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Neuroscience

다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

이 절차는 저렴하고 일반적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 고품질의 단백질과 RNA를 얻기 위해 이산 냉동 뇌 영역의 수집을 설명합니다.

Abstract

신경생물학에 대한 우리의 이해가 진행됨에 따라, 분자 분석은 종종 내측 전두엽 피질 (mPFC) 또는 핵 accumbens와 같은 작은 두뇌 지역에 실행됩니다. 이 작업의 과제는 검사할 미세 환경을 유지하면서 올바른 영역을 해부하는 것입니다. 이 백서에서는 대부분의 랩에서 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 이 방법은 과정을 통해 동결 조직을 유지하여 핵산과 단백질을 보존합니다. 뇌는 뇌 매트릭스를 사용하여 0.5-1.0 mm 섹션으로 절단되고 냉동 유리 판에 배열됩니다. 각 섹션 내의 랜드마크는 알렌 마우스 브레인 아틀라스와 같은 참조와 비교되며, 지역은 차가운 메스 또는 생검 펀치를 사용하여 해부됩니다. 그런 다음 조직을 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 이 과정을 통해 쥐 및 마우스 mPFC, 핵 accumbens, 등쪽 및 복부 해마 및 그밖 지구는 qRT-PCR 및 서양 분석학을 사용하여 성공적으로 분석되었습니다. 이 방법은 명확한 랜드 마크에 의해 식별 될 수있는 뇌 영역으로 제한됩니다.

Introduction

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이 연구는 알렌 마우스 브레인 아틀라스1과같은 참조를 사용하여 고품질의 핵산 또는 단백질을 추출하기 위한 냉동 뇌 영역의 해부를 가이드로 보여줍니다. 이 기술에서, 뇌는 플래시 냉동 및 동결 된 상태에서 유지되는 동안 나중에 단면및 해부를 위해 -80 °C에서 저장됩니다. 이 과정을 통해 연구원은 한 세션에서 많은 수의 뇌를 수확하고 나중에 여러 뇌 영역의 정확한 수집을 위해 해부 할 수 있습니다.

유전자 및 단백질 발현과 관련된 질문에 답할 때 관심 있는 뇌 영역(ROI)의 정확한 수집이 종종 필요합니다. 약리학, 전기 생리학 및 광유전학은 관찰된 행동2,,3,,4를뒷받침하는 분자 변화를 해명하는 것을 돕기 위하여 야생형 또는 유전자 변형 설치류에 사용될 수 있는 동안, 전사체 및 단백질에 있는 유도한 변경의 측정은 수시로 이 사실 인정을 지원하기 위하여 이용됩니다. 정량적 역전사 중합체 연쇄 반응(RT-qPCR), 서부 블로팅, RNAseq5,MAPSeq6 및 HPLC7과 같은 기술은 견고하고 상대적으로 비용이 저렴하여 많은 실험실이 작은 뇌 영역2,,4,,5,,6내에서 유도된 분자 변화를 연구할 수 있도록 합니다.

뇌 영역에서 핵산 또는 단백질을 추출하고 정제하는 방법에는 여러 가지가 있다8,,9,10,,911,,12. 많은 실험실은 수확9,,13의시간에 얼음에 뇌를 냉각하고 절단하여 뇌 영역을 수확 . 이러한 접근법은 고품질 의 핵산 및 단백질을 초래할 수 있지만, 조직의 미세 환경 내의 분해가 이들 온도에서 일어날 수 있기 때문에 다소 시간 제한적이다. 이것은 한 자리에 많은 수의 동물 이나 ROI를 해부 하려고 할 때 특히 사실 일 수 있습니다. 샘플을 동결상태로 유지하는 것은 비교적 순수한 샘플을 수집하기 위한 노력의 일환으로 각 섹션의 양쪽에 있는 랜드마크를 신중하게 비교할 수 있는 연구자의 시간을 제공하면서 비순한 표적 분자를 유지하는 데 도움이 됩니다. 레이저 포획은 뇌 영역에서 RNA 또는 단백질 분석을 위한 조직을 수집하는 또 다른 방법10. 이 절차는 매우 작고 불규칙한 모양의 ROI가 식별되고 분리될 수 있다는 점에서 기계적 해부보다 우수하다. 그러나, 레이저 포획은 고가의 장비 및 시약의 사용에 의해 제한되며, 시간이 많이 소요되며 또한 시료 열화에 더 취약할 수 있다.

냉동 된 조직에 마이크로 펀치 해부는 새로운 것이 아닙니다. 미클로스 팔코비트와 다른 사람에 의해 초기 논문은 세부사항 14,,15의기본 기술을 설명합니다 . 이 프레젠테이션은 주로 효율성을 용이하게하고 필요한 장비의 비용을 줄이기 위해 몇 가지 개선과 함께, 원래의 작업을 다음과 같습니다. 예를 들어, 뇌 섹션은 저온 저온 이기보다는 얼어 붙은 뇌 블록에서 만들어집니다. 이렇게 하면 ROI 샘플을 수집하는 데 필요한 섹션 수가 줄어듭니다. 이 방법은 또한 절연 된 상자 내에서 드라이 아이스에 앉아 냉동 유리 판에 샘플을 해부. 이것은 작동할 벤치에서 서브 동결 단계를 생성합니다. 이러한 방식으로 해부된 섹션은 쉽게 조작할 수 있으므로 연구원은 원하는 ROI 외부 영역의 오염을 제한하기 위해 각 섹션의 양쪽을 참조와 비교할 수 있습니다.

이 프로토콜의 장점은 1) 뇌가 과정 전반에 걸쳐 동결 된 상태로 유지되어 단백질과 핵산을 보존하고 연구원에게 ROI를 신중하게 수확할 시간을 주며 2) 필요한 시약이 저렴하고 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견된다는 것입니다. 이 과정에서 전체 뇌는 뇌 매트릭스에서 0.5-1.0 mm로 단면화되고 드라이 아이스로 지속적으로 냉각되는 냉동 유리 판에 놓입니다. 알렌 브레인 아틀라스에서 발견 된 랜드 마크1 또는 다른 뇌 지도판16,,17 관심 영역을 식별하는 데 사용됩니다, 다음 차가운 펀치 또는 메스중 하나를 사용하여 해부되는. 조직이 결코 해동되지 않았기 때문에, 이러한 방식으로 수확된 부위는 다운스트림 분석을 위한 고품질 RNA 및 단백질을 제공한다.

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Protocol

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이 연구에서 사용된 동물은 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 국립 보건원 (NIH) 지침에 의해 명시된 대로 윤리적이고 인도적인 방식으로 취급되었습니다.

참고: 모든 공구와 표면은 작업을 시작하기 전에 뉴클레아제18을 제거하기 위해 적절한 용매로 세척해야 합니다.

1. 뇌 저장

  1. 안락사된 성인 CD1 야생형 마우스로부터 뇌를 빠르게 제거하고, 기존의 접근법13을 이용하여 약 30 g의 무게를 가진 액체 질소 또는 드라이 아이스로 미리 냉각된 이소펜탄에서 60초 동안 플래시 동결한다.
  2. 냉동 된 뇌를 알루미늄 호일 이나 원유관에 -80 °C에서 사용할 때까지 보관하십시오.

2. 뇌 매트릭스 준비

  1. 조직을 해부하기 24 시간 전에 깨끗한 뇌 매트릭스 (재료 표참조)를 해동 된 냉동고 팩 위에 놓습니다. 두 개의 냉동고 팩 사이에 매트릭스의 측면을 끼워 면도기 슬롯의 바닥과 젤 팩의 상단 사이에 약 0.5 cm를 두십시오(그림 1A). 알루미늄 호일을 끝에 놓아 냉각을 돕습니다.
    참고 : 뇌 매트릭스를 구입할 때, 해부 될 뇌의 전체 볼륨을 감싸기에 충분히 큰 하나를 구입.
  2. 뇌 매트릭스와 냉동고 팩이 들어 있는 상자를 -20°C 냉동실에 놓고 밤새 상단 ajar를 넣습니다.

3. 냉동 유리 판 설치

참고 :이 설정의 목적은 뇌 섹션을 해부하는 동결 표면을 준비하는 것입니다.

  1. 얼음을 상단에서 약 5cm까지 절연 된 상자에 놓습니다. 그런 다음 2.5 cm 의 드라이 아이스 층을 얼음 위에 놓고 검은 색 플라스틱 시트로 덮어 샘플을 시각화하는 데 도움이됩니다(그림 1B, 그림 1C).
  2. 플라스틱 위에 유리 판(상자 개구부에 꼭 맞아야 함)을 놓고 멀리 구석에 있는 판 위에 드라이 아이스를 놓습니다(그림1C).
  3. 냉동고에서 얼어 붙은 뇌 매트릭스를 가지고 피질 쪽을 위로 절단할 뇌를 삽입합니다. 10 분 동안 상자의 온도에 평형을 유지하십시오.
  4. 시상 부비동과 횡부비동이 블록의 수직 홈과 정렬되도록 차가운 집게로 매트릭스에서 뇌의 위치를 조정합니다(그림 1D). 이렇게 하면 대칭 섹션이 쉽게 해부를 할 수 있습니다. 뇌를 조정하기 전에 잠시 얼음을 건조 하는 집게의 터치 팁.
  5. 뇌가 제자리에 있으면 차가운 면도날을 중앙 근처에 놓고 블레이드를 약 1mm 를 조직에 밀어 넣습니다. 로스트랄 과 꼬리 끝에 차가운 블레이드를 추가하여 뇌를 제자리에 고정시키세요(그림2A그림 2B).
  6. 로스트랄 끝에서 시작하여 블레이드를 한 번에 하나씩 추가하여 슬롯에 넣고 약 1mm(그림 2B)를조직으로 부드럽게 누릅니다. 1mm 간격으로 칼날을 계속 추가하여 꼬리 끝을 향해 작업합니다.
  7. 이 시간 동안 뇌가 움직이지 않도록 하십시오. 블레이드를 수평 및 수직으로정렬합니다(그림 2B). 단면을 0.5mm 폭으로 자르기 위해 로우 프로파일 마이크로톤 블레이드(재료 표참조)를 사용할 수 있습니다. 더 큰 면도날 사이에놓습니다(그림 2C).
  8. 블레이드가 제자리에 있으면 손가락, 손바닥 또는 다른 평평한 표면으로 그룹 상단을 누릅니다(그림 2C, 그림 2D). 블레이드 그룹을 좌우로 천천히 흔들어 조직을 통해 이동합니다.
    참고 : 이것은 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다 (1-2 분) 인내심이 필요합니다. 조직을 통해 이동하는 블레이드에 대한 저항이 있어야합니다. 쉬운 항목은 뇌가 해동되고 블록을 드라이 아이스로 냉각해야한다는 것을 의미합니다.
  9. 모든 블레이드가 슬롯의 바닥에 도달하면 블레이드 그룹의 각 측면을 잡고 앞뒤로 흔들어 매트릭스에서 자유롭게 작동합니다.
    참고: 칼날의 날카로운 모서리에 자르지 않도록 주의하십시오.
  10. 그룹이 자유로워지면 스택, 로스트랄 측면을 유리 판 위에 놓습니다(그림2E). 드라이 아이스를 스택 옆 또는 위에 놓아 시료를 더 얼려서 쉽게 분리할 수 있습니다.
  11. 유리 판에 날카로운 모서리가 있는 스택을 놓고 엄지손가락과 손가락 사이로 스택을 이동하여 블레이드를 분리합니다. 블레이드는 단면이 부착되어 서로 분리되어야 합니다.
  12. 로스트랄에서 카우달까지 유리판에 섹션을정렬합니다(그림 2F).
  13. 손가락 사이에 블레이드를 구부리거나 두 번째 차가운 면도기로 분리하여 블레이드에서 조직을 분리하십시오(그림 2G, 2H,2I).

4. 섹션 해부

  1. 알렌 마우스 브레인 아틀라스 또는 다른 참조를 열고 관심 영역을 식별하는 데 필요한 랜드 마크를 찾을 수 있습니다. 몇몇 명백한 랜드마크는 전방 커미션, 코퍼스 callosum, 측심실 및 해마를 포함합니다(그림 3).
  2. 차가운 집게로 절단할 섹션을 뒤집고 수집할 영역이 섹션 전체에서 일관되도록 합니다. 수확 하는 동안, 정확한 ROI를 얻을 수 있는지 확인 하려면 자주 참조 지도 서 를 참조 하십시오.
    참고: 돋보기 또는 해부 현미경은 종종이 과정에서 도움이됩니다. 좋은 조명도 필수적입니다. 낮은 와트 LED 램프 또는 시원한 램프 (재료 표참조)는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.
  3. 깨끗한 메스 또는 펀치로 섹션으로 잘라냅니다(그림 4). 얼음을 건조하기 위해 짧게 터치하여 절단하기 전에 각 도구를 미리 냉각. 블레이드를 부드럽게 밀어 단단히 티슈에 밀어 넣고 앞뒤로 흔들어 잘라냅니다. 너무 세게 밀거나 조직이 골절되지 마십시오.
    참고: 도구는 시간이 지남에 따라 따뜻해집니다. 약간 따뜻하게 한 블레이드는 깨끗한 상처를 만드는 데 도움이 될 수 있으며 골절을 제한 할 수 있지만 조직의 해동을 피하십시오. 드라이 아이스에 정기적으로 도구를 식힙니다.
  4. ROI가 수확되면, 라벨이 부착된 1.5mL 튜브에 넣습니다. 수확한 티슈를 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
  5. 이러한 방식으로 수집된 냉동 조직을 차가운 RIPA 버퍼(50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS 및 단백질 억제제 칵테일(재료표 참조)) 단백질 추출을 위한, 또는 구니디늄 함유 용매(재료 Table of Materials 참조)는 RNA 추출을 위한 동결된 시료로 추출하고 즉시 유리 Dounce 또는 기계적 호모겐 을 사용하여 균질화한다. Table of Materials 이런 식으로, 단백질및 뉴클레아제 억제제는 견본이 분해에서 단백질 과 핵산을 보호하기 위하여 온난으로 제자리에 있습니다.

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Representative Results

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이 방법을 검증하기 위해, 내측 전두엽 피질을 성인 CD1 야생형 수컷 마우스 및 RNA로부터 수집하여 추출하고 특징화하였다. RNA는 모세관 전기동에 의해 분석되었다. 분해된 RNA는 28S 및 18S 리보좀 밴드의 강도에서 손실을 나타내고 또한 25 및 200 뉴클레오티드 사이의 얼룩으로서 분해 생성물을나타낸다(그림 5A,샘플 1). 고품질 RNA는 낮은 분자량 영역에서 신호가 거의 또는 전혀 없는 뚜렷한 리보좀 밴드를나타낸다(도 5A,샘플 2). RNA 무결성 번호(Rin)도 이 분석에서 생성됩니다. 7 이상의 RIN은 양질의 RNA19를나타냅니다. 동결해부 방법을 이용한 시료로부터 분리된 RNA는 신선하게 수확된 조직으로부터 제조된 RNA와 매우 유리하게 비교되는 강한 리보좀 밴딩 및 높은 RIN 값을 표시한다(도5B).

이 방법의 한 가지 장점은 많은 수의 두뇌를 신속하게 수확하고 나중에 신중하게 해부할 수있는 한 좌석에 보관 할 수 있다는 것입니다. ROI는 또한 조직이 해동되지 않고 저장될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 연구원은 고품질 핵산 또는 단백질을 얻을 수있는 크고 다양한 ROI 컬렉션을 수집 할 수 있습니다. 이 점을 확인하기 위해 RNA는 몇 주에 걸쳐 저장되었던 해부 된 mPFC에서 추출되었습니다 (수확 된 뇌는 몇 달 동안 저장되었습니다). 모든 샘플은8(그림 5C)이상의 뚜렷한 리보좀 밴딩 및 Rin을 가진 고품질 RNA를 생성하였다.

웨스턴 블롯 분석은 앞서 설명한 바와 같이 동결해mPFC의 단백질 무결성을 확인하기 위해20. 서양 얼룩은 단백질이 분해될 때 고분자량 표적의 감소된 신호를 표시합니다. 분해 제품은 또한 컬럼 내의 낮은 분자량에서 얼룩으로 표시됩니다. 이러한 분석을 위해 단백질을 수집, 니트로셀룰로오스로 옮기고, 고분자량 표적, KCC2 및 저분자 단백질, 액틴(그림5D)에대하여 항체로 프로브하였다. 모든 경우에, 밴드는 KCC2 또는 액틴 중 하나에 대한 식별 고장 제품없이 날카롭고 구별했다. 이러한 실험은 이 방법을 사용하여 ROI의 해부가 고품질 RNA 및 단백질의 추출을 가능하게 한다는 것을 확인한다.

Figure 1
그림 1: 고정된 작업 곡면 준비. (A)뇌 블록은 절연 상자 내에서 젤 팩의 스택에 배치하고 두 개의 추가 젤 팩 사이에 끼워. 알루미늄 호일은 절편 중에 냉각을 용이하게하기 위해 블록의 각 끝에 포장됩니다. 상자를 -20°C에서 밤새 냉각시켰다. (B)유리 판은 절연 상자의 개구부와 크기에 맞게 일치합니다. 이 목적을 위해 배송 상자를 사용할 수 있습니다. 얼음은 위에서 약 5cm가 될 때까지 상자에 추가됩니다. 그런 다음 상자를 -20°C에서 밤새 동결합니다. (B, C) 조직을 수집하기 직전에, 드라이 아이스의 균일 한 층은 약 2.5cm의 깊이에서 얼음 위에 배치됩니다. 검은 색 플라스틱 시트 (시각화를 돕기 위해)가 드라이 아이스 위에 놓여진 다음 유리 판이 있습니다. 드라이 아이스는 접시 바로 위의 공기를 냉각 멀리 모서리에 배치됩니다. 도구는 접시에 누워, 또는 잠시 드라이 아이스에 터치하여 냉각 될 수있다. (D)대칭 섹션을 보장하기 위해, 뇌는 시상 부비동과 횡부비동블록의 수직 홈 (흰색 화살표)와 정렬되도록 차가운 집게로 배치되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 뇌 블록을 사용하여 뇌를 절제합니다. (A)뇌의 방향은 약 1mm의 깊이에서 피질에 기존의 단일 가장자리 면도날을 앉아서 고정됩니다. (B)모든 슬롯이 채워지도록 블레이드를 한 번에 하나씩 추가합니다. (C)0.5mm 단면도가 원할 때 기존 블레이드 사이에 로우 프로파일 블레이드를 삽입할 수 있습니다(빨간색 화살표). (C, D) 블레이드 그룹은 평평한 악기 또는 손바닥이나 손바닥이나 손가락을 사용하여 적당한 하향 압력으로 얼어 붙은 조직으로 밀어 넣습니다. 블레이드는 조직을 통해 그들을 이동하는 데 도움이 앞뒤로 천천히 흔들 수 있습니다. (E)면도날의 측면을 잡고 흔들리는 움직임과 단단한 상향 압력을 사용하여 섹션을 제거합니다 (주의 : 칼날의 날카로운 끝을 피하십시오). 그룹을 블록에서 들어 올려 냉동 유리 판에 앞쪽으로 놓습니다. 분리하기 전에 블레이드 에 인접한 드라이 아이스를 사용하여 섹션을 완전히 식힙니다. (F)블레이드를 분리하고 섹션을 순서대로 배치합니다. (G, H) 화살표 방향으로 손가락으로 블레이드를 약간 구부리고 두 번째 콜드 블레이드로 섹션을 밀어 내면 면도날에서 섹션을 제거 할 수 있습니다. (I)일부 섹션은 손가락과 엄지 손가락 사이에 면도날을 약간 따뜻하게 한 다음 두 번째 콜드 블레이드로 냉동 부분을 빠르게 잘라내어 제거해야 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 랜드마크와 앨런 마우스 브레인 아틀라스를 사용하여 ROI를 결정합니다. 이 예에서, 얼어 붙은 뇌 섹션은 오른쪽에 앨런 마우스 뇌 아틀라스에서 해당 플레이트와 왼쪽에 있습니다. ROI(빨간색 점선 윤곽선)는 눈에 보이는 랜드마크(검은색 모양)와 앨런 마우스 브레인 아틀라스를 비교하여 식별됩니다. 랜드마크는 다음과 같습니다: fa 및 cc, 코퍼스 캘로섬, 아코, 전방 코미서, VL, 측심실, V3, 제3 벤틸. 예 ROIs: Pl/Il, 전향및 인프레시브 피질, ACB, 핵 accumbens, MO, 모터 피질, CP, caudoputamen, HPF, 해마/덴테이트 자이러스. 오른쪽 신용에 코로날 아틀라스 이미지: 앨런 연구소. 이미지는 플레이트 40, 44, 55 및 71(위에서 아래로)으로부터 얻어졌으며 https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: ROI 해부. (A)구간은 드라이 아이스에서 주기적으로 냉각되는 집게를 사용하여 처리됩니다. 각 섹션의 양쪽은 해부 전에 해당 아틀라스 이미지와 비교되어야한다. (B)ROI는 차가운 메스 또는(C)생검 펀치로 뇌 섹션에서 제거됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 동결된 뇌 해부 방법을 사용한 RNA 및 단백질 분석. (A)좋은 품질의 RNA대 불량의 예. 샘플 1의 전기 적 분리는 약한 28S 및 18S 대역과 25 및 200 뉴클레오티드 (nt) 사이의 열화 생성물을 가진 분해 된 RNA를 표시합니다. 샘플 2는 강한 28S 및 18S 대역과 낮은 분자량에서 작은 신호와 좋은 품질의 RNA를 보여줍니다. RNA 무결성 수치는 샘플 1, RIN = 2.5 및 샘플 2, RIN = 8.6과 이러한 차이를 반영합니다. (B)생쥐의 냉동 에서 추출된 RNA의 비교와 새로 해부된 내측 전두엽 피질을 비교하였다. 냉동 시료를 해부 하기 전에 몇 달 동안 -80°C에서 보관하였다. 신선한 샘플은 수확 직후에 처리되었습니다. 두 방법을 사용하여 수집된 샘플의 RIN 값은 핵산이 보존되었음을 나타내는 강력한 18S 및 28S 대역과 함께 높다. (C, D)mPFC를 동결된 뇌로부터 해부하고 RNA 또는 단백질을 추출하였다. (C)RNA 분석은 높은 RIN 및 거의 분해 산물관찰을 가진 모든 12개의 샘플에 대해 양질의 RNA를 수득하였다는 것을 나타낸다. (D)웨스턴 블롯 분석은 총 단백질에 대해 수행되었고 고분자량 KCC2 이온 채널(적색 대역, MW= 130 kDa)의 존재를 조사하였다. KCC2 밴드는 더 낮은 분자량 분해 제품이 관찰되지 않고 명확하게 볼 수 있습니다. 하우스키핑 유전자, 액틴(녹색 밴드, MW = 42 kDa)도 도시된다. 12개의 두뇌에서 mPFC 견본은 1-12표지됩니다. WB는 전체 뇌 제어를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 작품은 핵산과 단백질의 분해를 제한하면서 뇌의 작은 특정 영역을 분리하는 기술을 설명합니다. 뇌 조직의 손상은 유기체가 죽으면 빠르게 발생합니다. 이것은 부분적으로 세포 외 글루타민산염의 급속한 축적과21발생하는흥분독성에 기인한다. 메신저 RNA는 특히저하에 취약하다 22,,23. 단백질과 핵산의 분해는24년전 28,000년 전에 퍼머프로스트에서 동결된 매머드 세포의 생물학적 활성을 설명하는 최근 논문에서 입증된 바와 같이 저온에서 크게 감소된다.

본 원에 기재된 방법을 통해, 뇌는 스냅 냉동되고 도구와 조직은 핵산 또는 단백질 추출이 시작될 때까지 동결 아래에 보관됩니다. 냉동 ROI는 프로테아제 및 뉴클레아제 억제제가 함유된 완충액에서 균질화되어 더 높은 온도에서 표적 분자를 분해하지 못하도록 보호합니다.

이 과정에서 섹션 내에서 ROI를 정확히 파악하기 위해 명확한 랜드마크를 식별하는 것이 중요합니다. 전방 커밋과 코퍼스 callosum의 섬유 지역은 심실과 마찬가지로이 목적을 위해 잘 작동합니다. 해마의 모양의 변화는 후방으로 전방으로 이동함에 따라 또한 사용될 수 있다. 뇌가 매트릭스에서 얼마나 잘 정렬되는지에 따라 랜드마크가 왜곡되거나 누락될 수 있습니다. 오염 지역이 샘플에서 끝날 수 있기 때문에 이와 같은 섹션에서 ROI를 수집하기 전에 주의해야 합니다. 수집하기 전에 섹션의 양쪽에서 ROI를 확인하여 섹션 전체에서 ROI가 일치하는지 확인해야 합니다. ROI의 해부는 x-y 차원에서 약 1 mm보다 큰 뇌의 잘 정의된 영역으로 제한됩니다.

ROI를 해부할 때 조직을 너무 부서지기 쉬지 않고 동결시켜야 합니다. 너무 차가운 조직은 펀치 나 메스로 압력을 가할 때 골절됩니다. 이러한 경우 관심 영역은 다른 조각에서 식별하기가 어려운 경우가 많습니다. 이를 완화하는 한 가지 방법은 단면을 드라이 아이스에서 멀리 떨어진 판의 따뜻한 영역으로 간단히 이동하는 것입니다. 유리 판을 깨끗하게 유지하는 것도 중요합니다. 단면이 처리되면 다음 단계로 이동하기 전에 면도날로 플레이트를 깨끗하게 긁어야 합니다. 시간이 지남에 따라 물은 공기 중의 해부 판에 응축되어 샘플 인식을 덮거나 방해할 수 있습니다. 플레이트 청소는 유리 표면을 가로 질러 면도날의 날카로운 가장자리를 긁어 내고 수집 된 서리와 파편을 닦아냅니다. 작은 ROI는 원치 않는 뇌 조각과 구별되지 않으므로 깨끗한 작업 영역을 유지하는 것이 매우 중요합니다.

많은 실험실은 수확 된 조직에서 RNA를 보호하기 위해 상업용 제품25를 사용합니다. 음순 분자는 이 방법으로 잘 보존되는 동안, 한 가지 단점은 조직의 형태가 근본적으로 변화된다는 것입니다. 따라서 참조 맵을 사용하여 관심 영역을 찾기어려울 수 있습니다. 따라서 이러한 제품을 사용 하기 전에 스냅 냉동 된 두뇌에서 ROI를 해부 하는 것이 좋습니다.

우리는이 작품에서 관상 조각에 초점을 맞추고 있지만,이 방법은 수평선 및 시상 섹션에 잘 작동해야합니다. 이러한 방향에 대한 맵은 일반적으로 코로나 섹션에 비해 해상도가 낮습니다. 그러나, 이것은 알렌 두뇌 연구소 와 같은 그룹에서 이니셔티브와 함께 급속 하 게 변화. 또 다른 고려 사항은 수확시 동물의 나이입니다. 젊은 동물 두뇌의 형태는 성인의 형태와 매우 다르며 전문 적인 아틀라스와 다른 크기의 뇌 매트릭스가 필요합니다. 개발 마우스 뇌 아틀라스 같은 리소스26 젊은 쥐에서 정확한 두뇌 샘플을 수집에 필수적이다.

이 작품은 설치류 뇌 내에서 작은 영역을 수확하는 데 사용할 수있는 프로세스를 설명합니다. 단면의 형태는 냉동 슬라이스로 잘 보존되며, 조직이 수확에서 추출까지 냉동 보관되기 때문에 핵산과 단백질의 품질이 높습니다. 이러한 과정은 많은 동물군으로부터 의한 샘플 뇌가 신속하게 수집 및 저장될 수 있기 때문에 갓 채취한 조직의 해부에 비해 장점이 있다. 두뇌 내의 지구는 그 때 일반적인 두뇌 지도틀에서 확인된 랜드마크를 사용하여 확인되고 표적 분자를 분실하지 않고 주의깊은 속도로 집합될 수 있습니다. 이 방법은 필요한 도구와 섭정을 저렴하고 쉽게 사용할 수 있기 때문에 일부 실험실에 좋은 옵션이 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작업은 NIH, DA043982 및 DA046196에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

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References

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다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음
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Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

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