Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Insamling av frysta gnagare hjärnregioner för nedströms analyser

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

Detta förfarande beskriver insamling av diskreta frysta hjärnan regioner för att få högkvalitativt protein och RNA med hjälp av billiga och allmänt tillgängliga verktyg.

Abstract

Som vår förståelse av neurobiologi har utvecklats, molekylära analyser utförs ofta på små hjärnan områden såsom den mediala prefrontala cortex (mPFC) eller kärnan accumbens. Utmaningen i detta arbete är att dissekera rätt område samtidigt som den mikromiljö som ska undersökas bevaras. I det här dokumentet beskriver vi en enkel, billig metod med resurser som är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. Denna metod bevarar nukleinsyra och proteiner genom att hålla vävnaden fryst under hela processen. Hjärnor skärs i 0,5–1,0 mm sektioner med hjälp av en hjärnmatris och är ordnade på en frusen glasplatta. Landmärken inom varje avsnitt jämförs med en referens, till exempel Allen Mouse Brain Atlas, och regioner dissekeras med en kall skalpell eller biopsi punch. Vävnad lagras sedan vid -80 °C tills den används. Genom denna process råtta och mus mPFC, nucleus accumbens, dorsala och ventrala hippocampus och andra regioner har framgångsrikt analyserats med qRT-PCR och västerländska analyser. Denna metod är begränsad till hjärnan regioner som kan identifieras av tydliga landmärken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta arbete illustrerar dissekering av frysta hjärnregioner för utvinning av högkvalitativ nukleinsyra eller protein med hjälp av en referens, såsom Allen Mouse Brain Atlas1, som en guide. I denna teknik är hjärnor flashfrysta och lagras vid -80 °C för senare snittning och dissekering samtidigt som de hålls i fruset tillstånd. Denna process gör det möjligt för forskaren att skörda ett stort antal hjärnor i en session och senare dissekera dem för en korrekt samling av flera hjärnregioner.

Korrekt insamling av hjärnregioner av intresse (ROIs) krävs ofta när man svarar på frågor relaterade till gen- och proteinuttryck. Medan farmakologi, elektrofysiologisk och optogenetik kan användas på vildtyp eller genetiskt modifierade gnagare för att belysa molekylära förändringar som ligger till grund för observerade beteenden2,3,4, är mätning av inducerade förändringar i transkriptom och proteomer ofta används för att stödja dessa resultat. Tekniker som kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR), västra blotting, RNAseq5, MAPSeq6 och HPLC7 är robusta och relativt låg i kostnad, vilket gör att många laboratorier att studera inducerad molekylära förändringar inom små hjärnregioner2,4,5,6.

Det finns flera sätt att extrahera och rena nukleinsyra eller protein frånhjärnregionerna 8,,9,,10,,11,12. Många laboratorier skörda hjärnan regioner genom kylning och skära hjärnor på is vid tidpunkten för skörden9,13. Även om detta tillvägagångssätt kan resultera i hög kvalitet nukleinsyra och protein, det är något tidsbegränsad som nedbrytning inom mikromiljön av vävnaden kan äga rum vid dessa temperaturer. Detta kan vara särskilt sant när man försöker dissekera ett stort antal djur eller rois i ett sammanträde. Att hålla prover frysta hjälper till att upprätthålla labila målmolekyler samtidigt som forskaren tid att noggrant jämföra landmärken på båda sidor av varje avsnitt i arbetet med att samla relativt rena prover. Laseravskiljning är ett annat sätt att samla vävnad för RNA eller proteinanalys från hjärnan områden10. Detta förfarande är överlägsen mekanisk dissekering i att mycket små och oregelbundet formade ROIs kan identifieras och isoleras. Laseravskiljning begränsas dock av användning av dyr utrustning och reagenser, är tidskrävande och kan också vara mer mottagliga för provförsämring.

Mikrospänndissektion på frusna vävnader är inte ny. Tidiga papper av Miklos Palkovits och andra beskriver de grundläggande teknikerna i detalj14,15. Denna presentation följer till stor del det ursprungliga arbetet, med vissa förbättringar för att underlätta effektivitet och minska kostnaderna för den utrustning som behövs. Till exempel, hjärnan delar görs i en frusen hjärna block snarare än på en cryostat. Detta ger tjockare sektioner som minskar antalet avsnitt som behövs för att samla in ROI-prover. Denna metod dissekerar också prover på en frusen glasplatta som sitter på torris i en isolerad låda. Detta ger en underfrysning skede på bänken för att arbeta. Avsnitt som dissekeras på detta sätt är lätta att manipulera, vilket gör det möjligt för forskaren att jämföra båda sidor av varje avsnitt med en referens för att begränsa kontaminering från regioner utanför den önskade avkastningen på sysselsatt kapital.

Fördelar med detta protokoll är att 1) hjärnan hålls i ett fruset tillstånd under hela processen, vilket hjälper till att bevara protein och nukleinsyra och ger forskaren tid att noggrant skörda ROIs, och 2) reagenser som krävs är billiga och finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier. I denna process, hela hjärnor är sektionerade till 0,5-1,0 mm i en hjärna matris och placeras på en frusen glasplatta som kontinuerligt kyls med torris. Landmärken som finns i Allen Brain Atlas1 eller andra hjärnatlass16,17 används för att identifiera regioner av intresse, som sedan dissekeras med antingen en kall punch eller skalpell. Eftersom vävnaden aldrig tinas, regioner som skördas på detta sätt ger hög kvalitet RNA och protein för nedströms analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Djur som används i denna studie behandlades på ett etiskt och humant sätt som anges av Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och National Institutes of Health (NIH) riktlinjer.

OBS: Alla verktyg och ytor ska tvättas med ett lämpligt lösningsmedel för att avlägsna nukleaser18 innan något arbete påbörjas.

1. Förvaring av hjärnor

  1. Ta snabbt bort hjärnorna från avlivade vuxna CD1-vildtypsmöss som väger cirka 30 g med en konventionell metod13 och flashfrysa i 60 sekunder i antingen flytande kväve eller isopentan förkyld med torris.
  2. Förvara frusna hjärnor vid -80 °C i aluminiumfolie eller koniska rör tills de används.

2. Förbereda hjärnan matris

  1. Tjugofyra timmar före dissekering av vävnad, placera en ren hjärnmatris (se Tabell över material) på en bunt upptinade frysförpackningar. Sandwich sidorna av matrisen mellan två frysförpackningar och se till att lämna ca 0,5 cm mellan botten av rakhyvelns slitsar och toppen av gelförpackningarna (figur 1A). Placera aluminiumfolie på ändarna för att underlätta kylning.
    OBS: När du köper en hjärna matris, köpa en som är tillräckligt stor för att innesluta hela volymen av hjärnan som ska dissekeras.
  2. Placera lådan som innehåller hjärnmatrisen och frysförpackningarna i en -20 °C-frys med toppen på glänt över natten.

3.

OBS: Syftet med denna inställning är att förbereda en frusen yta för att dissekera hjärnans sektioner.

  1. Placera isen i en isolerad låda upp till ca 5 cm uppifrån. Placera sedan ett 2,5 cm lager torris ovanpå isen och täck med svart plastfolie som hjälper till att visualisera provet (figur 1B, figur 1C).
  2. Placera en glasplatta (ska bara passa i öppningen av lådan) ovanpå plasten och placera torris ovanpå plattan i de bortre hörnen (figur 1C).
  3. Ta den frusna hjärnmatrisen från frysen och sätt in hjärnan som ska skäras cortex-sidan upp. Låt den balansera till temperaturen i lådan i 10 min. Håll locket på lådan under denna tid.
  4. Justera hjärnans position i matrisen med kalla pincett så att sagittal sinus och tvärgående sinus linje upp med vinkelräta spår av blocket (figur 1D). Detta kommer att bidra till att säkerställa symmetriska sektioner för enklare dissekering. Tryck tips av pincett för att torka is en kort stund för att kyla innan du justerar hjärnan.
  5. När hjärnan är på plats, placera ett kylt rakblad nära dess centrum och tryck bladet ca 1 mm i vävnaden. Lägg kylda blad till rostrala och caudal ändar för att hålla hjärnan på plats (figur 2A och figur 2B).
  6. Börja på rostraländen, tillsätt blad en i taget, placera dem i spåren och trycka dem försiktigt ner i vävnaden ca 1 mm (figur 2B). Fortsätt att lägga till blad med 1 mm mellanrum som arbetar mot caudaländen.
  7. Se till att hjärnan inte skiftar under denna tid. Rada upp blad horisontellt och vertikalt(bild 2B). För att skära sektionerna i 0,5 mm bredder kan mikrotomblad med låg profil (se Tabell över material)användas. Placera dessa mellan de större rakbladen (bild 2C).
  8. När bladen är på plats trycker du ner ovanpå gruppen med fingrar, handflatan eller någon annan plan yta (bild 2C, figur 2D). Rock gruppen av blad långsamt från sida till sida för att flytta dem genom vävnaden.
    OBS: Detta kan ta lite tid (1–2 min) och kräver tålamod. Det bör finnas motstånd mot bladen rör sig genom vävnaden. Enkel ingång innebär att hjärnan tinar och blocket ska kylas med torris.
  9. När alla blad har nått botten av spåren, ta tag i varje sida av gruppen av blad och arbeta fri från matrisen genom att gunga fram och tillbaka.
    OBS: Var försiktig för att undvika att skära sig på de vassa kanterna på bladen.
  10. När gruppen är fri, placera stacken, rostral sidan upp, på glasplattan (Figur 2E). Placera torris bredvid och/eller ovanpå stapeln för att ytterligare frysa proverna för enklare separation.
  11. Placera bunten med vassa kanter ner på glasplattan och separera bladen genom att flytta stacken mellan tummar och fingrar. Bladen ska separeras från varandra med sektioner fästa.
  12. Rada upp sektioner på glasplattan från rostral till caudal (figur 2F).
  13. Separera vävnaden från bladen genom att böja bladen mellan fingrarna, eller genom att separera med en andra kall rakhyvel (Figurerna 2G,2H,2I).

4. Dissekera sektioner

  1. Öppna Allen Mouse Brain Atlas eller en annan referens och hitta landmärken som behövs för att identifiera regioner av intresse. Några uppenbara landmärken inkluderar den främre commissure, corpus callosum, den laterala ventriklarna, och hippocampus (Figur 3).
  2. Vänd på den sektion som ska skäras med kylda pincett och se till att regionen på väg att samlas in är konsekvent i hela avsnittet. Under skörden, konsultera referensatlasen ofta för att se till att rätt avkastning på avkastningen erhålls.
    OBS: Ett förstoringsglas eller dissekera mikroskop är ofta till hjälp i denna process. Bra belysning är också viktigt. Ledlampor med låg effekt eller en kyllampa (se Tabell över material) kan användas för detta ändamål.
  3. Skär i sektionen med ren skalpell eller stans (figur 4). Prechill varje verktyg innan du skär genom att röra vid den kort för att torka is. Tryck försiktigt på bladet men fast i vävnaden och gunga det fram och tillbaka för att göra snittet. Tryck inte för hårt, annars kommer vävnaden att spricka.
    Obs: Verktygen värms upp med tiden. Något uppvärmda blad kan vara till hjälp för att göra rena nedskärningar och kan begränsa sprickbildning, men var noga med att undvika upptining av vävnad. Kyl regelbundet verktyg på torris.
  4. När en ROI skördas, placera den i märkta, prechilled 1,5 ml rör. Förvara skördade vävnader vid -80 °C tills det behövs.
  5. Bearbeta fryst vävnad som samlats in på detta sätt genom att tillsätta kall RIPA-buffert (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS och proteinhämmare cocktail (se Tabell över material)) för proteinutvinning, eller en guanidinium-innehållande lösningsmedel (se Tabell över material) för RNA extraktion till det frysta provet och omedelbart homogenisera med antingen ett glas Dounce eller mekanisk homogenisator (se Tabell över material). På detta sätt finns proteas- och nukleahämmare på plats när provet värms upp för att skydda protein och nukleinsyror från nedbrytning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att validera denna metod, den mediala prefrontala cortex samlades in från vuxna CD1 wildtype manliga möss och RNA och protein extraherades och karakteriserades. RNA analyserades av kapillär elektrofores. Degraderad RNA visar en förlust i intensiteten hos ribosomala banden 28S och 18S och visar även nedbrytningsprodukter som ett utstryk mellan 25 och 200 nukleotider (figur 5A, prov 1). RNA av hög kvalitet visar distinkta ribosomala band med liten eller ingen signal i området med lägre molekylvikt (figur 5A, prov 2). RNA-integritetsnummer (KODER) genereras också i denna analys. KODER över 7 indikerar god kvalitet RNA19. RNA isolerade från prover med den frysta dissekeringsmetoden uppvisar stark ribosomal ränder och höga RIN-värden som mycket positivt jämförs med RNA framställd av nyskördad vävnad (figur 5B).

En fördel med denna metod är att ett stort antal hjärnor snabbt kan skördas och lagras i ett sammanträde för att noggrant dissekeras vid ett senare tillfälle. ROIs kan också lagras utan att vävnaderna tinas upp. Med denna metod kan en forskare samla in en stor och varierad samling av ROIs från vilka högkvalitativ nukleinsyra eller protein kan erhållas. För att bekräfta denna punkt extraherades RNA från den dissekerade mPFC som hade lagrats under flera veckor (skördade hjärnor hade lagrats i flera månader). Alla prover producerade högkvalitativt RNA med distinkt ribosomal ränder och LEG över 8(figur 5C).

Western blot analys användes för att bekräfta protein integritet fryst dissekerad mPFC som tidigare beskrivits20. Western blots visar minskad signal av hög molekylvikt mål när protein bryts ned. Nedbrytningsprodukterna visas också som ett utstryk vid lägre molekylvikter i kolonnen. För denna analys samlades proteinet in, överfördes till nitrocellulosa och undersöktes med antikroppar mot ett högt molekylviktsmål, KCC2, och protein med lägre molekylvikt, aktin (figur 5D). I samtliga fall var banden skarpa och distinkta utan märkbara nedbrytningsprodukter för antingen KCC2 eller aktin. Dessa experiment bekräftar att dissekering av ROIs med denna metod möjliggör utvinning av högkvalitativt RNA och protein.

Figure 1
Bild 1: Förbereda frysta arbetsytor. (A) Ett hjärnblock placeras på en bunt gelförpackningar i en isolerad låda och är sedan inklämt mellan två ytterligare gelförpackningar. Aluminiumfolie är förpackad i varje ände av blocket för att underlätta kylning under snittning. Lådan kyls sedan över natten vid -20 °C. (B)En glasplatta matchas för storlek med öppningen av en isolerad låda. En fraktbox kan användas för detta ändamål. Is läggs till lådan tills den är ca 5 cm uppifrån. Lådan fryses sedan över natten vid -20 °C. (B, C) Strax före uppsamling av vävnad placeras ett jämnt lager torris ovanpå isen på ett djup av ca 2,5 cm. Ett ark svart plast (för att underlätta visualisering) placeras över den torra isen följt av glasplattan. Torris placeras i de bortre hörnen, vilket kyler luften precis ovanför plattan. Verktyg kan kylas genom att lägga dem på plattan, eller genom att kort röra dem till torrisen. (D)För att säkerställa symmetriska sektioner bör hjärnan placeras med kalla pincett så att sagittal sinus och tvärgående sinus linje upp med vinkelräta spår av blocket (vita pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Snittning hjärnan med hjälp av en hjärna block. (A) Hjärnans orientering förankras genom att placera konventionella rakblad med en kant i hjärnbarken på ett djup av ca 1 mm. Placera en i mitten och en i varje ände hjälper till att hålla hjärnan på plats. (B) Tillsätt blad en i taget tills alla slitsar är fyllda. (C)Blad med låg profil kan sättas in mellan konventionella blad när 0,5 mm sektioner önskas (röd pil). (C, D) Gruppen av blad trycks in i den frusna vävnaden med måttligt nedåttryck, med antingen ett platt instrument eller handflatan eller fingrarna i handen. Blad kan långsamt gungas fram och tillbaka för att hjälpa till att flytta dem genom vävnaden. (E) Sektioner avlägsnas genom att greppa sidorna av rakbladen och med hjälp av en gungrörelse och fast uppåttryck (Varning: Var noga med att undvika vassa ändar av bladen). Lyft gruppen ur blocket och placera den främre sidan upp på den frusna glasplattan. Placera torris intill bladen för att kyla sektionerna helt innan du separerar. (F)Separera bladen och lägg sektionerna ut i ordning. (G, H) Sektioner kan tas bort från bladen genom att böja bladet något med fingrarna i pilarnas riktning och trycka av sektionen med ett andra kallt blad. (I)Vissa sektioner kan kräva borttagning genom att något värma rakbladet mellan fingrar och tummar och sedan snabbt skära av den frusna delen med ett andra kallt blad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bestämma ROIs med hjälp av landmärken och Allen Mouse Brain Atlas. I det här exemplet är frusna hjärnsektioner till vänster med motsvarande plattor från Allan Mouse Brain Atlas till höger. ROIs (röda prickade konturer) identifieras genom att jämföra synliga landmärken (svarta former) med Allen Mouse Brain Atlas. Landmärken inkluderar: fa och cc, corpus callosum, aco, främre commissur, VL, lateral ventrikel, V3, tredje ventrikeln. Exempel ROIs: Pl/Il, prelimbic och infralimbic cortex, ACB, nucleus accumbens, MOs, motor cortex, CP, caudoputamen, HPF, hippocampus/dentate gyrus. Coronal atlas bilder på rätt kredit: Allen Institute. Bilderna är från plattorna 40, 44, 55 och 71 (uppifrån och ned) och erhölls från https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Dissekera rois. (A)Sektioner hanteras med pincett som kyls med jämna mellanrum på torris. Båda sidor av varje avsnitt bör jämföras med motsvarande atlasbilder före dissekering. (B)ROIs avlägsnas från hjärnsektioner med kall skalpell eller (C) biopsi punch. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Analys av RNA och protein med hjälp av fryst hjärndissektionsmetod. (A)Exempel på dålig kontra god kvalitet RNA. Elektroforesisk separation av prov 1 visar försämrad RNA med svaga 28S och 18S band och nedbrytningsprodukter mellan 25 och 200 nukleotider (nt). Prov 2 visar god kvalitet RNA med starka 28S och 18S band och lite signal vid låga molekylvikter. RNA-integritetsnummer återspeglar denna skillnad med prov 1, RIN = 2,5 och prov 2, RIN = 8.6. ( B)Jämförelse av RNA utvinns ur frysta kontra nyligen dissekeras medial prefrontala cortex av möss. Frysta prover förvarades vid -80 °C i flera månader före dissekering. Färska prover bearbetades omedelbart efter skörden. RIN-värden från prover som samlats in med båda metoderna är höga, med starka 18S- och 28S-band som indikerar att nukleinsyra har bevarats. (C, D)mPFC dissekerades från frysta hjärnor och RNA eller protein extraherades. (C)RNA-analys visar god kvalitet RNA erhölls för alla tolv prover med höga KODER och lite nedbrytning produkt observerats. (D)Western blot analys gjordes på totalt protein och undersöktes för förekomsten av hög molekylvikt KCC2 jonkanal (röda band, MW = 130 kDa). KCC2-bandet syns tydligt utan att några nedbrytningsprodukter med lägre molekylvikt observeras. Hushållninggenen Actin (gröna band, MW = 42 kDa) visas också. mPFC prover från 12 hjärnor är märkta 1-12. WB står för hela hjärnan kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta arbete beskriver en teknik för att isolera små, specifika regioner i hjärnan samtidigt begränsa nedbrytning av nukleinsyra och protein. Skador på hjärnvävnader sker snabbt när en organism dör. Detta beror delvis på en snabb uppbyggnad av extracellulär glutamat och den resulterande excitotoxikrititet som uppstår21. Messenger RNA är särskilt sårbara för nedbrytning22,23. Nedbrytning av protein och nukleinsyra reduceras kraftigt vid låga temperaturer vilket framgår av en nyligen publicerad artikel som beskriver biologisk aktivitet i mammutceller frysta i permafrost 28.000 år sedan24.

Med den metod som beskrivs häri, hjärnor är snap frysta och verktyg och vävnader hålls under fryspunkten tills nukleinsyra eller protein utvinning startas. Frysta ROIs homogeniseras sedan i buffert som innehåller proteas och nukleashämmare, vilket skyddar målmolekyler från nedbrytning vid högre temperaturer.

I den här processen är det viktigt att identifiera tydliga landmärken för att identifiera ROI inom avsnitten. Fiber skrifter av den främre commissure och corpus callosum fungerar bra för detta ändamål, liksom ventriklarna. Förändringar i formen av hippocampus som man flyttar främre till bakre kan också användas. Beroende på hur väl hjärnan är i linje i matrisen, landmärken kan vara skev, eller saknas. Försiktighet bör iakttas innan rois samlas in från sådana här sektioner, eftersom förorenande regioner kan hamna i provet. Före insamlingen bör en avkastning kontrolleras på båda sidor av avsnittet för att se till att den är konsekvent i hela avsnittet. Dissekering av ROIs är begränsad till väldefinierade områden i hjärnan som är större än ca 1 mm i x-y dimensionen.

När dissekera ROIs, det finns ett behov av att hålla vävnader frysta utan att göra dem alltför spröda. Vävnad som är för kall kommer att spricka när trycket appliceras med en punch eller skalpell. Den region av intresse är ofta svårt att identifiera från andra fragment när detta händer. Ett sätt att mildra detta är att kort flytta sektionerna till ett varmare område av plattan (bort från torris). Det är också viktigt att hålla glasplattan ren. När en sektion har bearbetats ska plattan skrapas ren med ett rakblad innan den går vidare till nästa. Med tiden kondenserar vatten på dissektionsplattan från luften som kan täcka eller på annat sätt störa provigenkänningen. Rengöring av plattan görs genom att skrapa den skarpa kanten av ett rakblad över ytan av glaset och torka upp den insamlade frost och skräp. Små ROIs blir omöjlig att skilja från oönskade hjärnfragment så det är mycket viktigt att upprätthålla ett rent arbetsområde.

Många laboratorier använder kommersiella produkter25 för att skydda RNA i skördade vävnader. Medan labila molekyler är väl bevarade på detta sätt, är en nackdel att vävnadens morfologi förändras radikalt. Därför kan det vara svårt att hitta intresseregioner med hjälp av referenskartor. Dissekera ROIs från snap-frysta hjärnor innan du använder dessa produkter kan därför vara ett bättre alternativ.

Även om vi har fokuserat på koronal skivor i detta arbete, bör denna metod fungerar bra för horisontella och sagittal sektioner. Kartor för dessa orienteringar är i allmänhet lägre upplösning jämfört med de för koronalsektioner. Detta förändras dock snabbt med initiativ från grupper som Allen Brain Institute. En annan faktor är djurets ålder vid skörden. Morfologin hos unga djurhjärnor skiljer sig mycket från den vuxnas och kommer att kräva en specialiserad atlas och en annan storlek hjärnan matris. Resurser som Developing Mouse Brain Atlas26 är viktiga för att samla in korrekta hjärnprover från yngre möss.

Detta arbete beskriver en process som kan användas för att skörda små regioner inifrån gnagarehjärna. Morfologin i sektionerna är väl bevarad med fryst skivning, och eftersom vävnaderna hålls frysta från skörd till extraktion är kvaliteten på nukleinsyra och protein hög. Denna process har fördelen jämfört med dissekering av nyinsamlad vävnad som prov hjärnor från en stor grupp av djur kan snabbt samlas in och lagras. Regioner i hjärnor kan sedan identifieras med hjälp av landmärken som identifierats i vanliga hjärnatlaser och samlas in i en försiktig takt utan att förlora målmolekyler. Denna metod kan vara ett bra alternativ för vissa laboratorier som de verktyg och regenter som behövs är billiga och lättillgängliga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH, DA043982 och DA046196.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
  2. Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
  4. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25, (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
  5. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, (1), 57-63 (2009).
  6. Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. 054312 (2016).
  7. Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5, (4), 249-260 (2006).
  8. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
  9. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
  10. Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
  11. Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20, (11), 1826-1835 (2006).
  12. Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12, (63), (2018).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
  14. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
  15. Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. Academic Press. (2001).
  17. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. Academic Press. (1998).
  18. RNaseZap. Ambion. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
  19. Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  20. Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. (2019).
  21. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, (1), 171-182 (1990).
  22. Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265, (1-2), 11-23 (2001).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8, (2), 56507 (2013).
  24. Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9, (1), 4050 (2019).
  25. Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
  26. Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
Insamling av frysta gnagare hjärnregioner för nedströms analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter