Samling av frosne gnagerhjerneregioner for nedstrøms analyser

Summary

Denne prosedyren beskriver samlingen av diskrete frosne hjerneregioner for å oppnå protein av høy kvalitet og RNA ved hjelp av billige og allment tilgjengelige verktøy.

Abstract

Etter hvert som vår forståelse av nevrobiologi har utviklet seg, utføres molekylære analyser ofte på små hjerneområder som medial prefrontal cortex (mPFC) eller nucleus accumbens. Utfordringen i dette arbeidet er å dissekere riktig område samtidig som mikromiljøet undersøkes. I denne artikkelen beskriver vi en enkel, rimelig metode ved hjelp av ressurser som er lett tilgjengelige i de fleste laboratorier. Denne metoden bevarer nukleinsyre og proteiner ved å holde vevet frosset gjennom hele prosessen. Hjernen er skåret i 0,5–1,0 mm seksjoner ved hjelp av en hjernematrise og ordnes på en frossen glassplate. Landemerker i hver del sammenlignes med en referanse, for eksempel Allen Mouse Brain Atlas, og regioner dissekeres ved hjelp av en kald skalpell eller biopsipunch. Vev lagres deretter ved -80 °C til bruk. Gjennom denne prosessen rotte og mus mPFC, nucleus accumbens, dorsal og ventral hippocampus og andre regioner har blitt vellykket analysert ved hjelp av qRT-PCR og vestlige analyser. Denne metoden er begrenset til hjerneregioner som kan identifiseres av klare landemerker.

Introduction

Dette arbeidet illustrerer disseksjon av frosne hjerneregioner for utvinning av nukleinsyre eller protein av høy kvalitet ved hjelp av en referanse, for eksempel Allen Mouse Brain Atlas¹, som en guide. I denne teknikken blir hjernen flash-frosset og lagret ved -80 °C for senere snitting og disseksjon mens de opprettholdes i frossen tilstand. Denne prosessen gjør det mulig for forskeren å høste et stort antall hjerner i en økt og senere dissekere dem for en nøyaktig samling av flere hjerneregioner.

Den nøyaktige samlingen av hjerneregioner av interesse (ROIer) er ofte nødvendig når du svarer på spørsmål knyttet til gen- og proteinuttrykk. Mens farmakologi, elektrofysiologi og optogenetikk kan brukes på villtype eller genmodifiserte gnagere for å bidra til å belyse molekylære endringer underbygge observert atferd^2,3,4, målingen av induserte endringer i transkripsjoner og proteomer brukes ofte til å støtte disse funnene. Teknikker som kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR), western blotting, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ og HPLC⁷ er robuste og relativt lave i pris, slik at mange laboratorier kan studere indusertmolekylære endringer i små hjerneregioner^2,4,5,6.

Det er flere måter å trekke ut og rense nukleinsyre eller protein fra hjerneregioner^8,9,10,11,12. Mange laboratorier høster hjerneregioner ved å kjøle og kutte hjerner på is på tidspunktet for innhøsting^9,13. Selv om denne tilnærmingen kan resultere i kjernesyre og protein av høy kvalitet, er det noe tidsbegrenset som nedbrytning i mikromiljøet i vevet kan finne sted ved disse temperaturene. Dette kan være spesielt sant når du prøver å dissekere et stort antall dyr eller ROIer i en sittende. Holde prøver frosset bidrar til å opprettholde labile målmolekyler samtidig som forskeren tid til å nøye sammenligne landemerker på begge sider av hver seksjon i arbeidet med å samle relativt rene prøver. Laserfangst er en annen måte å samle vev for RNA eller proteinanalyse fra hjerneområder¹⁰. Denne prosedyren er bedre enn mekanisk disseksjon ved at svært små og uregelmessig formede ROIer kan identifiseres og isoleres. Laserfangst er imidlertid begrenset av bruk av dyrt utstyr og reagenser, er tidkrevende og kan også være mer utsatt for prøvenedbrytning.

Mikropunch disseksjon på frosne vev er ikke nytt. Tidlige papirer av Miklos Palkovits og andre beskriver de grunnleggende teknikkene i detalj^14,15. Denne presentasjonen følger i stor grad det opprinnelige arbeidet, med noen forbedringer for å lette effektiviteten og redusere kostnadene for utstyret som trengs. For eksempel er hjerneseksjoner laget i en frossen hjerneblokk i stedet for på en kryostat. Dette gir tykkere seksjoner som reduserer antall seksjoner som trengs for å samle inn avkastningsprøver. Denne metoden dissekerer også prøver på en frossen glassplate som sitter på tørris i en isolert boks. Dette gir en sub-frysing scenen på benken som å jobbe. Seksjoner dissekert på denne måten er lett manipuleres, slik at forskeren kan sammenligne begge sider av hver seksjon med en referanse for å begrense forurensning fra regioner utenfor ønsket avkastning.

Fordelene med denne protokollen er at 1) hjernen holdes i en frossen tilstand gjennom hele prosessen, noe som bidrar til å bevare protein og nukleinsyre og gir forskeren tid til å nøye høste ROIer, og 2) reagensene som kreves er billig og finnes i de fleste molekylærbiologilaboratorier. I denne prosessen er hele hjernen delt til 0,5–1,0 mm i en hjernematrise og plassert på en frossen glassplate som kontinuerlig avkjøles med tørris. Landemerker funnet i Allen Brain Atlas¹ eller andre hjerneatlas^{16,brukes 17} til å identifisere områder av interesse, som deretter dissekeres ved hjelp av enten et kaldt slag eller skalpell. Fordi vevet aldri tines, gir regioner høstet på denne måten høy kvalitet RNA og protein for nedstrøms analyser.

Protocol

Dyr som brukes i denne studien ble behandlet på en etisk og human måte som fastsatt av Indiana University’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og National Institutes of Health (NIH) retningslinjer. MERK: Alle verktøy og overflater skal vaskes med et passende løsningsmiddel for å fjerne nukleone18 før du starter noe arbeid. 1. Lagring av hjerner Fjern raskt hjernen fra eutaniserte voksne CD1 wildtype mus som ve…

Representative Results

For å validere denne metoden ble den mediale prefrontale cortex samlet inn fra voksne CD1 wildtype hannmus og RNA og protein ble ekstrahert og karakterisert. RNA ble analysert av kapillær elektroforese. Degradert RNA viser et tap i intensiteten av 28S og 18S ribosomal band og viser også nedbrytningsprodukter som et smør mellom 25 og 200 nukleotider (Figur 5A, eksempel 1). Rna av høy kvalitet viser distinkte ribosomale bånd med lite eller ingen signal i den lavere molekylvektregionen (<…

Discussion

Dette arbeidet beskriver en teknikk for å isolere små, spesifikke områder av hjernen samtidig som de begrenser nedbrytning av nukleinsyre og protein. Skade på hjernevev skjer raskt når en organisme dør. Dette skyldes delvis en rask oppbygging av ekstracellulær glutamat og den resulterende eksitotoksisiteten som oppstår²¹. Messenger RNA er spesielt utsatt for nedbrytning^22,23. Nedbrytning av protein og nukleinsyre reduseres sterkt v…

Materials

0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue