Summary
Forhøjede spinal Fluid protein niveauer kan enten være resultatet af diffusion af plasmaprotein på tværs af en ændret blod-hjerne barriere eller Intratekal syntese. En optimeret testprotokol er præsenteret i denne artikel, der hjælper med at diskriminere begge tilfælde og giver kvantitative målinger af intratekalt syntetiserede proteiner.
Abstract
Cerebrospinalvæske (CSF), en væske, der findes i hjernen og rygmarven, er af stor betydning for både grundlæggende og klinisk videnskab. Analysen af CSF protein sammensætning leverer afgørende oplysninger i grundlæggende neurovidenskab forskning samt neurologiske sygdomme. En advarsel er, at proteiner målt i CSF kan stamme fra både Intratekal syntese og transudation fra serum, og proteinanalyse af CSF kan kun bestemme summen af disse to komponenter. At skelne mellem protein transudation fra blodet og intrathecalt producerede proteiner i dyremodeller såvel som hos mennesker CSF protein profilering målinger ved hjælp af konventionelle proteinanalyse værktøjer skal omfatte beregning af albumin CSF/serum kvotient (Qalbumin), en markør for integriteten af blod-hjerne-grænsefladen (BBI), og protein indekset (qprotein/qalbumin), et estimat af Intratekal proteinsyntese. Denne protokol illustrerer hele proceduren, fra CSF og blodindsamling til kvotienter og indekser beregninger, til kvantitativ måling af Intratekal proteinsyntese og BBI svækkelse i musemodeller af neurologiske lidelser.
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF), en klar og farveløs væske omkring hjernen og rygmarven, besidder stor klinisk og grundlæggende videnskabelig betydning. CSF bevarer det elektrolytiske miljø i centralnervesystemet (CNS), afbalancerer systemisk syre-base status, leverer næringsstoffer til neuronal og gliaceller celler, fungerer som et lymfesystem for CNS, og transporterer hormoner, neurotransmittere, cytokiner og andre neuropeptider i hele CNS1. Således, som CSF sammensætningen afspejler aktiviteten af CNS, denne væske tilbyder en værdifuld, men indirekte, adgang til at karakterisere den fysiologiske og patologiske tilstand af CNS.
CSF er blevet brugt til at diagnosticere forhold, der påvirker CNS i over hundrede år, og for det meste af denne tid, det blev primært undersøgt af klinikere som et diagnostisk værktøj. Men, i de seneste år Neuro biologer har erkendt potentialet i CSF for at studere Patofysiologi af CNS. Især er der blevet introduceret adskillige proteinanalyse værktøjer med høj kapacitet i neurovidenskabens rige, som giver mulighed for en detaljeret undersøgelse af EFSR'S protein sammensætning med forventning om, at denne analyse kan bidrage til at give indsigt i de dynamiske ændringer opstår inden for CNS.
Teknologisk udvikling i multiplex immunassay teknikker som Luminex og Simoa Technologies2,3, giverforskerne i dag mulighed for at detektere hundredvis af proteiner ved meget lave koncentrationer. Desuden gør de samme teknologier det muligt at anvende små stikprøve mængder, hvilket fremmer undersøgelser af små dyr, herunder mus, hvor begrænsede prøvevolumener af CSF har forhindret detaljerede beskrivelser af væsken indtil for nylig.
Ikke desto mindre er en advarsel, at proteiner målt i CSF kan stamme fra intratalsyntese og/eller transudation fra serum på grund af en beskadiget blod-hjerne grænseflade (BBI). Desværre, proteinanalyse af CSF alene kan kun bestemme summen af disse to komponenter. For at skelne mellem transudat og intrathecalt producerede proteiner skal CSF-protein målinger ved hjælp af et tilgængeligt proteinanalyse værktøj justeres for individuel variation i serumkoncentrationer samt barriere integritet. Men selv om denne justering er almindeligt anvendt i klinisk praksis, f. eks, CSF IgG indeks, som har høj følsomhed for påvisning Intratekal IgG syntese4,5,6, til dato meget få undersøgelser har korrigeret CSF proteinkoncentrationer for serumkoncentration og barriere integritet7,8.
I øjeblikket reibergram tilgang er den bedste måde at bestemme barriere funktion og Intratekal syntese af proteiner. Det er en grafisk evaluering i CSF/serum kvotient diagrammer, som analyserer, på en integreret måde, både barriere (dys) funktion og Intratekal proteinsyntese, der refererer til en udelukkende blod-afledte protein9,10. Det meget rigelige protein albumin er normalt valgt som referenceprotein, fordi det kun produceres i leveren, og fordi dets størrelse, ca. 70 kDa, er mellemliggende mellem små og store proteiner11. Analysediagrammet blev først defineret af Reiber og Felgenhauer i 1987 for de store klasser af immunglobuliner (IGS)11, der er empirisk baseret på resultaterne fra analysen af tusinder af humane prøver9. Tilgangen blev efterfølgende bekræftet af anvendelsen af de to Fick's diffusions lovgivning i teorien om Molekylær diffusion/strømningshastighed12. En sådan teori demonstrerer diffusion af et protein gennem barrieren har en hyperbolske fordeling og kan kvantitativt forklare dynamikken i proteiner i CNS9,13. Samlet, fordelen ved at bruge reibergram til påvisning Intratekal proteinsyntese er, at det samtidig identificerer proteinfraktionen, der kommer ind i CSF fra serum samt mængden af protein fundet i CSF på grund af lokal produktion.
Denne artikel og den tilhørende protokol beskriver hele proceduren, fra CSF og blod opsamling til de endelige beregninger korrigere CSF protein niveauer, for den kvantitative måling af intratalprotein syntese i musemodeller af neurologiske Lidelser. Denne procedure giver en baseline for at vurdere (1) den patofysiologiske oprindelse af enhver CSF protein og (2) stabiliteten og funktionelle betydning af barrieren integritet. Denne procedure og protokol er ikke kun nyttige til at vurdere mus CSF prøver, men er også nyttige i at analysere CSF i en lang række dyremodeller af neurologiske sygdomme og humane patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyre arbejde udnytter protokoller, som gennemgås og godkendes af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) på Geisel School of Medicine at Dartmouth.
1. indsamling af væsker
Bemærk: både serum og CSF er påkrævet. To protokoller for hver væske opsamling er nødvendige for overlevelse og nekropsy.
- Serum-og CSF-opsamling ved hjælp af overlevelses procedurer
Bemærk: for overlevelse væske indsamling, serum indsamling bør gå forud CSF indsamling, da det er en mindre invasiv procedure. CSF skal opnås inden for en uge af serum-lodtrækningen.- Retroorbital blødnings procedure for serum opsamling.
Bemærk: denne procedure er for overlevelse blødning af mus14. Den beskrevne fremgangsmåde gælder for enhver alder, køn og stamme af mus. Da IACUC regler dikterer, at en maksimal blodvolumen på 1% af legemsvægten kan fjernes som en enkelt blodprøve, anbefales det, at proceduren kun udføres på mus, der vejer mere end 15 g.- Flyt burene med mus fra stativet til et passende arbejdsområde. Forbered anæstesi gasmaskinen ved at tænde oxygen flowmåleren til 1 L/min.
- Anbring dyret i induktions kammeret, og luk låget tæt. Tænd for isofluran vaporizer til 3,5%, og Overvåg dyret, indtil det er rekumbøjet.
- Fjern dyret fra kammeret og Vurder niveauet af anæstesi ved pedal refleks, dvs fast fodpanel pinch. Sørg for tilstrækkelig dybde af anæstesi før udførelse af proceduren: manglende respons på en fast kniv indikerer tilstrækkelig anæstesi.
- Hold den anæstetiserede mus begrænse ved at gribe den løse hud bag ørerne med tommelfingeren og pegefingeren på den ikke-dominerende hånd. Bulge øjnene ved at bruge pegefingeren til at trække huden tilbage over øjet og tommelfingeren for at trække huden tilbage under øjnene.
- Placer spidsen af en Pasteur-pipette i øjen bøsningen under øjeæblet (figur 1, venstre panel), og dirigerer spidsen på ca. 45 ° mod midten af øjen soklen (figur 1, højre panel). Drej pipetten mellem fingrene under den fremad passage. Påfør forsigtigt tryk og slip derefter, indtil blodet kommer ind i pipetten.
Bemærk: den maksimale mængde blod, der kan trækkes tilbage på én gang fra denne placering, er ca. 1% af legemsvægten, f. eks. 0,2 mL fra en 20 g mus. - Fjern forsigtigt kapillar for at undgå, at øjet er skadet, og Placer det indsamlede blod i et 1,5 mL centrifugeglas. Luk øjenlåg og anvende mildt tryk med gaze for at forhindre yderligere blødning. Når fuldt alarm og mobil (normalt 3 − 5 min), returnere musen til sin bedrift bur.
- Lad blodet størkne i 30 − 60 minutter ved stuetemperatur (RT), og centrifuger derefter blodet i 10 minutter ved 2.000 x g i en 4 °c kølet centrifuge. Brug en ren pipette teknik til at samle serum i et nyt, mærket 0,5 mL hætteglas. Straks fryse hætteglas med serum ved-80 °C.
- CSF indsamling med overlevelse procedure
Bemærk: denne procedure er for overlevelse kirurgi, og det er baseret på protokollen udgivet af Liu og Duff i 200815. Musene er bedøvet af en ketamin (20 mg/mL), xylazin (0,5 mg/mL), og Acepromazin (0,5 mg/mL) cocktail administreret intraperitonealt.- Flyt bure, der indeholder mus fra stativet til en udpeget kirurgi arbejdsområde. Forbered kirurgi plads i et sterilt miljø. Sørg for, at alle anvendte instrumenter og materialer er steriliseret før operationen.
- Veje musen og beregne anæstesi volumen nødvendig (0,1 mL anæstesi cocktail for en 20 g mus). Indsprøjte anæstesi intraperitonealt16. Efter et par minutter, teste musen ved at klemme fodpladen for at sikre tilstrækkelig anæstesi. Hvis mere bedøvelse er påkrævet, yderligere injicere 0,01 − 0,03 mL af bedøvelsesmiddel cocktail.
- Brug enten saks eller en barbermaskine til at barbere et lille område af hovedet, på den hale ende, mediale på kraniet, for at udsætte stort nok arbejdsområde til CSF-opsamling. Placer musen i den udsatte position på det stereo taxiske instrument, og støt hovedet ved hjælp af ørepude (figur 2a).
Bemærk: musen er lagt ned, således at hovedet danner en næsten 135 ° vinkel med kroppen (figur 2a). Når dyret er anbragt, anvendes der et kirurgisk drapere til at opretholde et sterilt felt på operationsstedet. Klare klæbe gardiner foretrækkes til CSF-opsamling i mus, da de giver mulighed for direkte og mere fokuseret visualisering af dyret. - Svaber operationsstedet med 30% chlorhexidindiacetat. Ved hjælp af en steril skalpel, gøre en sagittale snit af huden ringere end occiput at udsætte musklerne overliggende Cisterna Magna.
- Ved stump dissektion med pincet adskilles det subkutane væv og musklerne for at udsætte Cisterna Magna (figur 2b). Brug microretractors til at holde musklerne fra hinanden (figur 2b) og udsætte dura mater meningeal lag over Cisterna Magna.
- Vask forsigtigt med steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at fjerne eventuel blod kontaminering. Du bør tørre dura mater med en steril vatpind og forsigtigt punktere membranen, der dækker Cisterna Magna, med en 30 G nål. Hurtigt og forsigtigt indsætte et lille glas kapillar rør til at indsamle CSF (figur 2c).
Bemærk: intrakranielt tryk giver CSF mulighed for at flyde spontant ind i kapillær (figur 2c). Afhængigt af alder og størrelse af musen opnås ca. 5 − 12 μL CSF fra hver mus. - Fjern forsigtigt Kapillarrøret fra membranen. Tilslut røret til en 3 mL sprøjte gennem en polyethylen slange (tabel over materialer) og injicere den indsamlede CSF i en mærket 0,5 ml rør (figur 2D). Opbevar hætteglassene i is.
- Tæt indsnit ved hjælp af polydioxanon sutur (PDS) med engangskanyle og ved hjælp af begravede suturer17. Rengør området for ethvert tørret blod eller væv.
- Injicer mus, subkutant eller intraperitonealt16, med 0,05 − 0,1 mg/kg buprenorphin hydrochlorid som analgetisk behandling. Injicer også subkutant 1 mL sterilt saltvand for at forhindre dehydrering.
- Placer musen tilbage i et rent og varmt bur til nyttiggørelse. Når musen er mobil og i stand til at nå mad og vand, placere buret tilbage på stativet.
- Centrifuge CSF i 10 min ved 1.000 x g i en 4 °c kølet centrifuge. Kontroller graden af blod kontaminering ved visuel inspektion for identifikation af xanthochromia og tilstedeværelsen af en rød pellet i bunden af røret. Udsmid blod forurenede prøver.
Bemærk: formlen anvendes til korrektion af CSF protein mængder i blod-forurenede prøver er baseret på ligning parametre, der omfatter proteinindhold i CSF og serum, hæmatokrit (HCT), og røde blodlegemer (RBC) tælle i CSF og blod18. Men, en sådan korrektion strategi kan ikke let anvendes til mus CSF prøver på grund af den lille mængde, derfor begrænser korrektionen strategi til en visuel inspektion. - Ved hjælp af en ren pipette teknik, opsamles CSF i en ny 0,2 mL rør, efterlader pellet med celler. Fortyndet CSF 1:3 med PBS for at reducere volumen tabet på grund af aerosol. Hætteglasset med CSF fastfryses straks ved-80 °C.
- Retroorbital blødnings procedure for serum opsamling.
- Serum-og CSF-opsamling ved hjælp af ikke-overlevelses procedurer
Bemærk: for ikke-overlevelse væske samling, CSF samling går forud for serum indsamling som musen har brug for at have en puls.- CSF Collection hos makroskopisk obduktion
Bemærk: denne procedure er for ikke-overlevelse kirurgi, og ca 10 − 20 μL af CSF er opnået fra hver mus. En steril kirurgisk felt anbefales, men ikke påkrævet for ikke-overlevelse kirurgi.- Flyt burene med mus fra stativet til et behageligt arbejds rum. Følg trin 1.1.2.2 − 1.1.2.7 og 1.1.2.11 − 1.1.2.12 for CSF-samlingen. Fortsæt til afsnit 1.2.2 for serum opsamling.
- Blod opsamling via intrakardiel punktering (åben tilgang)
Bemærk: de forventede blod volumener er ca. 3% af legemsvægten, fx 0,6 mL fra en 20 g mus.- Efter CSF indsamling sikre musen er stadig tilstrækkeligt bedøvet ved at klemme fodpladen. Hvis der observeres en reaktion, administreres endnu en dosis bedøvelsesmiddel. Hvis der ikke observeres nogen reaktion, fortsættes.
- Placer dyret på ryggen og vatpind huden på maven med 70% alkohol. Med kirurgisk saks, åbne thorax hulrum og udsætte hjertet. Indsæt en 25 G nål (fastgjort til en 3 mL sprøjte) i venstre ventrikel, og Påfør forsigtigt det negative Tryk på sprøjtens stempel. Træk nålen ud efter blodet er blevet opsamlet.
- Udføre en sekundær metode til eutanasi såsom hugning eller cervikal dislokation for at sikre, at dyret er afgået.
- Tryk sprøjtens stempel ned, og injicer det indsamlede blod i et 1,5 mL hætteglas. Lad blodet størkne i 30-60 min ved RT, og centrifuger det derefter i 10 minutter ved 2.000 x g i en 4 °c kølet centrifuge.
- Brug ren pipette teknik til at samle serum i et nyt, mærket 0,5 mL hætteglas. Straks fryse hætteglas med serum ved a-80 °C fryser.
- CSF Collection hos makroskopisk obduktion
2. protein analyse
- Brug en foretrukken metode, fx Luminex-teknologi, til at kvantificere målprotein (s) og albumin i matchede serum-og CSF-prøver.
Bemærk: her er et eksempel givet med Luminex magnetisk teknologi, men stort set enhver teknik, der måler protein mængder, herunder enzym-sammenkædede immunosorbent assays (ELISAs), kan anvendes på den nuværende protokol. Ideelt, CSF og serumprøver køres for både albumin og målproteiner på samme platform. Analysebetingelser skal optimeres for vigtige trin i protokollen, såsom antigen-perle koblings koncentration, serum-og CSF-prøve fortyndinger, bedst egnede standardkurver for hver analysand og buffer sammensætning for at reducere ikke-specifik reaktivitet. Hvis et kommercielt kit anvendes til måling af protein (s), f. eks immunglobulin isotyping Kit (Tabel over materialer), der anvendes til at fremskaffe dataFigur 3, skal producentens anvisninger følges.- Ved optøning og før analyse, centrifuge CSF og serumprøver (2.000 x g i 10 min) og brug supernatanten til at forhindre tilstopning af filter pladerne og/eller sonden. Følg den ANALYSEPROCEDURE, der følger med sættet, for passende prøve fortyndinger. Ellers bestemmes den passende fortynding for hver analysand og væske. Fortyndede prøver i PBS i overensstemmelse hermed.
Bemærk: Hvis der ikke er nogen specifik vejledning eller vejledning, skal fortyndinger for hver analysand og væske fastlægges før undersøgelses testen ved at bestemme de relevante fortyndings intervaller, der er nødvendige for at opnå koncentrations estimater, som falder inden for de mest pålideligt sortiment af en standardkurve. Kendskab til egenskaberne af den biologiske prøve, der skal analyseres, fx fysiologiske og patologiske koncentrationer i væsken, gør det muligt at prøve forskellige fortyndinger med prøver af lav, medium, og høj analysandindhold. Hvis det forventede koncentrationsområde i prøverne er kendt a priori, kan fortyndinger vælges efter beregning af, hvor mange gange prøven skal fortyndes for at være inden for det valgte standardkurve område.
Forsigtig: ved beregning af fortyndings faktorerne skal du huske, at CSF allerede er blevet fortyndet 1:3. - Forbered en standardkurve for hvert protein af interesse, f. eks, albumin og IgG som anvendes til at generere data i figur 3, ved seriel fortynding referencestandard proteiner. Under forberedelsen af standardkurver blandes grundigt hver højere koncentration, før du foretager den næste fortynding.
Bemærk: uanset den valgte metode til kvantificering er det vigtigt at inkludere en standardkurve, hver gang analysen udføres for at anslå proteinkoncentrationen i prøverne. Det bedste valg for en referencestandard er en renset, kendt koncentration af det protein af interesse. Beslutning om de specifikke fortyndinger, samt antallet af datapunkter og replikater, der anvendes til at definere standardkurven, afhænger af graden af ikke-linearitet i standardkurven. - Vælg de relevante antistof-koblede magnetiske perle sæt (tabel over materialer). For individuelle hætteglas med perler, soniker hvert hætteglas i 30 s og vortex i 1 min. Forbered en "fungerende perler blanding" ved at fortynde vulst bestandene til en endelig koncentration på 50 perler af hvert sæt/μL i assay/vask buffer (PBS, 1% bovint serumalbumin [BSA]). Tilsæt 50 μL af de blandede perler til hver brønd i en flad bund 96-brønd plade (tabel over materialer).
Forsigtig: de fluorescerende perler er lysfølsomme. Derfor bør de beskyttes mod langvarig udsættelse for lys under hele proceduren. - Diagram placeringen af baggrunde, standarder og eksempler på en godt kort regneark.
- Tilsæt 50 μL assay/vask buffer til hver baggrund brønd, og 50 μL af hver standard til brøndene for standardkurven. Læg 50 mL af hver fortyndet prøve i de relevante brønde sidst. Pak pladen med folie og Inkuber med agitation (~ 800 rpm) på en plade shaker i 30 minutter ved RT.
- Placer pladen på en håndholdt magnet (tabel over materialer) og hvile pladen på magneten for ~ 60 s at tillade fuldstændig indstilling af magnetiske perler. Fjern godt indhold ved forsigtigt at deanting pladen og Tap pladen på absorberende puder for at fjerne restvæske.
- Pladen vaskes ved at fjerne den fra magneten ved at tilsætte 200 μL analyse/vaskebuffer ved at ryste den i ~ 30 s og endelig ved at sætte den på magneten igen. Gentag vask 3x.
- Det biotin-mærkede antistof, som er oprejst mod protein værts arterne, fortyndes til 4 μg/mL i assay/vaskebuffer. Tilsæt 50 μL af det fortyndede detektionsstof til hver brønd. Dæk pladen og Inkuber i 30 min på RT på pladen shaker ved ~ 800 rpm. Anbring pladen på magneten, og Gentag trin 2.1.6 og 2.1.7.
- Phycoerythrin (PE)-konjugeret streptavidin (SAPE) fortyndes til 4 μg/mL i analyse/vaskebuffer. Tilsæt 50 μL fortyndet SAPE til hver brønd. Dæk pladen og Inkuber i 30 min på RT på pladen shaker ved ~ 800 rpm. Anbring pladen på magneten, og Gentag trin 2.1.6 og 2.1.7.
- Fjern pladen fra magneten og resuspender perlerne i 100 μL analyse/vaskebuffer. Læs brønde med et dobbelt laser flow-baseret detekterings instrument, som gør det muligt at påvise størrelsen af PE-fluorescens intensitet (FI).
Bemærk: signalet, f. eks FI, genereret er proportional med mængden af Target antigen fastgjort til overfladen af perlerne. - Eksporter rå data, og Opret standardkurver ved at afbilde detekteringssignal FI kontra standard proteinkoncentrationer. Brug standardkurven (-erne) til at beregne koncentrationen af analytten (erne) i prøverne.
Bemærk: albumin udtrykkes fortrinsvis i g/dL, mens der fortrinsvis udtrykkes proteiner i mg/dL.
- Ved optøning og før analyse, centrifuge CSF og serumprøver (2.000 x g i 10 min) og brug supernatanten til at forhindre tilstopning af filter pladerne og/eller sonden. Følg den ANALYSEPROCEDURE, der følger med sættet, for passende prøve fortyndinger. Ellers bestemmes den passende fortynding for hver analysand og væske. Fortyndede prøver i PBS i overensstemmelse hermed.
3. beregninger af intrathecalt indeks
- Organiser protein koncentrationsværdier i et regneark, og analysér resultaterne ved at anvende følgende formler.
- Beregn Qalbumin:
hvor CSFalbumin og serumalbumin er koncentrationer af albumin i matchede serum og CSF prøver hhv. - Beregn Q-protein:
hvor CSFprotein og serumprotein er koncentrationer af målprotein (s) i matchede serum og CSF prøver hhv. - Beregn protein indekset:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette repræsentative eksperiment havde til formål at sammenligne den intratekale syntese af IgG i to klinisk relevante gnaver modeller af multipel sklerose (MS): PLP139-151-induceret recidiverende eksperimentel autoimmun hesteencephalitis (R-EAE) og kronisk progressiv, theiler's murine hesteencephalitis virus-induceret demyelinerende sygdom (tmev-IDD). R-EAE er en nyttig model til at forstå relapsing-reterende MS, hvorimod TMEV-IDD-modellen indeholder kronisk progressiv MS19.
For nærværende undersøgelse er der foretaget en kvantitativ analyse af den intrathecale IgG-syntese i R-EAE (n = 12) og TMEV-IDD (n = 28). Begge grupper blev analyseret på toppen af deres sygdom. En yderligere gruppe på 10 mus var Sham-behandlet og fungerede som alders matchede kontrolgrupper (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD Sham n = 6).
En magnetisk perle baseret tilgang med det kommercielt tilgængelige Kit (tabel over materialer) blev anvendt til at måle total IgG i matchede serum-og CSF-prøver. Den samlede IgG-værdi blev afledt af summen af værdierne under klasse IgG1, IgG2a, IgG2b og IgG3. Albumin blev målt med en kommerciel mus albumin ELISA Kit (tabel af materialer), fordi en Luminex assay for albumin ikke var til rådighed på det tidspunkt. Alle målinger blev udført omhyggeligt efter producentens anvisninger. Albumin kvotient (Qalbumin) og IgG-indeks (qIgG/qalbumin) blev derefter anvendt til at differentiere blod-versus CNS-afledt IgG i CSF.
Som vist i figur 3aer det faktiske niveau af total IgG øget betydeligt i CSF for både gnaver modeller af MS i forhold til de tilsvarende alders matchede Sham-kontroller (p ≤ 0,026). R-EAE-mus viser imidlertid signifikant forbedrede Q-albumin værdier (p ≤ 0,019), hvilket indikerer øget permeabilitet af barrieren i disse mus (figur 3b). Omvendt findes der ingen forskelle i Q-albumin mellem tmev-IDD-og Sham-mus (p = 0,49), hvilket bekræfter vores tidligere konstatering af en intakt barriere i tmev-IDD-mus7,8. For yderligere at diskriminere mellem transudat og intratekalt producerede IgG i R-EAE og tmev-IDD blev IgG-indekset målt, hvilket viste betydeligt højere værdier i tmev-IDD-mus (p ≤ 0,0006) og derfor Intratekal IgG-produktion i denne model (figur 3c).
En intakt barriere i TMEV-IDD-mus sammen med et højt IgG-indeks antyder, at der i denne model produceres antistof inden for CNS. Omvendt, i R-EAE, en signifikant barriere opdeling og et lavt IgG indeks giver bevis for, at CSF IgG er hovedsagelig produceres af perifere snarere end intratekale B-celler, også tyder på, at i denne akutte model af MS, CSF IgG er for det meste afledt af serum.
Figur 1: blødning af mus med retro-orbital. Venstre: korrekt placering af nålen i forhold til retro-orbital sinus, øjeæblet og bagsiden af kredsløb. Højre: pipette placering begynder i den mediale canthus af øjet og glider til rygningen aspekt af kredsløb. Kapillar er indsat i en vinkel på 45 °. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CSF-opsamling i mus. (A) ørepuderne understøtter musens hoved, og musen er fastgjort, så hovedet danner en 135 ° vinkel med kroppen. Pilen peger på den eksponerede Cisterna Magna. B) ved sløv dissektion med pincet adskilles musklerne for at udsætte Cisterna Magna (spiddet med pilen). Microretractors bruges til at holde musklerne fra hinanden. C) der anvendes et lille glas kapillar rør til at OPSAMLE CSF fra Cisterna Magna. CSF strømmer spontant ind i kapillær, på grund af det intrakranielle tryk. Pilen peger på den indsamlede CSF i kapillar. D) CSF overføres til et 0,5 ml rør gennem en modificeret 3 ml sprøjte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: blod-hjerne-barriere funktion og Intratekal syntese af IgG i R-EAE og tmev-IDD. Prik blot,der repræsenterer a) CSF-niveauerne for total IgG (mg/dl) målt ved hjælp af Luminex-teknologienB) albumin CSF/serum kvotienter (qalbumin) og (C) IgG-indekser (qIG/qalbumin) i R-EAE-og Tmev-IDD-mus samt alders matchede KONTROLMUS (CR-EAE og ctmev-IDD). Vandrette streger repræsenterer medianværdien for den pågældende gruppe. p < 0,0001; p < 0,001; * *p < 0,01; *p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantitative metoder til evaluering af øgede CSF proteinkoncentrationer er nyttige værktøjer i karakterisering af den fysiologiske og patologiske tilstand af CNS. Men ud over pålidelig kvantificering af CSF protein niveauer, påvisning af CSF proteiner kræver et udtryk for resultater, der diskriminerer mellem blod-og CNS-afledte fraktioner i CSF. Men til dato, de almindeligt anvendte protein kvantificering assays ikke tillader diskrimination mellem de to protein komponenter, selv ved hjælp af High-gennemløb værktøjer. Således er specifikke korrektioner til protein målinger blevet foreslået for at skelne mellem proteiner syntetiseret i CNS-rummet og proteiner afledt af blodet. Sådanne korrektioner kompenserer for individuel variation i både serumkoncentrationer og barriere integritet. Samlet set er disse korrektioner baseret på beregninger af en CSF/serum kvotient (Q-protein), hvilket reducerer variabiliteten på grund af forskelle i den individuelle koncentration af serumprotein. Variation af Q-proteinet relateret til individuelle forskelle i barrierefunktionen kan sænkes yderligere ved at relateres til q-proteinet til en CSF/serumalbumin kvotient (qalbumin). Kombinationen af begge korrektioner er generelt kendt som protein indeks og beregnes som Qprotein/qalbumin ratio4,6.
Albumin, syntetiseret og udskilles af leveren, er den store plasmaprotein, der cirkulerer i blodbanen. Fordi albumin produceres udelukkende uden for CNS og dets niveauer i CSF er lav (~ 0,15 g/dL), øget CSF albuminniveauer indikerer enten skader på BBI eller blod kontaminering på grund af intratalblødning eller traumatisk CSF samling. Under nogen af disse betingelser transuderer albumin fra serum til CSF i forhold til dets serumkoncentration. I fravær af blod kontaminering kan Q-albumin derfor anvendes som indikator for barriere funktion20. Omvendt, Qalbumin forbliver konstant inden for normalområdet i mennesker og dyr med en intakt BBI21. En grundlæggende antagelse for at bruge denne kvotient4,6 i Intratekal proteinsyntese beregning er, at den øgede mængde CSF protein i nærværelse af en utætte barriere er proportional med stigningen i CSF albumin koncentration. Denne antagelse er blevet eksperimentelt bekræftet i en undersøgelse fra 19774, hvor forfatterne overvåges i MS-patienter BLODET – CSF passage af radioaktivt mærket IgG og albumin opnået fra raske humane sera.
Svarende til albumin, kan ethvert protein i blodet krydse BBI. Når barrieren er intakt, er Q-proteinet relativt konstant. I modsætning til albumin, dog, mange proteiner kan også syntetiseres inden for CNS. Som følge heraf kan et ændret Q-protein skyldes en beskadiget barriere og/eller øget Intratekal protein produktion. Når en forhøjet CSF-proteinkoncentration kun skyldes en kompromitteret BBI, øges værdierne for både Q-protein og q-albumin , sammenlignet med værdier for de samme kvotienter hos dyr med en intakt barriere. I modsætning hertil, når barrieren er intakt, øget CSF proteinkoncentrationer er mest sandsynligt på grund af øget Intratekal syntese, og kun Qprotein er i sidste ende øges.
Brugen af protein indekset kan være delvist begrænset af fem faktorer: 1) den store variation af CSF albumin koncentrationen i raske dyr, 2) den forskellige hydrodynamiske radius af proteiner, 3) det endogene CNS-ekspression af proteiner, 4) forskellige prøvetagnings teknikker og 5) de morfologiske forskelle i BBI. Den store variation af CSF albumin koncentrationen i raske dyr resulterer i betydelig variation i værdierne for det endelige protein indeks. I mennesker, for eksempel, Qalbumin er aldersafhængig, da det stiger med alderen22. En tidligere rapport nævnte også en kønsbaseret forskel i Qalbumin i en sund befolkning23. Ligeledes, i mus albumin koncentrationer afhænger af alder og mus stamme24, f. eks, den qalbumin for unge, mandlige, C57Bl/6 mus kan være forskellig fra qalbumin for gamle, kvindelige, DBA/1J mus. Der kan derfor ikke etableres standardiserede referenceintervaller for barriere integritet på tværs af og inden for arterne, og passende tærskler skal beregnes på grundlag af de specifikke forsøgsbetingelser.
En anden faktor, der forårsager variation i normale indekser blandt proteiner er deres molekyl størrelse. Passage af serumproteiner gennem BBI afhænger af deres molekylære størrelse, og sammenhængen mellem clearance og molekylvægt (MW) anvendes i vid udstrækning til at vurdere permeabiliteten af BBI. Generelle proteinstrukturer spænder i størrelse fra TENS til flere tusinde aminosyrer. Nogle proteiner er af relativt lille molekyl størrelse, såsom kemo okiner, med en molekylvægt på mellem 8 og 20 kDa. En sådan lav MW favoriserer passage af BBI, hvilket i sidste ende resulterer i højere normale protein indekser. Forskelligt, andre proteiner, som IgM, er meget store (900 − 950 kDa), derfor viser meget lave indekser under normale forhold6. Dette er imidlertid ikke altid tilfældet, da nogle proteiner på trods af en lignende MW gennemsyrer barrieren meget bedre end andre proteiner, muligvis på grund af en anden form. Således, diffusions koefficienten af et protein, og dermed den hydrodynamiske radier beregnet fra det, afhænger af både størrelse og form af molekyler25. Den grundlæggende forskel mellem geometrisk og Hydrodynamisk volumen af et protein bliver tydeligst med store proteiner over 150 kDa. De faldende clearance rater for f. eks ceruloplasmin (132 kDa), IgG (150 kDa), og IgA (150 kDa) afspejler den hydrodynamiske heterogenitet af disse tre proteiner, som har lignende MW25. Det er også muligt, at der er intratalproduktion af proteiner under normale omstændigheder. Nogle chemokiner, fx CXCL10, produceres typisk intrathecally, mens andre, fx CXCL13, ikke er26,27. Det betyder, at tolkning af protein indekser under de fleste eksperimentelle betingelser generelt kræver analyse af alders-, køn-og stamme matchede ubehandlede kontroller.
Protein niveauer i væsker kan også påvirkes af forskellige prøvetagnings teknikker. Selv om dette ikke kan være et problem for CSF indsamling som beskrevet her-der er ingen forskelle i CSF prøvetagning mellem de beskrevne overlevelse og ikke-overlevelse procedurer-, forskellige blod indsamlingsmetoder kan have en indvirkning på det samlede serumprotein mængde. Nogle metoder til blod opsamling udbytte arteriel blod, andre give venøs blod, mens andre giver en blanding af begge14. Prøven opnået fra overlevelse retroorbital blødning er en blanding af venøs blod og vævsvæske, mens den terminale blod opsamling fra hjertets punktering kan give venøs eller arteriel blod eller en blanding af begge14. I raske dyr kan det totale protein-og albumin indhold i det arterielle blodserum være lidt højere end de samme fraktioner af det venøse blod serum28. Dette bør tages i betragtning ved sammenligning af overlevelses-og non-Survival-prøver.
Endelig er en vigtig funktion at overveje, er den heterogene morfologiske struktur af BBI, som omfatter mindst to særskilte barrierer, blod-hjerne barrieren (BBB) placeret på endotelet af hjernen mikrofartøjer og blodet – CSF barriere (bcsf) placeret på epitel af chorioideus klar29. Begge barrierer begrænser og regulerer passage af molekyler og celler mellem de perifere og cerebrospinalrum, selv om de gør det ved forskellige mekanismer. Mens BBB er en reel fysisk barriere, karakteriseret ved et komplekst samspil mellem celler, BCSF er mere af en fysiologisk barriere, som for det meste afhænger af CSF flow. Reduktioner i CSF produktion, frigivelse, og strømningshastighed på grund af neurologiske tilstande og/eller traumer forringe bcsf funktion, og dermed øge Qalbumin9,30,31,32. Derfor, Qalbumin fungerer som en bedre markør for bcsf permeabilitet snarere end BBB eller generelt BBI permeabilitet.
Sammenfattende er beregningen af et protein indeks en forholdsvis enkel og velkarakteriseret metode til diskrimination mellem transudat og intrathecalt producerede proteiner. Fordelen ved at anvende denne formel til at korrigere den generelle måling af proteiner i CSF-prøver er, at den genererer en objektiv variabel til at kvantificere den intrathecale syntese af proteiner og til at måle BBI, specifikt BCSF, (dys) funktion. Da denne fremgangsmåde er robust, giver korrektionen af CSF-protein beløbene gennem Q-albumin -og protein indekset en baseline, som man skal vurdere (1) den patofysiologiske oprindelse af ethvert CSF-protein og (2) stabiliteten og den funktionelle betydning af barriere integriteten. Her er det præsenteret en detaljeret protokol, fra CSF og blodindsamling til de endelige beregninger korrigere den samlede CSF proteinmængde, som gælder for musemodeller for neurologiske sygdomme. Dog kan den samme protokol let tilpasses studiet af CSF og Intratekal syntese af proteiner i ethvert dyr, herunder mennesker. Qalbumin og IgG indeks er allerede almindeligt anvendt i klinisk praksis til diagnosticering af inflammatoriske neurologiske sygdomme6. Disse samme parametre er også blevet anvendt med succes til at evaluere en bred vifte af cytokiner og kemo okiner hos patienter med inflammatoriske demyelinerende sygdomme26,33,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker personalet i Center for sammenlignende medicin og forskning (CCMR) på Dartmouth for deres ekspert pleje af de mus, der anvendes til disse undersøgelser. Bornsteins forskningsfond finansierede denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
- Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
- Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
- Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
- DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
- Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
- Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
- Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
- Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
- Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
- Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
- Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
- Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
- Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
- Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
- Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
- Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
- Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
- Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
- Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
- Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
- Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).
