Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.

Abstract

Naarmate ons begrip van de neurobiologie is gevorderd, worden moleculaire analyses vaak uitgevoerd op kleine hersengebieden zoals de mediale prefrontale cortex (mPFC) of nucleus accumbens. De uitdaging in dit werk is om het juiste gebied te ontleden met behoud van de te onderzoeken microomgeving. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige, goedkope methode met behulp van middelen die direct beschikbaar zijn in de meeste laboratoria. Deze methode behoudt nucleïnezuur en eiwitten door het weefsel bevroren te houden gedurende het hele proces. Hersenen worden gesneden in 0,5-1,0 mm secties met behulp van een hersenmatrix en gerangschikt op een bevroren glasplaat. Oriëntatiepunten binnen elke sectie worden vergeleken met een verwijzing, zoals de Allen Mouse Brain Atlas, en regio's worden ontleed met behulp van een koude scalpel of biopsie punch. Weefsel wordt vervolgens opgeslagen bij -80 °C tot gebruik. Door dit proces zijn rat en muis mPFC, nucleus accumbens, dorsale en ventrale hippocampus en andere regio's met succes geanalyseerd met behulp van qRT-PCR en westerse testen. Deze methode is beperkt tot hersengebieden die kunnen worden geïdentificeerd door duidelijke oriëntatiepunten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit werk illustreert de dissectie van bevroren hersengebieden voor de extractie van hoogwaardig nucleïnezuur of eiwit met behulp van een referentie, zoals de Allen Mouse Brain Atlas1, als een gids. In deze techniek worden hersenen flash-bevroren en opgeslagen bij -80 °C voor latere sectie en ontleding terwijl ze in een bevroren toestand worden gehouden. Dit proces stelt de onderzoeker in staat om een groot aantal hersenen in één sessie te oogsten en ze later te ontleden voor een nauwkeurige verzameling van meerdere hersengebieden.

De nauwkeurige verzameling van hersengebieden van belang (ROI's) is vaak nodig bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot gen- en eiwitexpressie. Terwijl farmacologie, elektrofysiologie en optogenetica kunnen worden gebruikt op wildtype of genetisch gemodificeerde knaagdieren om te helpen verduidelijken moleculaire veranderingen die ondersteunen waargenomen gedrag2,3,4, de meting van geïnduceerde veranderingen in transcriptomen en proteomen wordt vaak gebruikt om deze bevindingen te ondersteunen. Technieken zoals kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR), westelijke blotting, RNAseq5,MAPSeq6 en HPLC7 zijn robuust en relatief laag in kosten, waardoor veel laboratoria om geïnduceerde moleculaire veranderingen te bestuderen binnen kleine hersengebieden2,4,5,6.

Er zijn verschillende manieren om nucleïnezuur of eiwit uit hersengebieden8,9,10,11,12te extraheren en te zuiveren. Veel laboratoria oogsten hersengebieden door het koelen en snijden van hersenen op ijs op het moment van oogst9,13. Hoewel deze aanpak kan resulteren in hoge kwaliteit nucleïnezuur en eiwit, is het enigszins tijd-beperkt als afbraak binnen de micro-omgeving van het weefsel kan plaatsvinden bij deze temperaturen. Dit kan met name het geval zijn bij een poging om een groot aantal dieren of ROI's in één vergadering te ontleden. Het houden van monsters bevroren helpt handhaven van bieldoelmoleculen, terwijl de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te vergelijken oriëntatiepunten aan beide zijden van elke sectie in de poging om relatief zuivere monsters te verzamelen. Laser capture is een andere manier om weefsel te verzamelen voor RNA of eiwitanalyse uit hersengebieden10. Deze procedure is superieur aan mechanische dissectie in die zin dat zeer kleine en onregelmatig gevormde ROI's kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd. Echter, laser capture wordt beperkt door het gebruik van dure apparatuur en reagentia, is tijdrovend en kan ook meer vatbaar zijn voor afbraak van monsters.

Micropunch dissectie op bevroren weefsels is niet nieuw. Vroege papers van Miklos Palkovits en anderen beschrijven de basistechnieken in detail14,15. Deze presentatie volgt grotendeels het oorspronkelijke werk, met enkele verbeteringen om de efficiëntie te vergemakkelijken en de kosten van de benodigde apparatuur te verlagen. Bijvoorbeeld, hersensecties worden gemaakt in een bevroren hersenblok in plaats van op een cryostat. Dit produceert dikkere secties die het aantal secties die nodig zijn om ROI monsters te verzamelen vermindert. Deze methode ontleedt ook monsters op een bevroren glasplaat die op droogijs in een geïsoleerde doos zit. Dit levert een subvriesfase op de bank waarop u moet werken. Secties die op deze manier worden ontleed zijn gemakkelijk te manipuleren, waardoor de onderzoeker beide zijden van elke sectie kan vergelijken met een verwijzing om besmetting van regio's buiten de gewenste ROI te beperken.

Voordelen van dit protocol zijn dat 1) de hersenen wordt gehouden in een bevroren toestand gedurende het hele proces, die helpt bij het behoud van eiwitten en nucleïnezuur en geeft de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te oogsten ROI's, en 2) de benodigde reagentia zijn goedkoop en worden gevonden in de meeste moleculaire biologie labs. In dit proces worden hele hersenen in een hersenmatrix tot 0,5-1,0 mm doorsneden en op een bevroren glasplaat geplaatst die continu wordt gekoeld met droogijs. Oriëntatiepunten gevonden in de Allen Brain Atlas1 of andere hersenen atlassen16,17 worden gebruikt om gebieden van belang te identificeren, die vervolgens worden ontleed met behulp van een koude punch of scalpel. Omdat het weefsel nooit ontdooid is, leveren regio's die op deze manier worden geoogst hoogwaardige RNA en eiwit voor downstream analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dieren gebruikt in deze studie werden behandeld in een ethische en humane manier zoals uiteengezet door Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en National Institutes of Health (NIH) richtlijnen.

LET OP: Alle gereedschappen en oppervlakken moeten worden gewassen met een geschikt oplosmiddel om nucleases18 te verwijderen voordat u met het werk begint.

1. Hersenen opslaan

  1. Verwijder snel de hersenen van geëuthanaseerde volwassen CD1 wildtype muizen met een gewicht van ongeveer 30 g met behulp van een conventionele aanpak13 en flash-freeze gedurende 60 seconden in vloeibare stikstof of isopentane voorgekoeld met droogijs.
  2. Bewaar bevroren hersenen bij -80 °C in aluminiumfolie of conische buizen tot gebruik.

2. Voorbereiding van de hersenmatrix

  1. Vierentwintig uur voor het ontleden van weefsel, plaats een schone hersenmatrix (zie Tabel van materialen)op een stapel ontdooide diepvriesverpakkingen. Sandwich de zijkanten van de matrix tussen twee vriezer verpakkingen zorg ervoor dat ongeveer 0,5 cm tussen de onderkant van de scheermessleuven en de bovenkant van de gel packs (Figuur 1A). Plaats aluminiumfolie op de uiteinden om te helpen bij het koelen.
    OPMERKING: Bij de aankoop van een hersenmatrix, koop er een die groot genoeg is om het hele volume van de hersenen te ontleden omte geven.
  2. Plaats de doos met de hersenmatrix en vriezer verpakkingen in een -20 °C vriezer met de bovenkant op een kier 's nachts.

3. Het opzetten van een bevroren glasplaat

OPMERKING: Het doel van deze opstelling is om een bevroren oppervlak voor te bereiden waarop hersensecties kunnen worden ontleed.

  1. Plaats ijs in een geïsoleerde doos tot ongeveer 5 cm van de top. Plaats vervolgens een laag van 2,5 cm droogijs op het ijs en bedek met zwarte plastic platen om te helpen bij het visualiseren van het monster(figuur 1B, figuur 1C).
  2. Plaats een glazen plaat (moet gewoon passen in de opening van de doos) op de top van het plastic en plaats droogijs op de top van de plaat in de verre hoeken (Figuur 1C).
  3. Neem de bevroren hersenmatrix uit de vriezer en steek de hersenen in om cortex-side omhoog te snijden. Laat het 10 min in de doos worden gelijkgekomen.
  4. Pas de positie van de hersenen in de matrix aan met koude tangen, zodat de sagittale sinus en dwarse sinus lijn met de loodrechte groeven van het blok (Figuur 1D). Dit zal helpen zorgen voor symmetrische secties voor een gemakkelijkere dissectie. Raak tips van tangen om ijs kort te drogen om te koelen voordat u de hersenen aanpast.
  5. Zodra de hersenen in positie is, plaats een gekoeld scheermesje in de buurt van het midden en druk het mes ongeveer 1 mm in het weefsel. Voeg gekoelde messen toe aan de rostral en caudaaluiteinden om de hersenen op hun plaats te houden(figuur 2A en figuur 2B).
  6. Voeg vanaf het rostral uiteinde bladen één voor één toe, plaats ze in de sleuven en druk ze zachtjes in het weefsel ongeveer 1 mm(figuur 2B). Blijf messen met intervallen van 1 mm toevoegen en werk naar het staartuiteinde toe.
  7. Zorg ervoor dat de hersenen niet verschuiven tijdens deze tijd. Line up bladen horizontaal en verticaal(figuur 2B). Om secties in breedtes van 0,5 mm te snijden, mogen low profile microtoombladen (zie Materiaaltafel)worden gebruikt. Plaats deze tussen de grotere scheermesjes(figuur 2C).
  8. Zodra de messen op hun plaats zijn, drukt u op de bovenkant van de groep met vingers, handpalm of een ander vlak oppervlak(figuur 2C, figuur 2D). Rock de groep messen langzaam van links naar rechts om ze te verplaatsen door het weefsel.
    LET OP: Dit kan enige tijd duren (1-2 min) en vereist geduld. Er moet weerstand zijn tegen de messen bewegen door het weefsel. Gemakkelijke toegang betekent dat de hersenen ontdooien en het blok moet worden gekoeld met droogijs.
  9. Wanneer alle bladen de bodem van de sleuven hebben bereikt, grijp aan elke kant van de groep bladen en werk vrij van de matrix door heen en weer te schommelen.
    LET OP: Wees voorzichtig om te voorkomen dat u zich op de scherpe randen van de messen snijdt.
  10. Zodra de groep vrij is, plaats de stapel, rostral kant omhoog, op de glasplaat (Figuur 2E). Plaats droogijs naast en/of bovenop de stapel om de monsters verder te bevriezen voor een gemakkelijkere scheiding.
  11. Plaats de stapel met scherpe randen naar beneden op de glasplaat en aparte bladen door het verschuiven van de stapel tussen duimen en vingers. De messen moeten van elkaar scheiden met secties bevestigd.
  12. Line up secties op de glasplaat van rostral tot caudal (Figuur 2F).
  13. Scheid weefsel van de messen door messen tussen de vingers te buigen, of door te scheiden met een tweede koud scheermes(Figuren 2G,2H,2I).

4. Ontleden

  1. Open de Allen Mouse Brain Atlas of een andere referentie en vind oriëntatiepunten die nodig zijn om gebieden van belang te identificeren. Enkele voor de hand liggende oriëntatiepunten zijn de voorste commissure, het corpus callosum, de laterale ventrikels en de hippocampus (Figuur 3).
  2. Draai de sectie om te snijden met gekoelde tangen en zorg ervoor dat de regio die op het punt staat te worden verzameld, consistent is in de hele sectie. Raadpleeg tijdens het oogsten vaak de referentieatlas om ervoor te zorgen dat de juiste ROI wordt verkregen.
    OPMERKING: Een vergrootglas of ontleden microscoop is vaak nuttig in dit proces. Goede verlichting is ook essentieel. Hiervoor kunnen ledlampen met een laag wattage of een koele lamp (zie Materiaaltafel)worden gebruikt.
  3. Met een schone scalpel of punch, snijd in de sectie (Figuur 4). Prechill elk gereedschap voor het snijden door het kort aan te raken op droogijs. Duw het mes voorzichtig maar stevig in het weefsel, schommelen heen en weer om de snede te maken. Duw niet te hard of het weefsel zal breken.
    LET OP: Gereedschappen worden na verloop van tijd opgewarmd. Licht opgewarmde messen kunnen nuttig zijn bij het maken van schone sneden en kan breken te beperken, maar wees voorzichtig om te voorkomen dat ontdooien van weefsel. Periodiek chill tools op droog ijs.
  4. Zodra een ROI is geoogst, plaats het in gelabelde, voorgekoelde 1,5 mL buizen. Bewaar geoogste weefsels bij -80 °C tot het nodig is.
  5. Verwerk bevroren weefsel dat op deze manier wordt verzameld door toevoeging van koude RIPA-buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS en eiwitremmercocktail (zie Table of Materials))voor eiwitextractie, of een guanidiniumbevattend oplosmiddel (zie Tabel van materialen)voor RNA-extractie naar het bevroren monster en homogeniseren onmiddellijk met behulp van een glazen Dounce of mechanische homogenisator (zie Tabel van materialen). Op deze manier zijn protease- en nuclease-remmers aanwezig als het monster opwarmt om eiwit- en nucleïnezuren te beschermen tegen afbraak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Om deze methode te valideren, werd de mediale prefrontale cortex verzameld uit volwassen CD1 wildtype mannelijke muizen en RNA en eiwit werden geëxtraheerd en gekarakteriseerd. RNA werd geanalyseerd door capillaire elektroforese. Gedegradeerd RNA geeft een verlies in de intensiteit van de 28S en 18S ribosomal bands en toont ook afbraakproducten als een uitstrijkje tussen 25 en 200 nucleotiden (Figuur 5A, monster 1). RNA van hoge kwaliteit toont verschillende ribosomale banden met weinig tot geen signaal in het onderste moleculaire gewichtsgebied(figuur 5A, monster 2). RNA-integriteitsnummers (RINs) worden ook gegenereerd in deze analyse. RINs boven 7 geven rna van goede kwaliteit19aan. RNA geïsoleerd uit monsters met behulp van de bevroren dissectie methode weer sterke ribosomal banding en hoge RIN waarden vergelijken zeer gunstig met RNA bereid uit vers geoogst weefsel (Figuur 5B).

Een voordeel van deze methode is dat een groot aantal hersenen snel kan worden geoogst en opgeslagen in een vergadering om zorgvuldig te worden ontleed op een later tijdstip. ROI's kunnen ook worden opgeslagen zonder dat de weefsels ontdooid worden. Met deze methode kan een onderzoeker een grote en diverse collectie ROI's verzamelen waaruit hoogwaardig nucleïnezuur of eiwit kan worden verkregen. Om dit punt te bevestigen, werd RNA gewonnen uit de ontleedmpfc die gedurende enkele weken was opgeslagen (geoogste hersenen waren enkele maanden opgeslagen). Alle monsters produceerden RNA van hoge kwaliteit met verschillende ribosomalbanding en RINs boven 8 (Figuur 5C).

Westerse vlekanalyse werd gebruikt om de eiwitintegriteit van bevroren ontleed mPFC te bevestigen zoals eerder beschreven20. Westerse vlekken geven een verminderd signaal van doelen met een hoog moleculair gewicht weer wanneer eiwit wordt afgebroken. De afbraakproducten verschijnen ook als uitstrijkje bij lagere moleculaire gewichten in de kolom. Voor deze analyse werd eiwit verzameld, overgebracht naar nitrocellulose en onderzocht met antilichamen tegen een hoog moleculair gewichtsdoel, KCC2, en het eiwit met een lager moleculair gewicht, actine (Figuur 5D). In alle gevallen waren de banden scherp en duidelijk zonder waarneembare afbraakproducten voor KCC2 of actin. Deze experimenten bevestigen dat de dissectie van ROI's met behulp van deze methode de extractie van hoogwaardig RNA en eiwit mogelijk maakt.

Figure 1
Figuur 1: Bevroren werkoppervlakken voorbereiden. (A) Een hersenblok wordt geplaatst op een stapel gel packs in een geïsoleerde doos en wordt vervolgens ingeklemd tussen twee extra gel packs. Aluminiumfolie wordt aan elk uiteinde van het blok verpakt om de koeling tijdens het doorsnede te vergemakkelijken. De doos wordt dan 's nachts gekoeld bij -20 °C. (B) Een glasplaat is afgestemd op de grootte met de opening van een geïsoleerde doos. Hiervoor kan een verzenddoos worden gebruikt. IJs wordt toegevoegd aan de doos totdat het ongeveer 5 cm van de top. De doos wordt dan 's nachts ingevroren bij -20 °C. (B, C) Vlak voor het verzamelen van weefsel wordt een uniforme laag droogijs op de bovenkant van het ijs geplaatst op een diepte van ongeveer 2,5 cm. Een vel zwart plastic (om te helpen bij visualisatie) wordt geplaatst over het droge ijs, gevolgd door de glasplaat. Droogijs wordt in de verre hoeken geplaatst, waardoor de lucht net boven de plaat afkoelt. Gereedschap kan worden gekoeld door ze op de plaat te leggen, of door ze kort aan te raken op het droge ijs. (D) Om symmetrische secties te garanderen, moeten de hersenen worden geplaatst met koude tangen, zodat de sagittale sinus en dwarse sinus lijn met de loodrechte groeven van het blok (witte pijlen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Hersens doordelen met behulp van een hersenblok. (A) De oriëntatie van de hersenen wordt verankerd door het plaatsen van conventionele single edge scheermesjes in de cortex op een diepte van ongeveer 1 mm. Het plaatsen van een in het midden en een aan elk uiteinde helpt om de hersenen in positie te houden. (B) Voeg messen een voor een toe totdat alle sleuven zijn gevuld. (C) Laagprofielbladen kunnen tussen conventionele bladen worden geplaatst wanneer 0,5 mm secties gewenst zijn (rode pijl). (C, D) De groep messen wordt met matige neerwaartse druk in het bevroren weefsel geduwd, met behulp van een plat instrument of de handpalm of vingers van de hand. Messen kunnen langzaam heen en weer worden wiegd om ze door het weefsel te helpen bewegen. (E) Secties worden verwijderd door het grijpen van de zijkanten van de scheermesjes en met behulp van een schommelende beweging en stevige opwaartse druk (Let op: Wees voorzichtig om scherpe uiteinden van de bladen te voorkomen). Til de groep uit het blok en plaats het voorste kant omhoog op de bevroren glasplaat. Plaats droogijs naast bladen om secties volledig te koelen alvorens te scheiden. fF) Afzonderlijke messen en lay secties in orde. (G, H) Secties kunnen worden verwijderd uit messen door het buigen van blad lichtjes met vingers in de richting van de pijlen en het duwen van de sectie weg met een tweede koud blad. (I) Sommige secties kunnen verwijdering vereisen door het scheermesje tussen de vingers en duimen lichtjes op te warmen en vervolgens snel het bevroren gedeelte af te snijden met een tweede koud mes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: HET bepalen van ROI's met behulp van oriëntatiepunten en de Allen Mouse Brain Atlas. In dit voorbeeld, bevroren hersensecties zijn aan de linkerkant met overeenkomstige platen van de Allan Mouse Brain Atlas aan de rechterkant. ROI's (rode stippellijnen) worden geïdentificeerd door zichtbare oriëntatiepunten (zwarte vormen) te vergelijken met de Allen Mouse Brain Atlas. Bezienswaardigheden zijn: fa en cc, corpus callosum, aco, voorste commissur, VL, laterale ventrikel, V3, derde venticula. Voorbeeld ROI's: Pl/Il, prelimbic en infralimbic cortex, ACB, nucleus accumbens, MOs, motor cortex, CP, caudoputamen, HPF, hippocampus/dentate gyrus. Coronale atlasbeelden op de juiste credit: Allen Institute. De beelden zijn van platen 40, 44, 55 en 71 (boven naar beneden) en zijn verkregen van https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: ROI's ontleden. (A) Secties worden behandeld met behulp van tangen die periodiek worden gekoeld op droogijs. Beide zijden van elke sectie moeten worden vergeleken met de bijbehorende atlasafbeeldingen voordat ze worden ontledd. (B) ROI's worden verwijderd uit hersendelen met koude scalpel of (C) biopsie punch. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Analyse van RNA en eiwit met behulp van bevroren hersendissectiemethode. (A) Voorbeeld van slechte versus goede kwaliteit RNA. Elektroforetische scheiding van monster 1 toont afgebroken RNA met zwakke 28S- en 18S-banden en afbraakproducten tussen 25 en 200 nucleotiden (nt). Monster 2 toont RNA van goede kwaliteit met sterke 28S- en 18S-banden en weinig signaal bij lage moleculaire gewichten. RNA-integriteitsgetallen geven dit verschil weer met monster 1, RIN = 2,5 en monster 2, RIN = 8,6. (B) Vergelijking van RNA gewonnen uit bevroren versus vers ontleed mediale prefrontale cortex van muizen. Bevroren monsters werden enkele maanden voor ontleding op -80 °C gehouden. Onmiddellijk na de oogst werden verse monsters verwerkt. RIN-waarden van monsters die met beide methoden zijn verzameld, zijn hoog, met sterke 18S- en 28S-banden die aangeven dat nucleïnezuur is bewaard gebleven. (C, D) mPFC werd ontleed uit bevroren hersenen en RNA of eiwit werd geëxtraheerd. (C) RNA-analyse toont een goede kwaliteit RNA werd verkregen voor alle twaalf monsters met hoge RINs en weinig afbraak product waargenomen. (D) Westerse vlek analyse werd gedaan op de totale eiwiten en werd onderzocht op de aanwezigheid van het hoge moleculaire gewicht KCC2 ionkanaal (rode banden, MW = 130 kDa). De KCC2 band is duidelijk zichtbaar met geen lagere moleculaire gewicht afbraak producten waargenomen. Het huishoudgen, Actin (groene banden, MW = 42 kDa) wordt ook getoond. mPFC monsters van 12 hersenen worden gelabeld 1-12. WB staat voor hele hersencontrole. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit werk beschrijft een techniek om kleine, specifieke gebieden van de hersenen te isoleren en tegelijkertijd de afbraak van nucleïnezuur en eiwit te beperken. Schade aan hersenweefsels gebeurt snel zodra een organisme sterft. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een snelle opbouw van extracellulaire glutamaat en de daaruit voortvloeiende excitotoxiciteit die optreedt21. Messenger RNA is bijzonder kwetsbaar voor degradatie22,23. Afbraak van eiwit en nucleïnezuur wordt sterk verminderd bij lage temperaturen, zoals blijkt uit een recent artikel waarin de biologische activiteit in mammoetcellen bevroren in permafrost 28.000 jaar geleden24.

Met de hierbeschreven methode worden hersenen vastgemaakt en worden gereedschappen en weefsels onder het vriespunt gehouden totdat nucleïnezuur of eiwitextractie wordt gestart. Bevroren ROI's worden vervolgens gehomogeniseerd in buffer met protease- en nucleaseremmers, waardoor doelmoleculen worden beschermd tegen afbraak bij hogere temperaturen.

In dit proces is het belangrijk om duidelijke oriëntatiepunten te identificeren om ROI's binnen de secties te lokaliseren. Vezeltje jenaar van de voorste commissure en corpus callosum werken goed voor dit doel, net als de ventrikels. Veranderingen in de vorm van de hippocampus als men beweegt voorste naar achterste kan ook worden gebruikt. Afhankelijk van hoe goed de hersenen is uitgelijnd in de matrix, oriëntatiepunten kunnen worden scheef, of ontbreekt. Voorzichtigheid is geboden voordat roi's uit dit soort secties worden verzameld, aangezien besmette gebieden in de steekproef kunnen terechtkomen. Voordat u wordt opgehaald, moet aan beide zijden van de sectie een ROI worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat deze consistent is in de hele sectie. Dissectie van ROI's is beperkt tot goed gedefinieerde gebieden van de hersenen die groter zijn dan ongeveer 1 mm in de x-y dimensie.

Bij het ontleden van ROI's is het nodig om weefsels bevroren te houden zonder ze te broos te maken. Weefsel dat te koud is zal breken wanneer de druk wordt toegepast met een punch of scalpel. De regio van belang is vaak moeilijk te identificeren uit andere fragmenten wanneer dit gebeurt. Een manier om dit te verzachten is om de secties kort te verplaatsen naar een warmer gebied van de plaat (weg van droogijs). Het is ook belangrijk om de glasplaat schoon te houden. Zodra een sectie is verwerkt, moet de plaat schoon worden geschraapt met een scheermesje voordat u naar de volgende gaat. Na verloop van tijd condenseert het water op de dissectieplaat uit de lucht die de monsterherkenning kan bedekken of anderszins kan verstoren. Het reinigen van de plaat gebeurt door het schrapen van de scherpe rand van een scheermesje over het oppervlak van het glas en het afvegen van de verzamelde vorst en puin. Kleine ROI's zijn niet te onderscheiden van ongewenste hersenfragmenten, dus het is erg belangrijk om een schoon werkgebied te behouden.

Veel laboratoria gebruiken commerciële producten25 om RNA in geoogste weefsels te beschermen. Terwijl labiele moleculen zijn goed bewaard gebleven op deze manier, een nadeel is dat de morfologie van het weefsel radicaal is veranderd. Als gevolg hiervan kan het moeilijk zijn om de regio's van belang te vinden met behulp van referentiekaarten. Het ontleden van ROI's uit snap-frozen hersenen voor het gebruik van deze producten kan daarom een betere optie zijn.

Hoewel we ons hebben gericht op coronale plakjes in dit werk, moet deze methode goed werken voor horizonale en sagittale secties. Kaarten voor deze oriëntaties zijn over het algemeen lager in resolutie in vergelijking met die voor coronale secties. Dit verandert echter snel met initiatieven van groepen als het Allen Brain Institute. Een andere overweging is de leeftijd van het dier bij de oogst. De morfologie van jonge dierlijke hersenen is zeer verschillend van dat van de volwassene en vereist een gespecialiseerde atlas en een verschillende grootte hersenenmatrijs. Bronnen zoals de Developing Mouse Brain Atlas26 zijn essentieel bij het verzamelen van nauwkeurige hersenmonsters van jongere muizen.

Dit werk beschrijft een proces dat kan worden gebruikt om kleine gebieden te oogsten vanuit de knaagdierhersenen. De morfologie van secties is goed bewaard gebleven met bevroren snijden, en als de weefsels worden gehouden bevroren van de oogst tot extractie, de kwaliteit van nucleïnezuur en eiwit is hoog. Dit proces heeft het voordeel ten opzichte van de dissectie van vers verzameld weefsel, aangezien monsterhersenen van een grote groep dieren snel kunnen worden verzameld en opgeslagen. Regio's in de hersenen kunnen vervolgens worden geïdentificeerd met behulp van oriëntatiepunten geïdentificeerd in gemeenschappelijke hersenatlassen en verzameld in een zorgvuldig tempo zonder verlies van doelmoleculen. Deze methode kan een goede optie voor sommige laboratoria als de tools en regenten nodig zijn goedkoop en direct beschikbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het NIH, DA043982 en DA046196.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
  2. Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
  4. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25, (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
  5. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, (1), 57-63 (2009).
  6. Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. 054312 (2016).
  7. Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5, (4), 249-260 (2006).
  8. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
  9. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
  10. Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
  11. Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20, (11), 1826-1835 (2006).
  12. Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12, (63), (2018).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
  14. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
  15. Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. Academic Press. (2001).
  17. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. Academic Press. (1998).
  18. RNaseZap. Ambion. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
  19. Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  20. Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. (2019).
  21. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, (1), 171-182 (1990).
  22. Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265, (1-2), 11-23 (2001).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8, (2), 56507 (2013).
  24. Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9, (1), 4050 (2019).
  25. Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
  26. Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter