Summary
Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.
Abstract
Nörobiyoloji anlayışımız ilerledikçe, moleküler analizler genellikle medial prefrontal korteks (mPFC) veya nükleus accumbens gibi küçük beyin bölgelerinde yapılır. Bu çalışmada sorun incelenecek mikroortamı korurken doğru alanı incelemektir. Bu yazıda, çoğu laboratuvarda kolayca bulunan kaynakları kullanarak basit, düşük maliyetli bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, işlem boyunca doku dondurulmuş tutarak nükleik asit ve proteinleri korur. Beyinler bir beyin matrisi kullanılarak 0.5-1.0 mm kesitler halinde kesilir ve donmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Her bölümdeki yerler Allen Mouse Beyin Atlası gibi bir referansla karşılaştırılır ve bölgeler soğuk neşter veya biyopsi yumruğu kullanılarak kesilir. Doku daha sonra kullanıma kadar -80 °C'de saklanır. Bu işlem sayesinde sıçan ve fare mPFC, nucleus accumbens, dorsal ve ventral hipokampus ve diğer bölgelerde başarıyla qRT-PCR ve Batı tahlilleri kullanılarak analiz edilmiştir. Bu yöntem açık yerler tarafından tespit edilebilir beyin bölgeleri ile sınırlıdır.
Introduction
Bu çalışma, bir rehber olarak Allen Mouse Beyin Atlası1gibi bir referans kullanarak yüksek kaliteli nükleik asit veya protein çıkarılması için dondurulmuş beyin bölgelerinin diseksiyon göstermektedir. Bu teknikte beyinler flaş dondurulmuş ve dondurulmuş bir durumda muhafaza edilirken daha sonra kesit ve diseksiyon için -80 °C'de saklanır. Bu süreç araştırmacı bir oturumda beyin çok sayıda hasat ve daha sonra birden fazla beyin bölgeleri doğru bir koleksiyon için onları incelemek için izin verir.
Gen ve protein ekspresyonu ile ilgili soruları yanıtlarken genellikle beyin bölgelerinin (ROI) doğru toplanması gereklidir. Farmakoloji, elektrofizyoloji ve optogenetik yabani tip veya genetiği değiştirilmiş kemirgenler üzerinde gözlenen davranışları destekleyen moleküler değişikliklerin aydınlatılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir iken2,3,4, transkripsiyon ve proteomlarda indüklenen değişikliklerin ölçümü genellikle bu bulguları desteklemek için kullanılır. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), batı lekeleme, RNAseq5,MAPSeq6 ve HPLC7 gibi teknikler sağlam ve nispeten düşük maliyet, birçok laboratuvarküçük beyin bölgeleri içinde indüklenen moleküler değişiklikleri incelemek için izin2,4,5,6.
Beyin bölgelerinden nükleik asit veya protein ayıklamak ve arındırmak için çeşitli yollar vardır8,9,10,11,12. Birçok laboratuvarlar hasat sırasında buz üzerinde beyinleri dondurup keserek beyin bölgelerini hasat eder9,13. Bu yaklaşım yüksek kaliteli nükleik asit ve proteine yol açsa da, bu sıcaklıklarda dokunun mikro ortamında bozulma olabileceğinden biraz zaman sınırlıdır. Bu özellikle bir oturuşta çok sayıda hayvanı veya ROI'yi incelemeye çalışırken doğru olabilir. Numuneleri dondurulmuş tutmak, araştırmacıya nispeten saf numuneler toplama çabasında her bölümün her iki tarafındaki simgeleri dikkatle karşılaştırması için zaman sağlarken, labile hedef moleküllerinin korunmasına yardımcı olur. Lazer yakalama beyin bölgelerinden RNA veya protein analizi için doku toplamak için başka bir yoldur10. Bu işlem, çok küçük ve düzensiz şekilli ROI'ların tespit edilip izole edilebildiği mekanik diseksiyondan daha üstündür. Ancak, lazer yakalama pahalı ekipman ve reaktiflerin kullanımı ile sınırlıdır, zaman alıcı ve aynı zamanda örnek bozulmasına daha duyarlı olabilir.
Dondurulmuş dokularda mikropunch diseksiyonu yeni değildir. Miklos Palkovits ve diğerleri tarafından erken kağıtları ayrıntılı olarak temel teknikleri açıklamak14,15. Bu sunum büyük ölçüde verimliliği kolaylaştırmak ve gerekli ekipman giderini azaltmak için bazı iyileştirmeler ile, orijinal çalışma izler. Örneğin, beyin bölümleri dondurulmuş beyin bloğu yerine bir kriyostat yapılır. Bu, yatırım getirisi örnekleri toplamak için gereken kesit sayısını azaltan daha kalın bölümler üretir. Bu yöntem aynı zamanda yalıtılmış bir kutu içinde kuru buz üzerinde oturur dondurulmuş cam plaka üzerinde örnekleri inceler. Bu, üzerinde çalışmak için tezgah bir alt donma aşaması üretir. Bu şekilde incelenen bölümler kolayca manipüle edilebilir, böylece araştırmacı her bölümün her iki tarafını da istenilen Yatırım Getirisi dışındaki bölgelerden gelen kontaminasyonu sınırlamak için bir referansla karşılaştırmak için.
Bu protokolün avantajları 1) beyin protein ve nükleik asit korunmasına yardımcı olur ve dikkatle ROI hasat için araştırmacı zaman verir ve 2) gerekli reaktifler ucuz ve en moleküler biyoloji laboratuarlarında bulunan süreç boyunca dondurulmuş bir durumda tutulur. Bu süreçte, tüm beyinler bir beyin matris0.5-1.0 mm kesitli ve sürekli kuru buz ile soğutulmuş bir dondurulmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Allen BeyinAtlası bulunan Yerler 1 veya diğer beyin atlasları16,17 ilgi bölgelerini tanımlamak için kullanılır, hangi sonra soğuk bir yumruk veya neşter kullanılarak kesilir. Doku asla çözülmemedığından, bu şekilde hasat edilen bölgeler, downstream analizleri için yüksek kaliteli RNA ve protein sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergeleri tarafından belirlenen etik ve insancıl bir şekilde ele alındı.
NOT: Tüm aletler ve yüzeyler, herhangi bir işe başlamadan önce18 nükleazları çıkarmak için uygun bir çözücü ile yıkanmalıdır.
1. Beyinlerin depolanması
- Geleneksel bir yaklaşım13 kullanarak yaklaşık 30 g ağırlığındaki ötenazi yetişkin CD1 wildtype farelerin beyinlerini hızlı bir şekilde çıkarın ve kuru buzla önceden soğutulmuş isopentane 60 saniye boyunca flaş dondurun.
- Dondurulmuş beyinleri -80 °C'de alüminyum folyo veya konik tüplerde kullanıma kadar saklayın.
2. Beyin matrisinin hazırlanması
- Doku ları incelemeden 24 saat önce, erimiş dondurucu paketleri yığınına temiz bir beyin matrisi (Bkz. Malzemeler Tablosu)yerleştirin. Sandviç iki dondurucu paketleri arasında matris kenarları jilet yuvalarının alt ve jel paketlerinin üst arasında yaklaşık 0,5 cm bırakmak emin olun(Şekil 1A). Soğutma yardımcı olmak için uçları alüminyum folyo yerleştirin.
NOT: Bir beyin matrisi satın alırken, kesilecek beynin tüm hacmini kaplayacak kadar büyük bir tane satın alın. - Beyin matrisi ve dondurucu paketlerini içeren kutuyu -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
3. Dondurulmuş cam plaka kurma
NOT: Bu kurulumun amacı, beyin kesitlerini incelemek için donmuş bir yüzey hazırlamaktır.
- Üstten yaklaşık 5 cm kadar yalıtılmış bir kutuya buz yerleştirin. Daha sonra buzun üzerine 2,5 cm'lik kuru buz tabakası yerleştirin ve numunenin görselleştirilmesine yardımcı olmak için siyah plastik kaplama ile örtün(Şekil 1B, Şekil 1C).
- Plastik üzerine cam bir tabak (sadece kutunun açılmasına sığmalıdır) yerleştirin ve uzak köşelerde plakanın üstüne kuru buz yerleştirin(Şekil 1C).
- Dondurucudan donmuş beyin matrisini alın ve beyni korteks tarafına doğru kesecek şekilde yerleştirin. Kutudaki sıcaklığı 10 dakika boyunca dengelemesine izin verin.
- Beynin matristeki pozisyonunu soğuk çözgülerle ayarlayın, böylece sagittal sinüs ve enine sinüs bloğun dik oluklarıyla hizaya getirin(Şekil 1D). Bu daha kolay diseksiyon için simetrik bölümlerin sağlanmasına yardımcı olacaktır. Beyni ayarlamadan önce soğumak için buzun kuruması için püre uçlarıdokunun.
- Beyin yerleştirildikten sonra, merkezine yakın bir soğutulmuş jilet yerleştirin ve bıçağı dokuya yaklaşık 1 mm bastırın. Beynin yerinde tutmasına yardımcı olmak için rostral ve kaudal uçlara soğutulmuş bıçaklar ekleyin(Şekil 2A ve Şekil 2B).
- Rostral ucundan başlayarak, bıçakları birer birer birer ekleyerek yuvalara yerleştirip yavaşça dokuya bastırarak yaklaşık 1 mm(Şekil 2B)ekleyin. Kaudal uçlara doğru çalışan 1 mm aralıklarla bıçak eklemeye devam edin.
- Bu süre içinde beynin kaymadığından emin olun. Bıçakları yatay ve dikey olarak hizala (Şekil 2B). Kesitleri 0,5 mm genişlikte kesmek için düşük profilli mikrotom bıçakları (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılabilir. Bunları daha büyük jiletlerin arasına yerleştirin (Şekil 2C).
- Bıçaklar yerleştirildikten sonra, parmakları, avuç içi veya başka bir düz yüzeyle grubun üstüne bastırın(Şekil 2C, Şekil 2D). Bıçak grubunu yavaşça bir taraftan diğer yana sallayarak dokuda hareket ettirin.
NOT: Bu biraz zaman alabilir (1-2 dk) ve sabır gerektirir. Dokuda hareket eden bıçaklara karşı direnç olmalı. Kolay giriş beyin erime ve blok kuru buz ile soğutulması gerektiği anlamına gelir. - Tüm bıçaklar yuvaların altına ulaştığında, bıçak grubunun her iki tarafını da tutun ve ileri geri sallayarak matristen uzak çalışın.
NOT: Bıçakların keskin kenarlarında kendini kesmemek için dikkatli olun. - Grup serbest kaldıktan sonra, desteyi, rostral tarafını yukarı, cam plakanın üzerine yerleştirin (Şekil 2E). Daha kolay ayrıştırmak için numuneleri daha fazla dondurmak için kuru buzu yığının yanına ve/veya üzerine yerleştirin.
- Desteyi keskin kenarları olan desteyi cam plakaya ve ayrı bıçaklara yerleştirerek desteyi başparmaklar ve parmaklar arasında kaydırın. Bıçaklar birbirine bağlı bölümlerle ayrılmalıdır.
- Rostral'dan kaudal'a kadar cam plaka üzerindeki bölümleri sıralayın (Şekil 2F).
- Bıçakları parmaklar arasında esneterek veya ikinci bir soğuk jiletle ayırarak bıçaklardan ayrı doku(Şekil 2G,2H,2I).
4. Kesitlerin kesilmesi
- Allen Mouse Beyin Atlası'nı veya başka bir referansı açın ve ilgi çekici bölgeleri belirlemek için gerekli olan simge seli bulun. Bazı belirgin yerler anterior komissür, korpus callosum, lateral ventriküller ve hipokampus içerir (Şekil 3).
- Soğutulmuş çömeçlerle kesilecek bölümü çevirin ve toplanacak bölgenin bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olun. Hasat sırasında, doğru yatırım getirisielde olduğundan emin olmak için genellikle referans atlası danışın.
NOT: Büyüteç veya diseksiyon mikroskobu genellikle bu süreçte yararlıdır. İyi aydınlatma da gereklidir. Düşük watt LED lambalar veya serin bir lamba (Malzeme Tablosubakınız) bu amaç için kullanılabilir. - Temiz bir neşter veya yumruk ile, bölüm(Şekil 4)içine kesilmiş. Her aleti kısa bir süre donatarak buzun kuruması için kesmeden önce önceden soğutun. Bıçağı hafifçe ama sıkıca dokuya doğru itin, keserek ileri geri sallayın. Çok sert itme yoksa doku kırılacaktır.
NOT: Araçlar zamanla ısınır. Hafif ısınmış bıçaklar temiz kesim yapımında yararlı olabilir ve kırılma sınırlayabilir, ancak doku erimeönlemek için dikkatli olun. Periyodik olarak kuru buz üzerinde aletleri chill. - Bir yatırım getirisi hasat edildikten sonra, etiketli, önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpler içine yerleştirin. Hasat edilen dokuları -80 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
- Soğuk RIPA tamponu (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS ve protein inhibitörü kokteyl (Malzemeler Tablosubakınız ) protein ekstraksiyon için, ya da guanidinium içeren çözücü (Malzemeler Tablosubakınız) dondurulmuş örnek rna çıkarma ve hemen bir cam Dounce veya mekanik geni homozer kullanarak homojenleştirmek (Malzemeler Tablosubakınız). Bu şekilde, proteaz ve nükleaz inhibitörleri, protein ve nükleik asitleri bozulmadan korumak için ısıtındıkça yerinde olurlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD1 wildtype erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein elde edilmiştir. RNA kapiller elektroforez ile analiz edildi. Bozulmuş RNA, 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp gösterir ve ayrıca 25 ile 200 nükleotit arasında yayma olarak bozunma ürünlerini gösterir(Şekil 5A, örnek 1). Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede çok az veya hiç sinyal olmayan belirgin ribozomal bantlar gösterir(Şekil 5A, örnek 2). Bu çözümlemede RNA bütünlük numaraları (RINs) de oluşturulur. 7'nin üzerindeki RIN'ler kaliteli RNA19'ugösterir. Dondurulmuş diseksiyon yöntemi kullanılarak örneklerden izole edilen RNA, güçlü ribozomal bantlama ve taze hasat edilen dokudan hazırlanan RNA ile çok olumlu karşılaştırılan yüksek RIN değerleri sergiler(Şekil 5B).
Bu yöntemin bir avantajı beyinlerin çok sayıda hızlı bir şekilde hasat ve daha sonra dikkatle incelenecek bir oturuşta saklanabilir olmasıdır. ROI'lar dokular çözülmeden de saklanabilir. Bu yöntemle, bir araştırmacı yüksek kaliteli nükleik asit veya protein elde edilebilir ROIs büyük ve çeşitli bir koleksiyon toplayabilir. Bu noktayı doğrulamak için, RNA birkaç hafta boyunca saklanan diseksiyonmmat mPFC'den çıkarıldı (hasat edilen beyinler birkaç ay boyunca depolandı). Tüm numuneler farklı ribozomal bantlama ve 8'in üzerindeki RIN'lere sahip yüksek kaliteli RNAüredin (Şekil 5C).
Batı leke analizi daha önce açıklandığı gibi dondurulmuş diseksiyon mPFC protein bütünlüğünü doğrulamak için kullanılmıştır20. Batı lekeleri, protein bozulduğunda yüksek molekül ağırlıklı hedeflerin azaltılmış sinyalini gösterir. Bozulma ürünleri de sütun içinde düşük molekül ağırlıklarında bir yayma olarak gösterir. Bu analiz için protein toplandı, nitroselüloza aktarıldı ve yüksek molekül ağırlıklı hedef KCC2 ve düşük molekül ağırlıklı protein olan aktin(Şekil 5D)karşı antikorlarla incelendi. Her durumda, bantları keskin ve farklı ya KCC2 veya actin için fark edilebilir arıza ürünleri ile edildi. Bu deneyler, bu yöntemi kullanarak ROI diseksiyonu yüksek kaliteli RNA ve protein çıkarma sağlar onaylayın.
Şekil 1: Dondurulmuş çalışma yüzeylerinin hazırlanması. (A) Bir beyin bloğu yalıtımlı bir kutu içinde jel paketleri bir yığın yerleştirilir ve daha sonra iki ek jel paketleri arasında sandviç. Alüminyum folyo kesit sırasında soğutma kolaylaştırmak için bloğun her iki ucunda paketlenir. Kutu daha sonra gece boyunca -20 °C'de soğutulür. (B) Cam bir plaka, yalıtımlı bir kutunun açılmasıyla boyuta göre eşleşir. Bir nakliye kutusu bu amaç için kullanılabilir. Üstten yaklaşık 5 cm olana kadar kutuya buz eklenir. Kutu daha sonra -20 °C'de bir gecede dondurulur. (B, C) Doku toplamadan hemen önce, yaklaşık 2,5 cm derinlikte buzun üzerine düzgün bir kuru buz tabakası yerleştirilir. Siyah plastik bir levha (görselleştirme yardımcı olmak için) cam plaka takip kuru buz üzerine yerleştirilir. Kuru buz, tabağın hemen üstündeki havayı soğutan uzak köşelere yerleştirilir. Aletler tabakta döşenerek veya kuru buza kısa bir süre dokunarak soğutulabilir. (D) Simetrik kesitler sağlamak için, beyin soğuk çerkeslerle konumlandırılmalı, böylece sagittal sinüs ve enine sinüs bloğun dik olukları (beyaz oklar) ile hizalanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beyin bloğu kullanarak beynin kesilmesi. (A) Beynin oryantasyonu yaklaşık 1 mm derinlikte korteksiçine geleneksel tek kenarlı jiletler yerleştirerek demirlenir. (B) Tüm yuvalar dolana kadar bıçakları birer birer ekleyin. (C) 0,5 mm'lik kesitler (kırmızı ok) istendiğinde konvansiyonel bıçaklar arasına düşük profilli bıçaklar takılabilir. (C, D) Bıçak grubu ya düz bir alet ya da avuç içi veya el parmakları kullanılarak, orta aşağı doğru basınç ile dondurulmuş doku içine itilir. Bıçaklar yavaş yavaş ileri geri doku onları hareket yardımcı olmak için sallanır. (E) Kesitler jiletlerin kenarları kavranarak ve sallanan bir hareket ve sağlam yukarı doğru basınç kullanılarak kaldırılır (Dikkat: Bıçakların keskin uçlarından kaçınmaya dikkat edin). Grubu bloktan kaldırın ve donmuş cam plakanın üzerine ön tarafı yerleştirin. Ayrılmadan önce tamamen soğutma bölümleri için bıçaklar bitişik kuru buz yerleştirin. (F) Ayrı bıçaklar ve sırayla bölümleri düzenlemek. (G, H) Kesitler bıçakları okların yönüne parmaklarla hafifçe esneterek ve ikinci bir soğuk bıçakla kesiti iterek bıçaklardan çıkarılabilir. (I) Bazı bölümler, jiletin parmaklar ve başparmaklar arasında hafifçe ısıtılmasını ve daha sonra donmuş bölümü ikinci bir soğuk bıçakla hızlıca dilimleyerek çıkarılmasını gerektirebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yer işaretleri ve Allen Mouse Beyin Atlası kullanarak ROI'ların belirlenmesi. Bu örnekte, dondurulmuş beyin bölümleri sağda Allan Mouse Beyin Atlası karşılık gelen plakaları ile sol tarafta. ROI'lar (kırmızı noktalı anahatlar) görünür simgeleri (siyah şekiller) Ile Allen Mouse Beyin Atlası ile karşılaştırArak tanımlanır. Yerler şunlardır: fa ve cc, corpus callosum, aco, anterior komiser, VL, lateral ventrikül, V3, üçüncü ventikül. Örnek ROI'lar: Pl/Il, prelimbik ve infralimbik korteks, ACB, nucleus accumbens, MOs, motor korteks, CP, caudoputamen, HPF, hipokampus/dentat girus. Doğru kredi Coronal atlas görüntüleri: Allen Enstitüsü. Görüntüler 40, 44, 55 ve 71 plakalarından (yukarıdan aşağıya) ve https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas elde edilebildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RoI'ların kesilmesi. (A) Kesitler kuru buz üzerinde periyodik olarak soğutulan forceps kullanılarak işlenir. Her bölümün her iki tarafı da diseksiyondan önce ilgili atlas görüntüleriile karşılaştırılmalıdır. (B) ROI'lar soğuk neşter veya (C)biyopsi siması ile beyin bölümlerinden çıkarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Dondurulmuş beyin diseksiyonu yöntemi ile RNA ve protein analizi. (A) Düşük ve kaliteli RNA örneği. Örnek 1'in elektroforetik ayrımı, zayıf 28S ve 18S bantları ve 25 ile 200 nükleotit (nt) arasında bozunma ürünleri ile bozulmuş RNA görüntüler. Örnek 2, güçlü 28S ve 18S bantları ve düşük molekül ağırlıklarında az sinyal ile kaliteli RNA'yı gösterir. RNA bütünlük sayıları bu farkı örnek 1, RIN = 2.5 ve örnek 2, RIN = 8.6 ile yansıtır. (B) Dondurulmuş tan elde edilen RNA ile farelerin taze diseksiyonlu medial prefrontal korteksinkarşılaştırılması. Dondurulmuş numuneler diseksiyondan önce birkaç ay boyunca -80 °C'de tutuldu. Taze numuneler hasattan hemen sonra işlendi. Her iki yöntem kullanılarak toplanan örneklerden alınan RIN değerleri yüksekolup, nükleik asitin korunduğunu gösteren güçlü 18S ve 28S bantları vardır. (C, D) mPFC donmuş beyinlerden kesildi ve RNA veya protein çıkarıldı. (C) RNA analizi, yüksek RiN'li ve az bozunma ürünü gözlenen on iki numune için de kaliteli RNA elde edildiğini göstermektedir. (D) Batı leke analizi total protein üzerinde yapıldı ve yüksek molekül ağırlıklı KCC2 iyon kanalının varlığı için incelendi (kırmızı bantlar, MW = 130 kDa). KCC2 bandı, daha düşük molekül ağırlığı dökümü ürünleri gözlenmeden açıkça görülebilir. Temizlik geni Actin (yeşil bantlar, MW = 42 kDa) da gösterilir. 12 beyinden alınan mPFC örnekleri 1-12 olarak etiketlenmiştir. WB tüm beyin kontrolü anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, nükleik asit ve protein ingradasyonunu sınırlandırırken beynin küçük, belirli bölgelerini izole etme tekniğini tanımlar. Bir organizma öldüğünde beyin dokularına zarar hemen gerçekleşir. Bu kısmen ekstrasellüler glutamat hızlı birikme ve21oluşur sonucu eksitotoksisite kaynaklanmaktadır. Messenger RNA özellikle bozulmaya karşı savunmasızdır 22,23. Protein ve nükleik asit dökümü büyük ölçüde 28.000 yıl önce donmuş mamut hücrelerinde biyolojik aktivite açıklayan yeni bir makale ile kanıtlanır gibi düşük sıcaklıklarda azalır24.
Burada açıklanan yöntemle beyinler dondurulur ve nükleik asit veya protein ekstraksiyonuna başlanana kadar aletler ve dokular donma altında tutulur. Dondurulmuş ROI'lar daha sonra proteaz ve nükleaz inhibitörleri içeren tamponda homojenize edilirler ve hedef molekülleri daha yüksek sıcaklıklarda bozulmadan korurlar.
Bu süreçte, bölümler içinde ROI'ları saptamak için net simgesel noktaları belirlemek önemlidir. Ön komissür ve korpus callosum'un fiber yolları ventriküller gibi bu amaç için iyi çalışır. Bir posterior ön hamle olarak hipokampus şeklinde değişiklikler de kullanılabilir. Beynin matriste ne kadar iyi hizalanmış olduğuna bağlı olarak, yer işaretleri çarpık veya eksik olabilir. Bu gibi bölümlerden ROI'lar toplanmadan önce dikkat edilmelidir, çünkü kirletici bölgeler numuneye dahil edilebilir. Toplamadan önce, bölümün her iki tarafında da bir YG kontrol edilmelidir ve bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olunmalıdır. ROI diseksiyonu x-y boyutunda yaklaşık 1 mm'den büyük olan beynin iyi tanımlanmış bölgeleri ile sınırlıdır.
ROI'ları parçalarken, dokuları çok kırılgan hale getirmeden dondurulmuş tutmanız gerekir. Basınç bir yumruk veya neşter ile uygulandığında çok soğuk doku kırılır. Bu durumda ilgi bölgesigenellikle diğer parçalardan tanımlamak zordur. Bunu azaltmanın bir yolu, bölümleri kısaca plakanın daha sıcak bir bölgesine (kuru buzdan uzakta) taşımaktır. Cam plakayı temiz tutmak da önemlidir. Bir kesit işlendikten sonra, plaka bir sonrakine geçmeden önce bir jiletle kazınmalıdır. Zamanla, su havadan diseksiyon plakasına yoğunlaşacak ve bu da numune tanımayı kapsayabilir veya başka bir şekilde engelleyebilir. Plaka nın temizlenmesi, bir jiletin keskin kenarını camın yüzeyinde kazıyarak ve toplanan don ve enkazı silerek yapılır. Küçük ROI'lar istenmeyen beyin parçalarından ayırt edilemez hale gelir, bu nedenle temiz bir çalışma alanı nın korunması çok önemlidir.
Birçok laboratuvar, hasat edilen dokularda RNA'yı korumak için ticari ürünler25'i kullanır. Labile molekülleri de bu şekilde korunmuş olsa da, bir dezavantajı doku morfolojisi radikal değişmiş olmasıdır. Sonuç olarak, başvuru haritalarını kullanarak ilgi çekici bölgeleri bulmak zor olabilir. Bu ürünleri kullanmadan önce dondurulmuş beyinlerden ROI'ların kesilmesi bu nedenle daha iyi bir seçenek olabilir.
Bu çalışmada koronal dilimlere odaklanmış olmamıza rağmen, bu yöntem ufuk ve sagital kesitler için iyi çalışmalıdır. Bu oryantasyonlar için haritalar koronal kesitler için karşılaştırıldığında genellikle daha düşük çözünürlük. Ancak, bu allen Beyin Enstitüsü gibi grupların girişimleri ile hızla değişiyor. Bir diğer husus da hasatta hayvanın yaşıdır. Genç hayvan beyinlerinin morfolojisi yetişkininkinden çok farklıdır ve özel bir atlas ve farklı boyutta bir beyin matrisi gerektirir. Gelişmekte Olan Fare BeyinAtlası 26 gibi kaynaklar genç farelerden doğru beyin örnekleri toplamak için gereklidir.
Bu çalışma kemirgen beyin içinde küçük bölgelerde n hasat için kullanılabilecek bir süreç açıklar. Kesitlerin morfolojisi dondurulmuş dilimleme ile iyi korunur ve dokular hasattan ekstraksiyona kadar dondurulmuş olarak tutulduğundan, nükleik asit ve protein kalitesi yüksektir. Bu süreç, büyük bir hayvan grubundan alınan örnek beyinler hızla toplanıp depolanabildiği için, yeni toplanan dokunun diseksiyonu üzerinde avantaja sahiptir. Beyin içindeki bölgeler daha sonra ortak beyin atlaslarında tanımlanan ve hedef molekülleri kaybetmeden dikkatli bir hızda toplanan yerler kullanılarak tespit edilebilir. Gerekli araçlar ve vekiller ucuz ve hazır olduğundan bu yöntem bazı laboratuvarlar için iyi bir seçenek olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH, DA043982 ve DA046196 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
- Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , Academic Press. (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , Academic Press. (1998).
- RNaseZap. Ambion. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
- Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
