डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए जमे हुए कृंतक मस्तिष्क क्षेत्रों का संग्रह
Summary
यह प्रक्रिया सस्ती और आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन और आरएनए प्राप्त करने के लिए असतत जमे हुए मस्तिष्क क्षेत्रों के संग्रह का वर्णन करती है।
Abstract
जैसा कि न्यूरोबायोलॉजी की हमारी समझ ने प्रगति की है, आणविक विश्लेषण अक्सर छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे कि मीकर प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी) या नाभिक एक्यूबेन्स पर किए जाते हैं। इस कार्य में चुनौती माइक्रोएनवायरमेंट को संरक्षित करते हुए सही क्षेत्र को विच्छेदन करने की है। इस पेपर में, हम अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध संसाधनों का उपयोग करके एक सरल, कम लागत वाली विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि पूरे प्रक्रिया में ऊतक को जमे हुए रखकर न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को संरक्षित करती है। दिमाग को मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग करके 0.5-1.0 मिमी वर्गों में काटा जाता है और जमे हुए ग्लास प्लेट पर व्यवस्थित किया जाता है। प्रत्येक खंड के भीतर स्थलों की तुलना एक संदर्भ से की जाती है, जैसे एलन माउस ब्रेन एटलस, और क्षेत्रों को ठंडे स्केलपेल या बायोप्सी पंच का उपयोग करके विच्छेदित किया जाता है। ऊतक तो उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। इस प्रक्रिया के माध्यम से चूहा और माउस एमपीएफसी, नाभिक एक्यूबेन, पृष्ठीय और वेंट्रल हिप्पोकैम्पस और अन्य क्षेत्रों का सफलतापूर्वक क्यूआरटी-पीसीआर और पश्चिमी परखों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया है। यह विधि मस्तिष्क क्षेत्रों तक सीमित है जिसे स्पष्ट स्थलों द्वारा पहचाना जा सकता है।
Introduction
यह काम एक गाइड के रूप में एलन माउस ब्रेन एटलस1जैसे संदर्भ का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन की निकासी के लिए जमे हुए मस्तिष्क क्षेत्रों के विच्छेदन को दिखाता है। इस तकनीक में, दिमाग को फ्लैश-फ्रोजन किया जाता है और बाद में अनुभागन और विच्छेदन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, जबकि जमे हुए स्थिति में बनाए रखा जाता है। यह प्रक्रिया शोधकर्ता को एक सत्र में बड़ी संख्या में दिमाग की कटाई करने और बाद में कई मस्तिष्क क्षेत्रों के सटीक संग्रह के लिए उन्हें विच्छेदन करने की अनुमति देती है।
जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति से संबंधित सवालों का जवाब देते समय अक्सर मस्तिष्क के हित क्षेत्रों (आरओआई) के सटीक संग्रह की आवश्यकता होती है। जबकि फार्माकोलॉजी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग वाइल्डटाइप या आनुवंशिक रूप से संशोधित कृंतक पर किया जा सकता है ताकि आणविकपरिवर्तनोंको कम करने में मदद मिल सके2,3,,4,ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटेम में प्रेरित परिवर्तनों की माप का उपयोग अक्सर इन निष्कर्षों का समर्थन करने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर), वेस्टर्न ब्लॉटिंग, आरएनएसईक्यू5,मैपसेक्यू6 और एचपीएलसी7 जैसी तकनीकें मजबूत और अपेक्षाकृत कम लागत में हैं, जिससे कई प्रयोगशालाओं को छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों2,4,,55,6के भीतर प्रेरित आणविक परिवर्तनों का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है।,
मस्तिष्क क्षेत्रों8,9,, 10 ,,,11,12से न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन निकालने और शुद्ध करने के कई तरीके हैं .10 कई प्रयोगशालाएं9,13फसल के समय बर्फ पर दिमाग को हल्का और काटकर मस्तिष्क क्षेत्रों की फसल करती हैं । हालांकि इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन हो सकते हैं, यह कुछ समय सीमित है क्योंकि ऊतक के सूक्ष्म वातावरण के भीतर गिरावट इन तापमानों पर हो सकती है। यह विशेष रूप से सच हो सकता है जब एक बैठे में बड़ी संख्या में जानवरों या आरओआई को विच्छेदन करने का प्रयास किया जाता है। नमूनों को जमे हुए रखने में मदद करता है labile लक्ष्य अणुओं को बनाए रखने जबकि शोधकर्ता समय प्रदान करने के लिए ध्यान से अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों को इकट्ठा करने के प्रयास में प्रत्येक खंड के दोनों ओर स्थलों की तुलना । लेजर कैप्चर मस्तिष्क क्षेत्रों10से आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए ऊतक एकत्र करने का एक और तरीका है। यह प्रक्रिया यांत्रिक विच्छेदन से बेहतर है कि बहुत छोटे और अनियमित आकार के आरओआई की पहचान की जा सकती है और अलग-थलग किया जा सकता है। हालांकि, लेजर कैप्चर महंगे उपकरणों और अभिकर्मकों के उपयोग से सीमित है, समय लेने वाला है और नमूना क्षरण के लिए अधिक संवेदनशील भी हो सकता है।
जमे हुए ऊतकों पर माइक्रोपंच विच्छेदन नया नहीं है। मिक्लोस पालकोविट्स और अन्य द्वारा प्रारंभिक कागजात में मूल तकनीकों काविस्तार,से वर्णन किया गया है। यह प्रस्तुति काफी हद तक मूल काम का अनुसरण करती है, जिसमें दक्षता की सुविधा और आवश्यक उपकरणों की कीमत को कम करने के लिए कुछ सुधार होते हैं। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क वर्गों को क्रायोस्टेट के बजाय जमे हुए मस्तिष्क ब्लॉक में बनाया जाता है। यह मोटा वर्गों का उत्पादन करता है जो आरओआई नमूनों को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक वर्गों की संख्या को कम करता है। यह विधि एक जमे हुए ग्लास प्लेट पर नमूनों को विच्छेदित करती है जो एक अछूता बॉक्स के भीतर सूखी बर्फ पर बैठता है। यह बेंच पर एक उप ठंड चरण पैदा करता है जिस पर काम करने के लिए । इस तरह से विच्छेदित अनुभाग आसानी से जोड़-तोड़ कर सकते हैं, जिससे शोधकर्ता वांछित आरओआई के बाहर के क्षेत्रों से संदूषण को सीमित करने के लिए प्रत्येक अनुभाग के दोनों पक्षों की तुलना संदर्भ के साथ कर सकता है।
इस प्रोटोकॉल के फायदे यह हैं कि 1) मस्तिष्क को पूरे प्रक्रिया में एक जमे हुए स्थिति में रखा जाता है, जो प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को संरक्षित करने में मदद करता है और शोधकर्ता को सावधानीपूर्वक फसल ROIs करने का समय देता है, और 2) आवश्यक अभिकर्मक सस्ती होते हैं और अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में पाए जाते हैं। इस प्रक्रिया में, पूरे दिमाग को मस्तिष्क मैट्रिक्स में 0.5-1.0 मिमी तक अनुभागित किया जाता है और एक जमे हुए ग्लास प्लेट पर रखा जाता है जो लगातार सूखी बर्फ के साथ ठंडा होता है। एलन ब्रेन एटलस 1 या अन्य मस्तिष्क एटलस16,,17 में पाए जाने वाले स्थलों का उपयोग ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए किया जाता है, जो तब एक ठंडा पंच या स्केलपेल का उपयोग करके विच्छेदित होते हैं।1 क्योंकि ऊतक कभी गल नहीं जाता है, इस तरीके से काटे गए क्षेत्र डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए और प्रोटीन प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के क्षरण को सीमित करते हुए मस्तिष्क के छोटे, विशिष्ट क्षेत्रों को अलग करने की तकनीक का वर्णन करता है। मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान एक जीव के मरने के बाद जल्दी होता है। यह ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच, डीए043982 और डीए046196 ने सपोर्ट किया।
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
- RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
- . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)
