Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses
Summary
Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.
Abstract
Naarmate ons begrip van de neurobiologie is gevorderd, worden moleculaire analyses vaak uitgevoerd op kleine hersengebieden zoals de mediale prefrontale cortex (mPFC) of nucleus accumbens. De uitdaging in dit werk is om het juiste gebied te ontleden met behoud van de te onderzoeken microomgeving. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige, goedkope methode met behulp van middelen die direct beschikbaar zijn in de meeste laboratoria. Deze methode behoudt nucleïnezuur en eiwitten door het weefsel bevroren te houden gedurende het hele proces. Hersenen worden gesneden in 0,5-1,0 mm secties met behulp van een hersenmatrix en gerangschikt op een bevroren glasplaat. Oriëntatiepunten binnen elke sectie worden vergeleken met een verwijzing, zoals de Allen Mouse Brain Atlas, en regio’s worden ontleed met behulp van een koude scalpel of biopsie punch. Weefsel wordt vervolgens opgeslagen bij -80 °C tot gebruik. Door dit proces zijn rat en muis mPFC, nucleus accumbens, dorsale en ventrale hippocampus en andere regio’s met succes geanalyseerd met behulp van qRT-PCR en westerse testen. Deze methode is beperkt tot hersengebieden die kunnen worden geïdentificeerd door duidelijke oriëntatiepunten.
Introduction
Dit werk illustreert de dissectie van bevroren hersengebieden voor de extractie van hoogwaardig nucleïnezuur of eiwit met behulp van een referentie, zoals de Allen Mouse Brain Atlas1, als een gids. In deze techniek worden hersenen flash-bevroren en opgeslagen bij -80 °C voor latere sectie en ontleding terwijl ze in een bevroren toestand worden gehouden. Dit proces stelt de onderzoeker in staat om een groot aantal hersenen in één sessie te oogsten en ze later te ontleden voor een nauwkeurige verzameling van meerdere hersengebieden.
De nauwkeurige verzameling van hersengebieden van belang (ROI’s) is vaak nodig bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot gen- en eiwitexpressie. Terwijl farmacologie, elektrofysiologie en optogenetica kunnen worden gebruikt op wildtype of genetisch gemodificeerde knaagdieren om te helpen verduidelijken moleculaire veranderingen die ondersteunen waargenomen gedrag2,3,4, de meting van geïnduceerde veranderingen in transcriptomen en proteomen wordt vaak gebruikt om deze bevindingen te ondersteunen. Technieken zoals kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR), westelijke blotting, RNAseq5,MAPSeq6 en HPLC7 zijn robuust en relatief laag in kosten, waardoor veel laboratoria om geïnduceerde moleculaire veranderingen te bestuderen binnen kleine hersengebieden2,4,5,6.
Er zijn verschillende manieren om nucleïnezuur of eiwit uit hersengebieden8,9,10,11,12te extraheren en te zuiveren. Veel laboratoria oogsten hersengebieden door het koelen en snijden van hersenen op ijs op het moment van oogst9,13. Hoewel deze aanpak kan resulteren in hoge kwaliteit nucleïnezuur en eiwit, is het enigszins tijd-beperkt als afbraak binnen de micro-omgeving van het weefsel kan plaatsvinden bij deze temperaturen. Dit kan met name het geval zijn bij een poging om een groot aantal dieren of ROI’s in één vergadering te ontleden. Het houden van monsters bevroren helpt handhaven van bieldoelmoleculen, terwijl de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te vergelijken oriëntatiepunten aan beide zijden van elke sectie in de poging om relatief zuivere monsters te verzamelen. Laser capture is een andere manier om weefsel te verzamelen voor RNA of eiwitanalyse uit hersengebieden10. Deze procedure is superieur aan mechanische dissectie in die zin dat zeer kleine en onregelmatig gevormde ROI’s kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd. Echter, laser capture wordt beperkt door het gebruik van dure apparatuur en reagentia, is tijdrovend en kan ook meer vatbaar zijn voor afbraak van monsters.
Micropunch dissectie op bevroren weefsels is niet nieuw. Vroege papers van Miklos Palkovits en anderen beschrijven de basistechnieken in detail14,15. Deze presentatie volgt grotendeels het oorspronkelijke werk, met enkele verbeteringen om de efficiëntie te vergemakkelijken en de kosten van de benodigde apparatuur te verlagen. Bijvoorbeeld, hersensecties worden gemaakt in een bevroren hersenblok in plaats van op een cryostat. Dit produceert dikkere secties die het aantal secties die nodig zijn om ROI monsters te verzamelen vermindert. Deze methode ontleedt ook monsters op een bevroren glasplaat die op droogijs in een geïsoleerde doos zit. Dit levert een subvriesfase op de bank waarop u moet werken. Secties die op deze manier worden ontleed zijn gemakkelijk te manipuleren, waardoor de onderzoeker beide zijden van elke sectie kan vergelijken met een verwijzing om besmetting van regio’s buiten de gewenste ROI te beperken.
Voordelen van dit protocol zijn dat 1) de hersenen wordt gehouden in een bevroren toestand gedurende het hele proces, die helpt bij het behoud van eiwitten en nucleïnezuur en geeft de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te oogsten ROI’s, en 2) de benodigde reagentia zijn goedkoop en worden gevonden in de meeste moleculaire biologie labs. In dit proces worden hele hersenen in een hersenmatrix tot 0,5-1,0 mm doorsneden en op een bevroren glasplaat geplaatst die continu wordt gekoeld met droogijs. Oriëntatiepunten gevonden in de Allen Brain Atlas1 of andere hersenen atlassen16,17 worden gebruikt om gebieden van belang te identificeren, die vervolgens worden ontleed met behulp van een koude punch of scalpel. Omdat het weefsel nooit ontdooid is, leveren regio’s die op deze manier worden geoogst hoogwaardige RNA en eiwit voor downstream analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft een techniek om kleine, specifieke gebieden van de hersenen te isoleren en tegelijkertijd de afbraak van nucleïnezuur en eiwit te beperken. Schade aan hersenweefsels gebeurt snel zodra een organisme sterft. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een snelle opbouw van extracellulaire glutamaat en de daaruit voortvloeiende excitotoxiciteit die optreedt21. Messenger RNA is bijzonder kwetsbaar voor degradatie22,23. Afbraak van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het NIH, DA043982 en DA046196.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
- RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
- . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)
