv kontrol (Mtb RNA) bruges til at kontrollere for den samlede effektivitet af PCR.
Resultatanalyse indebærer omdannelse af PCR Cqs til bakteriebelastning (dvs. de anslåede kolonidannende enheder pr. ml) ved hjælp af standardkurven. Indstilling og optimering af standardkurven er afgørende for dette trin. En standardkurveeffektivitet på 0,95-1 anbefales. Standardkurver for MTb og ekstraktionskontrol skal opsættes og optimeres, før patienter eller andre testprøver køres på maskinen. Standardprøver leveres med TB-MBLA-sættet. En tigangefortynding af RNA-ekstraktet anbefales til PCR. Dette indebærer, at resultatet af bakteriebelastningen skal ganges med en faktor på 10 for at opnå det endelige resultat for bakteriebelastning pr. ml. Det er vigtigt at bemærke, at Cqs over 30 betragtes som negative for TB-MBLA. Der kræves mindst to prospektive resultater af bakteriebelastningen målt på forskellige tidspunkter for at foretage en konklusion om behandlingsrespons. Det anbefales på det kraftigste, at et af de to resultater skal være baseline, før behandlingen påbegyndes. Men hvis patienten påbegyndt bakteriel belastning vurdering sker midtvejs gennem behandlingen, skal der være en anden gang punkt bakteriel belastning måling for at evaluere behandlingsrespons. TB-MBLA kan skelne bakteriel belastning i et rum på 3 dage på behandling, men det ideelle er to bakterielle belastning målinger taget 7 dage fra hinanden.
Mens protokollen genererer informative kvantitative resultater for behandlingsrespons, er den stadig i vid udstrækning manuel og kræver betydelige hænder til tiden for RNA-ekstraktion. Teknikere i travle laboratorier har måske ikke denne gang. Der er planer om at automatisere RNA-ekstraktions- og PCR-processerne.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev muliggjort ved finansiering fra European and Developing Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion program (PanBIOME) grant SP.2011.41304.008. Støtte blev også opnået University of St Andrews School of Medicine forskningslegat. Offentliggørelsen af dette manuskript og TB-MBLA protokol som en visuel ressource er blevet muliggjort af finansieringen fra Scottish Funding Council og Global Challenges Research Fund til University of St Andrews. Takket være Maputo Maternal hospital og Mavalane Health Centre, som leverede de kliniske spytprøver, og Maputo Tuberkulose Behandling Unit team, der hjalp med varmen inaktivering eksperimenter af kliniske spyt prøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
