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Neuroscience

डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए जमे हुए कृंतक मस्तिष्क क्षेत्रों का संग्रह

Published: April 23, 2020 doi: 10.3791/60474
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Psychological and Brain Sciences, Gill Center for Biomolecular Research, Indiana University

Summary

यह प्रक्रिया सस्ती और आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन और आरएनए प्राप्त करने के लिए असतत जमे हुए मस्तिष्क क्षेत्रों के संग्रह का वर्णन करती है।

Abstract

जैसा कि न्यूरोबायोलॉजी की हमारी समझ ने प्रगति की है, आणविक विश्लेषण अक्सर छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे कि मीकर प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी) या नाभिक एक्यूबेन्स पर किए जाते हैं। इस कार्य में चुनौती माइक्रोएनवायरमेंट को संरक्षित करते हुए सही क्षेत्र को विच्छेदन करने की है। इस पेपर में, हम अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध संसाधनों का उपयोग करके एक सरल, कम लागत वाली विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि पूरे प्रक्रिया में ऊतक को जमे हुए रखकर न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को संरक्षित करती है। दिमाग को मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग करके 0.5-1.0 मिमी वर्गों में काटा जाता है और जमे हुए ग्लास प्लेट पर व्यवस्थित किया जाता है। प्रत्येक खंड के भीतर स्थलों की तुलना एक संदर्भ से की जाती है, जैसे एलन माउस ब्रेन एटलस, और क्षेत्रों को ठंडे स्केलपेल या बायोप्सी पंच का उपयोग करके विच्छेदित किया जाता है। ऊतक तो उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। इस प्रक्रिया के माध्यम से चूहा और माउस एमपीएफसी, नाभिक एक्यूबेन, पृष्ठीय और वेंट्रल हिप्पोकैम्पस और अन्य क्षेत्रों का सफलतापूर्वक क्यूआरटी-पीसीआर और पश्चिमी परखों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया है। यह विधि मस्तिष्क क्षेत्रों तक सीमित है जिसे स्पष्ट स्थलों द्वारा पहचाना जा सकता है।

Introduction

यह काम एक गाइड के रूप में एलन माउस ब्रेन एटलस1जैसे संदर्भ का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन की निकासी के लिए जमे हुए मस्तिष्क क्षेत्रों के विच्छेदन को दिखाता है। इस तकनीक में, दिमाग को फ्लैश-फ्रोजन किया जाता है और बाद में अनुभागन और विच्छेदन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, जबकि जमे हुए स्थिति में बनाए रखा जाता है। यह प्रक्रिया शोधकर्ता को एक सत्र में बड़ी संख्या में दिमाग की कटाई करने और बाद में कई मस्तिष्क क्षेत्रों के सटीक संग्रह के लिए उन्हें विच्छेदन करने की अनुमति देती है।

जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति से संबंधित सवालों का जवाब देते समय अक्सर मस्तिष्क के हित क्षेत्रों (आरओआई) के सटीक संग्रह की आवश्यकता होती है। जबकि फार्माकोलॉजी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग वाइल्डटाइप या आनुवंशिक रूप से संशोधित कृंतक पर किया जा सकता है ताकि आणविकपरिवर्तनोंको कम करने में मदद मिल सके2,3,,4,ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटेम में प्रेरित परिवर्तनों की माप का उपयोग अक्सर इन निष्कर्षों का समर्थन करने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर), वेस्टर्न ब्लॉटिंग, आरएनएसईक्यू5,मैपसेक्यू6 और एचपीएलसी7 जैसी तकनीकें मजबूत और अपेक्षाकृत कम लागत में हैं, जिससे कई प्रयोगशालाओं को छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों2,4,,55,6के भीतर प्रेरित आणविक परिवर्तनों का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है।,

मस्तिष्क क्षेत्रों8,9,, 10 ,,,11,12से न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन निकालने और शुद्ध करने के कई तरीके हैं .10 कई प्रयोगशालाएं9,13फसल के समय बर्फ पर दिमाग को हल्का और काटकर मस्तिष्क क्षेत्रों की फसल करती हैं । हालांकि इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन हो सकते हैं, यह कुछ समय सीमित है क्योंकि ऊतक के सूक्ष्म वातावरण के भीतर गिरावट इन तापमानों पर हो सकती है। यह विशेष रूप से सच हो सकता है जब एक बैठे में बड़ी संख्या में जानवरों या आरओआई को विच्छेदन करने का प्रयास किया जाता है। नमूनों को जमे हुए रखने में मदद करता है labile लक्ष्य अणुओं को बनाए रखने जबकि शोधकर्ता समय प्रदान करने के लिए ध्यान से अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों को इकट्ठा करने के प्रयास में प्रत्येक खंड के दोनों ओर स्थलों की तुलना । लेजर कैप्चर मस्तिष्क क्षेत्रों10से आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए ऊतक एकत्र करने का एक और तरीका है। यह प्रक्रिया यांत्रिक विच्छेदन से बेहतर है कि बहुत छोटे और अनियमित आकार के आरओआई की पहचान की जा सकती है और अलग-थलग किया जा सकता है। हालांकि, लेजर कैप्चर महंगे उपकरणों और अभिकर्मकों के उपयोग से सीमित है, समय लेने वाला है और नमूना क्षरण के लिए अधिक संवेदनशील भी हो सकता है।

जमे हुए ऊतकों पर माइक्रोपंच विच्छेदन नया नहीं है। मिक्लोस पालकोविट्स और अन्य द्वारा प्रारंभिक कागजात में मूल तकनीकों काविस्तार,से वर्णन किया गया है। यह प्रस्तुति काफी हद तक मूल काम का अनुसरण करती है, जिसमें दक्षता की सुविधा और आवश्यक उपकरणों की कीमत को कम करने के लिए कुछ सुधार होते हैं। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क वर्गों को क्रायोस्टेट के बजाय जमे हुए मस्तिष्क ब्लॉक में बनाया जाता है। यह मोटा वर्गों का उत्पादन करता है जो आरओआई नमूनों को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक वर्गों की संख्या को कम करता है। यह विधि एक जमे हुए ग्लास प्लेट पर नमूनों को विच्छेदित करती है जो एक अछूता बॉक्स के भीतर सूखी बर्फ पर बैठता है। यह बेंच पर एक उप ठंड चरण पैदा करता है जिस पर काम करने के लिए । इस तरह से विच्छेदित अनुभाग आसानी से जोड़-तोड़ कर सकते हैं, जिससे शोधकर्ता वांछित आरओआई के बाहर के क्षेत्रों से संदूषण को सीमित करने के लिए प्रत्येक अनुभाग के दोनों पक्षों की तुलना संदर्भ के साथ कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल के फायदे यह हैं कि 1) मस्तिष्क को पूरे प्रक्रिया में एक जमे हुए स्थिति में रखा जाता है, जो प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को संरक्षित करने में मदद करता है और शोधकर्ता को सावधानीपूर्वक फसल ROIs करने का समय देता है, और 2) आवश्यक अभिकर्मक सस्ती होते हैं और अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में पाए जाते हैं। इस प्रक्रिया में, पूरे दिमाग को मस्तिष्क मैट्रिक्स में 0.5-1.0 मिमी तक अनुभागित किया जाता है और एक जमे हुए ग्लास प्लेट पर रखा जाता है जो लगातार सूखी बर्फ के साथ ठंडा होता है। एलन ब्रेन एटलस 1 या अन्य मस्तिष्क एटलस16,,17 में पाए जाने वाले स्थलों का उपयोग ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए किया जाता है, जो तब एक ठंडा पंच या स्केलपेल का उपयोग करके विच्छेदित होते हैं।1 क्योंकि ऊतक कभी गल नहीं जाता है, इस तरीके से काटे गए क्षेत्र डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए और प्रोटीन प्रदान करते हैं।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जानवरों का इलाज इंडियाना विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसयूसी) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (एनआईएच) दिशानिर्देशों द्वारा निर्धारित नैतिक और मानवीय तरीके से किया गया था ।

नोट: किसी भी काम शुरू करने से पहले18 nucleases को हटाने के लिए सभी उपकरणों और सतहों को एक उपयुक्त विलायक के साथ धोया जाना चाहिए।

1. दिमाग का भंडारण

  1. जल्दी से इच्छामृत्यु वयस्क CD1 वाइल्डटाइप चूहों से दिमाग को हटा दें जो पारंपरिक दृष्टिकोण13 का उपयोग करके लगभग 30 ग्राम वजनी हैं और या तो तरल नाइट्रोजन या शुष्क बर्फ के साथ पूर्व-ठंडा होने में 60 सेकंड के लिए फ्लैश-फ्रीज हैं।
  2. उपयोग तक एल्यूमीनियम पन्नी या शंकुलिन ट्यूबों में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए दिमाग स्टोर करें।

2. मस्तिष्क मैट्रिक्स तैयार करना

  1. ऊतक विच्छेदन से पहले चौबीस घंटे, गल फ्रीजर पैक के ढेर पर एक साफ मस्तिष्क मैट्रिक्स (सामग्री की मेजदेखें) जगह है । सैंडविच दो फ्रीजर पैक के बीच मैट्रिक्स के किनारों को रेजर स्लॉट के नीचे और जेल पैक के शीर्ष(चित्रा 1A)के बीच लगभग 0.5 सेमी छोड़ना सुनिश्चित करना सुनिश्चित करता है। ठंडा करने में सहायता करने के लिए सिरों पर एल्यूमीनियम पन्नी रखें।
    नोट: मस्तिष्क मैट्रिक्स खरीदते समय, एक है कि काफी बड़ा मस्तिष्क की पूरी मात्रा को विभाजित करने के लिए encase है खरीदते हैं ।
  2. रात भर ऊपर अजर के साथ एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मस्तिष्क मैट्रिक्स और फ्रीजर पैक युक्त बॉक्स रखें।

3. एक जमे हुए कांच की थाली की स्थापना

नोट: इस सेटअप का उद्देश्य एक जमे हुए सतह को तैयार करना है जिस पर मस्तिष्क वर्गों को विच्छेदन करना है।

  1. ऊपर से लगभग 5 सेमी तक एक अछूता बॉक्स में बर्फ रखें। फिर बर्फ के शीर्ष पर सूखी बर्फ की 2.5 सेमी परत रखें और नमूने की कल्पना करने में सहायता करने के लिए काले प्लास्टिक की चादर के साथ कवर करें(चित्रा 1B, चित्रा 1 C)।
  2. प्लास्टिक के शीर्ष पर एक ग्लास प्लेट रखें (बॉक्स के उद्घाटन में बस फिट होना चाहिए) और दूर कोनों(चित्रा 1 C)में प्लेट के शीर्ष पर सूखी बर्फ रखें।
  3. फ्रीजर से जमे हुए ब्रेन मैट्रिक्स लें और कॉर्टेक्स-साइड को काटने के लिए दिमाग डालें। इसे 10 00 के लिए बॉक्स में तापमान के लिए समतुल्य करने की अनुमति दें । इस समय के दौरान बॉक्स पर ढक्कन रखें ।
  4. मैट्रिक्स में मस्तिष्क की स्थिति को ठंडे संदंश के साथ समायोजित करें ताकि सग्तल सिनस और ट्रांसवर्स सीनस ब्लॉक के लंबवत खांचे(चित्रा 1 डी)के साथ लाइन अप हो। यह आसान विच्छेदन के लिए सममित वर्गों को सुनिश्चित करने में मदद करेगा। मस्तिष्क को समायोजित करने से पहले ठंडा करने के लिए संक्षेप में बर्फ सूखने के लिए संदंश के स्पर्श सुझाव।
  5. एक बार मस्तिष्क की स्थिति में है, अपने केंद्र के पास एक ठंडा रेजर ब्लेड जगह है और ऊतक में लगभग 1 मिमी ब्लेड प्रेस । मस्तिष्क को जगह में रखने में मदद करने के लिए रोस्ट्रल और कौडल सिरों में ठंडा ब्लेड जोड़ें(चित्रा 2A और चित्रा 2B)।
  6. रोस्ट्रल अंत पर शुरू, एक समय में ब्लेड एक जोड़ें, उन्हें स्लॉट में रखकर और उन्हें धीरे से ऊतक में नीचे दबाने लगभग 1 मिमी(चित्रा 2B)। कौडल अंत की दिशा में काम कर रहे 1 मिमी अंतराल पर ब्लेड जोड़ना जारी रखें।
  7. सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क इस समय के दौरान बदलाव नहीं करता है। क्षैतिज और खड़ी ब्लेड अप लाइन(चित्रा 2B)। वर्गों को 0.5 मिमी चौड़ाई में काटने के लिए, लो प्रोफाइल माइक्रोटोम ब्लेड (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जा सकता है। इन्हें बड़े रेजर ब्लेड(चित्रा 2C)के बीच रखें।
  8. एक बार ब्लेड जगह में हैं, उंगलियों, हथेली या कुछ अन्य सपाट सतह के साथ समूह के शीर्ष पर नीचे प्रेस(चित्रा 2C, चित्रा 2D)। ऊतक के माध्यम से उन्हें स्थानांतरित करने के लिए धीरे-धीरे ब्लेड के समूह को साइड से रॉक करें।
    नोट: इसमें कुछ समय (1-2 मिन) लग सकता है और धैर्य की आवश्यकता होती है। ऊतक के माध्यम से चलती ब्लेड के लिए प्रतिरोध होना चाहिए। आसान प्रवेश का मतलब है कि मस्तिष्क गल रहा है और ब्लॉक को सूखी बर्फ से ठंडा किया जाना चाहिए।
  9. जब सभी ब्लेड स्लॉट के नीचे तक पहुंच गए हैं, तो ब्लेड के समूह के प्रत्येक पक्ष को समझें और आगे-पीछे कमाल करके मैट्रिक्स से मुक्त काम करें।
    नोट: ब्लेड के तेज किनारों पर खुद को काटने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
  10. एक बार समूह मुक्त हो जाने के बाद, कांच की प्लेट(चित्रा 2E)पर स्टैक, रोस्ट्रल साइड अप रखें। सूखी बर्फ के बगल में और/या ढेर के शीर्ष पर जगह के लिए आगे आसान जुदाई के लिए नमूनों फ्रीज ।
  11. अंगूठे और उंगलियों के बीच ढेर को स्थानांतरित करके कांच की प्लेट और अलग ब्लेड पर तेज किनारों के साथ ढेर रखें। ब्लेड जुड़े वर्गों के साथ एक दूसरे से अलग होना चाहिए।
  12. कांच की थाली पर रोस्ट्रल से कौडल(चित्रा 2F)तक के खंडों को लाइन करें।
  13. उंगलियों के बीच ब्लेड ठोको, या एक दूसरे ठंडे उस्तरा(आंकड़े 2G, 2H, 2I)के साथ अलग करके ब्लेड से अलग ऊतक ।

4. विच्छेदन वर्ग

  1. एलन माउस ब्रेन एटलस या किसी अन्य संदर्भ को खोलें और रुचि के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए आवश्यक स्थलों को ढूंढें। कुछ स्पष्ट स्थलों में पूर्वकाल संयोजिका, कॉर्पस कैलोसम, पार्श्व वेंट्रिकल्स, और हिप्पोकैम्पस(चित्रा 3)शामिल हैं।
  2. खंड को ठंडा संदंश के साथ काटने के लिए फ्लिप करें और सुनिश्चित करें कि एकत्र किए जाने वाले क्षेत्र पूरे खंड में सुसंगत है। कटाई के दौरान, संदर्भ एटलस से परामर्श अक्सर सुनिश्चित करें कि सही आरओआई प्राप्त किया जाता है।
    नोट: एक आवर्धक ग्लास या विच्छेदन माइक्रोस्कोप अक्सर इस प्रक्रिया में सहायक होता है। अच्छी लाइटिंग भी जरूरी है। इस उद्देश्य के लिए कम वाट एलईडी लैंप या एक शांत लैंप (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जा सकता है।
  3. एक साफ स्केलपेल या पंच के साथ, अनुभाग में कटौती(चित्र4)। बर्फ सूखने के लिए संक्षेप में इसे छूकर काटने से पहले प्रत्येक उपकरण को प्रीचिल करें। ब्लेड को धीरे से लेकिन दृढ़ता से ऊतक में धकेलें, कटौती करने के लिए इसे आगे-पीछे कमाल करें। बहुत मेहनत से धक्का न दें या ऊतक फ्रैक्चर हो जाएगा।
    नोट: उपकरण समय के साथ गर्म हो जाएगा। थोड़ा गर्म ब्लेड साफ कटौती करने में मददगार हो सकता है और फ्रैक्चरिंग को सीमित कर सकते हैं, लेकिन ऊतक के विगलन से बचने के लिए सावधान रहें। समय-समय पर सूखी बर्फ पर उपकरण ठंडा।
  4. एक बार आरओआई काटा जाता है, यह लेबल में जगह है, prechilled १.५ mL ट्यूबों । स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर काटा ऊतकों की जरूरत है जब तक।
  5. प्रक्रिया जमे हुए ऊतक ठंड रिपा बफर (50 एमएम Tris जोड़कर इस तरह से एकत्र, पीएच 8.0, 150 mM NaCl, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.1% एसडीएस, 0.5% चैप्स और प्रोटीन अवरोधक कॉकटेल (सामग्री की तालिकादेखें)) प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, या एक ग्वानिडिनियम युक्त सॉल्वेंट (सामग्री की तालिकादेखें) जमे हुए नमूने के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए और तुरंत एक गिलास डंग या यांत्रिक समरूपकाकरण का उपयोग करके होमोजेनेटाइज करें (टेबलटेबल देखें) इस तरह, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को क्षरण से बचाने के लिए नमूना गर्म होने के साथ ही प्रोटीज़ और न्यूक्लीज अवरोधक मौजूद हैं।

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Representative Results

इस विधि को मान्य करने के लिए, वयस्क सीडी 1 वाइल्डटाइप पुरुष चूहों और आरएनए और प्रोटीन से मीडिएटल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स एकत्र किया गया था और विशेषता थी। आरएनए का विश्लेषण केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया गया था। अपमानित आरएनए 28S और 18S राइबोसोमल बैंड की तीव्रता में नुकसान प्रदर्शित करता है और 25 और 200 न्यूक्लियोटाइड्स(चित्रा 5A,नमूना 1) के बीच एक धब्बा के रूप में गिरावट वाले उत्पादों को भी दिखाता है। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए कम आणविक वजन क्षेत्र(चित्रा 5A,नमूना 2) में कोई संकेत करने के लिए थोड़ा के साथ अलग राइबोसोमल बैंड से पता चलता है । इस विश्लेषण में आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (आरआईएन) भी जेनरेट होते हैं। 7 से ऊपर RINs अच्छी गुणवत्ता आरएनए19संकेत मिलता है । जमे हुए विच्छेदन विधि का उपयोग कर नमूनों से अलग आरएनए मजबूत राइबोसोमल बैंडिंग और उच्च आरआईनए मूल्यों को ताजा काटे गए ऊतक(चित्रा 5B)से तैयार आरएनए के साथ बहुत अनुकूल तुलना करते हैं।

इस विधि का एक लाभ यह है कि बड़ी संख्या में दिमाग को जल्दी से काटा जा सकता है और बाद के समय सावधानीपूर्वक विच्छेदित होने के लिए एक बैठे में संग्रहीत किया जा सकता है। आरओआई को ऊतकों को गल जाने के बिना भी संग्रहीत किया जा सकता है। इस विधि के साथ, एक शोधकर्ता आरओआई का एक बड़ा और विविध संग्रह एकत्र कर सकता है जिसमें से उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन प्राप्त किए जा सकते हैं। इस बिंदु की पुष्टि करने के लिए, आरएनए विच्छेदित एमपीएफसी से निकाला गया था जिसे कई हफ्तों से संग्रहित किया गया था (काटा गया दिमाग कई महीनों तक संग्रहीत किया गया था)। सभी नमूनों ने 8 से ऊपर अलग राइबोसोमल बैंडिंग और आरआईएनएस(चित्रा 5C)के साथ उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए का उत्पादन किया।

पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग जमे हुए विच्छेदित एमपीएफसी की प्रोटीन अखंडता की पुष्टि करने के लिए किया गया था जैसा कि पहले20वर्णित था । पश्चिमी धब्बों प्रदर्शन उच्च आणविक वजन लक्ष्यों के संकेत कम जब प्रोटीन अपमानित किया जाता है । क्षरण उत्पाद कॉलम के भीतर कम आणविक वजन पर धब्बा के रूप में भी दिखाई देते हैं। इस विश्लेषण के लिए प्रोटीन एकत्र किया गया था, नाइट्रोसेल्यूलोस में स्थानांतरित किया गया था, और उच्च आणविक वजन लक्ष्य, केसीसी 2 और कम आणविक वजन प्रोटीन, ऐक्टिन(चित्रा 5D)के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। सभी मामलों में, बैंड या तो KCC2 या actin के लिए कोई प्रत्यक्ष टूटने उत्पादों के साथ तेज और अलग थे । ये प्रयोग इस बात की पुष्टि करते हैं कि इस विधि का उपयोग करके आरओआई का विच्छेदन उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए और प्रोटीन को निकालने में सक्षम बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1: जमे हुए काम सतहों की तैयारी । (A)एक मस्तिष्क ब्लॉक एक अछूता बॉक्स के भीतर जेल पैक के ढेर पर रखा जाता है और फिर दो अतिरिक्त जेल पैक के बीच सैंडविच है । एल्यूमीनियम पन्नी ब्लॉक के प्रत्येक छोर पर पैक किया जाता है अनुभागके दौरान ठंडा करने की सुविधा के लिए। बॉक्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठंडा किया जाता है। (ख)एक इंसुलेटेड बॉक्स के उद्घाटन के साथ आकार के लिए एक ग्लास प्लेट का मिलान किया जाता है। इस उद्देश्य के लिए एक शिपिंग बॉक्स का उपयोग किया जा सकता है। बर्फ बॉक्स में तब तक जोड़ा जाता है जब तक कि यह ऊपर से लगभग 5 सेमी न हो जाए। इसके बाद बॉक्स को रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कर दिया जाता है। (B, C) ऊतक इकट्ठा करने से ठीक पहले, सूखी बर्फ की एक समान परत लगभग 2.5 सेमी की गहराई पर बर्फ के शीर्ष पर रखी जाती है। कांच की थाली के बाद सूखी बर्फ के ऊपर काले प्लास्टिक (दृश्य में सहायता करने के लिए) की एक चादर रखी जाती है। सूखी बर्फ दूर कोनों में रखा जाता है, जो थाली के ठीक ऊपर हवा को ठंडा करता है। उपकरण उन्हें थाली पर बिछाने, या संक्षेप में उन्हें सूखी बर्फ को छूकर ठंडा किया जा सकता है। (घ)सममित वर्गों को सुनिश्चित करने के लिए, मस्तिष्क को ठंडे संदंश के साथ तैनात किया जाना चाहिए ताकि ब्लॉक (सफेद तीर) के लंबवत खांचे के साथ सग्तल पाप और ट्रांसवर्स सीनस लाइन अप हो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मस्तिष्क ब्लॉक का उपयोग करके मस्तिष्क को अनुभागित करना। (क)मस्तिष्क का अभिविन्यास लगभग 1 मिमी की गहराई में कॉर्टेक्स में पारंपरिक एकल एज रेजर ब्लेड को बैठने से लंगर डाले जाता है। एक को बीच में और प्रत्येक छोर पर एक रखने से मस्तिष्क को स्थिति में रखने में मदद मिलती है। (ख)एक समय में ब्लेड एक जोड़ें जब तक सभी स्लॉट भर रहे हैं । (ग)लो प्रोफाइल ब्लेड पारंपरिक ब्लेड के बीच डाला जा सकता है जब 0.5 मिमी वर्गवांछित (लाल तीर) होते हैं। (C, D) ब्लेड के समूह को मध्यम नीचे के दबाव के साथ जमे हुए ऊतक में धकेल दिया जाता है, या तो एक फ्लैट उपकरण या हथेली या हाथ की उंगलियों का उपयोग करके। ऊतक के माध्यम से उन्हें स्थानांतरित करने में मदद करने के लिए ब्लेड धीरे-धीरे आगे-पीछे हिल सकते हैं। (ई)रेजर ब्लेड के किनारों को लोभी और एक कमाल की गति और फर्म ऊपर की ओर दबाव का उपयोग करके वर्गों को हटा दिया जाता है (सावधानी: ब्लेड के तेज सिरों से बचने के लिए सावधान रहें)। समूह को ब्लॉक से बाहर उठाएं और इसे जमे हुए ग्लास प्लेट पर पूर्वकाल की ओर रखें। अलग करने से पहले पूरी तरह से ठंडा वर्गों के लिए ब्लेड के निकट सूखी बर्फ रखें। (एफ)अलग ब्लेड और क्रम में बाहर वर्गों रखना । (जी, एच) धाराओं को ब्लेड से हटाया जा सकता है थोड़ा तीर की दिशा में उंगलियों के साथ ब्लेड ठोको और एक दूसरे ठंडे ब्लेड के साथ अनुभाग धक्का । (I)कुछ वर्गों को उंगलियों और अंगूठे के बीच रेजर ब्लेड को थोड़ा गर्म करके हटाने की आवश्यकता हो सकती है और फिर दूसरे ठंडे ब्लेड के साथ जमे हुए अनुभाग को जल्दी से टुकड़ा करने की क्रिया कर सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्थलों और एलन माउस ब्रेन एटलस का उपयोग कर ROIs का निर्धारण । इस उदाहरण में, जमे हुए मस्तिष्क वर्गों दाईं ओर एलन माउस मस्तिष्क एटलस से इसी प्लेटों के साथ बाईं ओर हैं । ROIs (लाल बिंदीदार रूपरेखा) एलन माउस मस्तिष्क एटलस के लिए दृश्य स्थलों (काले आकार) की तुलना करके पहचाने जाते हैं । लैंडमार्क में शामिल हैं: एफए और सीसी, कॉर्पस कैलोसम, एसीओ, पूर्वकाल कॉमिसर, वीएल, पार्श्व वेंट्रिकल, वी 3, तीसरा वेंट्रिकल। उदाहरण आरओआई: पीएल/आईएल, प्रीलिम्बिक और इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स, एसीबी, नाभिक एक्यूबेन्स, एमओ, मोटर कॉर्टेक्स, सीपी, कौडोपुटामेन, एचपीएफ, हिप्पोकैम्पस/डेनटेट जाइरस । सही क्रेडिट पर कोरोनल एटलस छवियां: एलन संस्थान । छवियां प्लेटों से हैं 40, 44, 55 और 71 (ऊपर से नीचे) और https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas से प्राप्त किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विच्छेदन ROIs । (क)उन अनुभागों को संदंश का उपयोग करके संभाला जाता है जो सूखी बर्फ पर समय-समय पर ठंडा होते हैं। प्रत्येक खंड के दोनों पक्षों को विच्छेदन से पहले संबंधित एटलस छवियों के साथ तुलना की जानी चाहिए। (ख)आरओआई को ठंडे स्केलपेल या(सी)बायोप्सी पंच के साथ मस्तिष्क वर्गों से हटा दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: जमे हुए मस्तिष्क विच्छेदन विधि का उपयोग कर आरएनए और प्रोटीन का विश्लेषण। (क)गरीब बनाम अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए का उदाहरण। नमूना 1 के इलेक्ट्रोफोरेटिक जुदाई कमजोर 28S और 18S बैंड और 25 और २०० न्यूक्लियोटाइड्स (nt) के बीच गिरावट उत्पादों के साथ अवक्रमित आरएनए प्रदर्शित करता है । नमूना 2 मजबूत 28S और 18S बैंड और कम आणविक वजन पर थोड़ा संकेत के साथ अच्छी गुणवत्ता आरएनए से पता चलता है । आरएनए अखंडता संख्या नमूना 1, आरआईआर = 2.5 और नमूना 2, आरआईन = 8.6 के साथ इस अंतर को प्रतिबिंबित करते हैं। (ख)चूहों के ताजा विच्छेदित मध्यस्थ प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स बनाम जमे हुए से निकाले गए आरएनए की तुलना। विच्छेदन से पहले कई महीनों तक जमे हुए नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए थे। फसल के तुरंत बाद नए नमूनों पर कार्रवाई की गई । दोनों तरीकों का उपयोग कर एकत्र नमूनों से RIN मूल्यों उच्च रहे हैं, मजबूत 18S और 28S बैंड के साथ संकेत है कि नाभिक एसिड संरक्षित किया गया है । (सी, डी)एमपीएफसी को जमे हुए दिमाग से विच्छेदित किया गया था और आरएनए या प्रोटीन निकाला गया था । (ग)आरएनए विश्लेषण से पता चलता है कि उच्च आरआईएनएस और लिटिल क्षरण उत्पाद के साथ सभी बारह नमूनों के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त किए गए थे । (D)पश्चिमी दाग विश्लेषण कुल प्रोटीन पर किया गया था और उच्च आणविक वजन KCC2 आयन चैनल (लाल बैंड, MW = १३० केडीए) की उपस्थिति के लिए जांच की गई थी । KCC2 बैंड स्पष्ट रूप से कोई कम आणविक वजन टूटने उत्पादों के साथ दिखाई देरहा है मनाया । हाउसकीपिंग जीन, ऐक्टिन (ग्रीन बैंड, मेगावाट = 42 केडीए) भी दिखाया गया है। 12 दिमाग से एमपीएफसी के नमूने 1-12 लेबल हैं। डब्ल्यूबी पूरे मस्तिष्क नियंत्रण के लिए खड़ा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह काम न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के क्षरण को सीमित करते हुए मस्तिष्क के छोटे, विशिष्ट क्षेत्रों को अलग करने की तकनीक का वर्णन करता है। मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान एक जीव के मरने के बाद जल्दी होता है। यह आंशिक रूप से एक्सट्रासेलुलर ग्लूटामेट के तेजी से बिल्डअप और परिणामी एक्सीटोटॉक्सिसिटी के कारण होता है जो21होता है । मैसेंजर आरएनए विशेष रूप से22,23गिरावट की चपेट में है . प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड का टूटना कम तापमान पर बहुत कम हो जाता है जैसा कि हाल ही में 28,000 सालपहलेपर्माफ्रॉस्ट में जमे विशाल कोशिकाओं में जैविक गतिविधि का वर्णन करने वाले एक लेख का सबूत है ।

यहां वर्णित विधि के साथ, दिमाग स्नैप जमे हुए होते हैं और उपकरण और ऊतकों को ठंड से नीचे रखा जाता है जब तक कि न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन निष्कर्षण शुरू नहीं हो जाता है। फ्रोजन आरओआई को बफर में समरूप किया जाता है जिसमें प्रोटीज़ और न्यूक्लीज अवरोधक होते हैं, जो उच्च तापमान पर गिरावट से लक्ष्य अणुओं की रक्षा करते हैं ।

इस प्रक्रिया में, वर्गों के भीतर आरओआई को इंगित करने के लिए स्पष्ट स्थलों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। पूर्वकाल संयोजिका और कॉर्पस कैलोसम के फाइबर ट्रैक्ट इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, जैसा कि वेंट्रिकल्स करते हैं। हिप्पोकैम्पस के आकार में परिवर्तन के रूप में एक पीछे के लिए पूर्वकाल चालें भी इस्तेमाल किया जा सकता है । मैट्रिक्स में मस्तिष्क कितनी अच्छी तरह गठबंधन है, इसके आधार पर, स्थलों को विषम या लापता किया जा सकता है। इस तरह के वर्गों से ROIs इकट्ठा करने से पहले सावधानी बरती जानी चाहिए क्योंकि दूषित क्षेत्र नमूने में समाप्त हो सकते हैं। संग्रह से पहले, एक आरओआई अनुभाग के दोनों ओर जांच की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह पूरे अनुभाग में सुसंगत है। आरओआई का विच्छेदन मस्तिष्क के अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्रों तक सीमित है जो एक्स-वाई आयाम में लगभग 1 मिमी से अधिक हैं।

जब ROIs विच्छेदन, वहां उंहें भी भंगुर बनाने के बिना ऊतकों जमे हुए रखने की जरूरत है । ऊतक जो बहुत ठंडा होता है, जब दबाव को पंच या स्केलपेल के साथ लागू किया जाता है तो फ्रैक्चर हो जाएगा। ब्याज के क्षेत्र में अक्सर अंय टुकड़ों से पहचान करने के लिए मुश्किल है जब ऐसा होता है । इसे कम करने का एक तरीका यह है कि वर्गों को प्लेट के गर्म क्षेत्र (सूखी बर्फ से दूर) में ले जाया जाए। ग्लास प्लेट को साफ रखना भी जरूरी है। एक बार एक अनुभाग संसाधित किया जाता है, प्लेट अगले पर जाने से पहले एक रेजर ब्लेड के साथ साफ स्क्रैप किया जाना चाहिए । समय के साथ, पानी हवा से विच्छेदन प्लेट पर गाढ़ा होगा जो नमूना मान्यता को कवर या अन्यथा हस्तक्षेप कर सकता है। प्लेट की सफाई कांच की सतह के पार एक रेजर ब्लेड के तेज किनारे को स्क्रैप करके और एकत्र ठंढ और मलबे को पोंछते हुए की जाती है। छोटे आरओआई अवांछित मस्तिष्क के टुकड़ों से अविवेच्य हो जाते हैं इसलिए एक स्वच्छ कार्य क्षेत्र बनाए रखना बहुत महत्वपूर्ण है।

कई प्रयोगशालाओं काटा ऊतकों में आरएनए की रक्षा के लिए 25 वाणिज्यिकउत्पादों का उपयोग करें । जबकि लेसिल अणुओं को इस तरह से अच्छी तरह से संरक्षित किया जाता है, एक दोष यह है कि ऊतक की आकृति विज्ञान मौलिक रूप से बदल जाता है। नतीजतन, संदर्भ मानचित्रों का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्रों को ढूंढना मुश्किल हो सकता है। इन उत्पादों का उपयोग करने से पहले स्नैप-फ्रोजन दिमाग से ROIs विच्छेदन इसलिए एक बेहतर विकल्प हो सकता है ।

हालांकि हमने इस काम में कोरोनल स्लाइस पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन इस विधि को क्षितिज और सजीटल वर्गों के लिए अच्छी तरह से काम करना चाहिए। इन झुकाव के लिए नक्शे आम तौर पर कोरोनल वर्गों के लिए उन लोगों की तुलना में संकल्प में कम कर रहे हैं । हालांकि, यह एलन ब्रेन इंस्टीट्यूट जैसे समूहों से पहल के साथ तेजी से बदल रहा है । एक और विचार फसल में जानवर की उम्र है। युवा पशु दिमाग की आकृति विज्ञान वयस्क से बहुत अलग है और एक विशेष एटलस और एक अलग आकार मस्तिष्क मैट्रिक्स की आवश्यकता होगी। विकासशील माउस ब्रेन एटलस26 जैसे संसाधन छोटे चूहों से सटीक मस्तिष्क के नमूने एकत्र करने में आवश्यक हैं।

यह काम एक प्रक्रिया का वर्णन करता है जिसका उपयोग कृंतक मस्तिष्क के भीतर से छोटे क्षेत्रों को फसल करने के लिए किया जा सकता है। वर्गों की आकृति विज्ञान अच्छी तरह से जमे हुए टुकड़ा करने की क्रिया के साथ संरक्षित है, और ऊतकों के रूप में फसल से निष्कर्षण के लिए जमे हुए रखा जाता है, नाभिक एसिड और प्रोटीन की गुणवत्ता अधिक है । इस प्रक्रिया को ताजा एकत्र ऊतक के विच्छेदन पर लाभ है क्योंकि जानवरों के एक बड़े समूह से नमूना दिमाग को जल्दी से एकत्र और संग्रहीत किया जा सकता है। दिमाग के भीतर क्षेत्रों तो आम मस्तिष्क एटलस में पहचान स्थलों का उपयोग कर की पहचान की जा सकती है और लक्ष्य अणुओं को खोने के बिना एक सावधान गति से एकत्र । यह विधि कुछ प्रयोगशालाओं के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है क्योंकि आवश्यक उपकरण और रीजेंट सस्ती और आसानी से उपलब्ध हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच, डीए043982 और डीए046196 ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938		 Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

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References

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Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

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