Summary
Förhöjda spinal Fluid proteinnivåer kan antingen vara resultatet av diffusion av plasmaprotein över en förändrad blod-hjärnbarriären eller intratekal syntes. En optimerad provningsprotokoll presenteras i denna artikel som hjälper till att diskriminera båda fallen och ger kvantitativa mätningar av intratekalt syntetiserade proteiner.
Abstract
Cerebrospinalvätska (CSF), en vätska som finns i hjärnan och ryggmärgen, är av stor betydelse för både grundläggande och klinisk vetenskap. Analysen av CSF protein sammansättning ger viktig information i grundläggande neurovetenskap forskning samt neurologiska sjukdomar. En varning är att proteiner som mäts i CSF kan härledas från både intratekal syntes och transudation från serum, och proteinanalys av CSF kan bara bestämma summan av dessa två komponenter. Att diskriminera mellan proteintransudation från blodet och intratekalt producerade proteiner i djurmodeller samt hos människor, CSF protein profilering mätningar med hjälp av konventionella proteiner analysverktyg måste omfatta beräkning av albumin CSF/serum kvoten (Qalbumin), en markör för integriteten hos den Blood-brain Interface (BBI), och protein index (qprotein/qalbumin), en uppskattning av intratekal proteinsyntes. Detta protokoll illustrerar hela förfarandet, från CSF och blod insamling till kvoter och index beräkningar, för kvantitativ mätning av intratekal proteinsyntes och BBI försämring i musmodeller av neurologiska sjukdomar.
Introduction
Cerebrospinalvätska (CSF), en klar och färglös vätska som omger hjärnan och ryggmärgen, innehar stor klinisk och grundläggande vetenskaplig betydelse. CSF bevarar den elektrolytiska miljön i centralanervsystemet (CNS), balanserar systemisk syra-bas status, levererar näringsämnen till neuronala och gliala celler, fungerar som ett lymfsystem för CNS, och transporterar hormoner, signalsubstanser, cytokiner och andra neuropeptider i hela CNS1. Således, som CSF sammansättningen återspeglar aktiviteten i CNS, denna vätska erbjuder en värdefull, men indirekt, tillgång till karakterisera den fysiologiska och patologiska tillståndet i CNS.
CSF har använts för att diagnostisera tillstånd som påverkar CNS i över hundra år, och för det mesta av denna tid, det var främst studeras av kliniker som ett diagnostiskt verktyg. Emellertid, under de senaste åren neurobiologer har erkänt potentialen av CSF för att studera patofysiologin i CNS. I synnerhet har flera olika högpresterande proteinanalys verktyg införts i neurovetenskap sfären så att en detaljerad studie av protein sammansättningen av CSF, med förväntningen att denna analys kan bidra till att ge insikt i de dynamiska förändringarna förekommer i CNS.
Teknisk utveckling i multiplex immunoassay tekniker såsom Luminex och simoa Technologies2,3, ge forskarna idag med förmågan att upptäcka hundratals proteiner vid mycket låga koncentrationer. Dessutom tillåter samma teknik användningen av små provvolymer, vilket främjar studier av små djur, inklusive möss, där begränsade provvolymer av CSF har förhindrat detaljerade karakteriseringar av vätskan tills nyligen.
Ändå, en varning är att proteiner som mäts i CSF kan härledas från intratekal syntes och/eller transudation från serum på grund av en skadad blod-hjärna-gränssnitt (BBI). Tyvärr, proteinanalys av CSF ensam kan bara bestämma summan av dessa två komponenter. För att diskriminera mellan transsudat och intratekalt producerade proteiner, CSF protein mätningar med hjälp av alla tillgängliga proteinanalys verktyg måste justeras för individuell variation i serumkoncentrationer samt barriär integritet. Men även om denna justering ofta används i klinisk praxis, t. ex., CSF-IgG-indexet, som har hög känslighet för detektion av intratekal IgG-syntes4,5,6, har mycket få forskningsstudier korrigerat CSF proteinkoncentrationer för serumkoncentrationen och barriär integriteten7,8.
För närvarande är Reibergram-metoden det bästa sättet att bestämma barriärfunktionen och intratekal syntes av proteiner. Det är en grafisk utvärdering i CSF/serum kvoten diagram som analyserar, på ett integrerat sätt, både barriär (DYS) funktion och intratekal proteinsyntes, med hänvisning till ett exklusivt blod-derived protein9,10. Det mycket rikliga proteinet albumin väljs vanligen som referens protein eftersom det produceras endast i levern och eftersom dess storlek, cirka 70 kDa, är mellanliggande mellan små och stora proteiner11. Analysdiagrammet definierades först av Reiber och Felgenhauer i 1987 för de stora klasserna av immunglobuliner (IGS)11, som empiriskt baserades på de resultat som erhållits från analysen av tusentals Human prov9. Tillvägagångssättet bekräftades därefter av applikationen av de två fick-lagarna av diffusion i teorin av molekylär diffusion/flöde klassar12. En sådan teori visar spridningen av ett protein genom barriären har en hyperbolisk distribution och kan kvantitativt förklara dynamiken i proteiner i CNS9,13. Sammantaget fördelen med att använda Reibergram för att demonstrera intratekal proteinsyntes är att det samtidigt identifierar proteinfraktion som går in i CSF från serum samt mängden protein som finns i CSF på grund av lokal produktion.
Denna artikel och det tillhörande protokollet beskriver hela förfarandet, från CSF och blod insamling till de slutliga beräkningarna korrigera CSF proteinnivåer, för kvantitativ mätning av intratekal proteinsyntes i musmodeller av neurologiska Sjukdomar. Detta förfarande ger en baslinje för att bedöma (1) det patofysiologiska ursprunget för något CSF-protein och (2) stabiliteten och den funktionella betydelsen av barriär integriteten. Detta förfarande och protokoll är inte bara användbart för att bedöma mus CSF prover men är också användbara i att analysera CSF i en mängd djurmodeller av neurologiska sjukdomar och mänskliga patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete använder protokoll granskas och godkännas av den institutionella Animal Care och use Committee (IACUC) vid Geisel School of Medicine vid Dartmouth.
1. uppsamling av vätskor
Anmärkning: både serum och CSF krävs. Två protokoll för varje vätske samling behövs för överlevnad och nekropsy.
- Serum-och CSF-insamling med hjälp av överlevnads procedurer
Anmärkning: för insamling av överlevnads vätska bör serum samlingen föregå CSF insamling eftersom det är en mindre invasiv procedur. CSF måste erhållas inom en vecka efter serum dragningen.- Retro-orbital blödning förfarande för serum samling.
Obs: denna procedur är för överlevnad blödning av möss14. Proceduren som beskrivs gäller för alla åldrar, kön och stam av möss. Eftersom IACUC regler föreskriver att en maximal blodvolym på 1% av kroppsvikten kan avlägsnas som en enda blod dragning, det rekommenderas att förfarandet utförs endast på möss som väger mer än 15 g.- Flytta burar som innehåller möss från racket till ett lämpligt arbetsområde. Förbered anestesigasen maskinen genom att vrida på syre flödesmätaren till 1 L/min.
- Placera djuret i induktions kammaren och Stäng locket ordentligt. Slå på isofluran spridare till 3,5% och övervaka djuret tills recumbent.
- Ta bort djuret från kammaren och bedöma nivån av anestesi genom pedal reflex, dvs fast footpad nypa. Säkerställ tillräckligt djup av anestesi innan du utför förfarandet: brist på svar på en fast nypa indikerar adekvat anestesi.
- Begränsa den sövda musen genom att greppa den lösa huden bakom öronen med tummen och pekfingret på den icke-dominerande handen. Bulge ögonen genom att använda pekfingret för att dra tillbaka huden ovanför ögat och tummen för att dra tillbaka huden under ögonen.
- Placera spetsen på en Pasteur pipett i ögat uttaget under ögongloben (figur 1, vänster panel), styra spetsen på cirka 45 ° mot mitten av ögat uttaget (figur 1, höger panel). Rotera pipetten mellan fingrarna under den främre passagen. Applicera skonsamt tryck och släpp sedan tills blodet kommer in i pipetten.
Obs: maximal mängd blod som kan tas ut på en gång från denna plats är ca 1% av kroppsvikten, t ex 0,2 mL från en 20 g mus. - Ta försiktigt bort kapillärröret för att förhindra skador på ögat och placera det insamlade blodet i ett 1,5 mL centrifugertub. Stäng ögonlocket och applicera milt tryck med gasväv för att förhindra ytterligare blödning. När den är helt Alert och mobil (vanligtvis 3 − 5 min), returnera musen till dess hållande bur.
- Låt blodet koagulera i 30 − 60 min vid rumstemperatur (RT), och centrifugera sedan blod i 10 min vid 2 000 x g i en kyld centrifug på 4 ° c. Använd en ren pipettteknik och samla upp serum i en ny, märkt 0,5 mL injektionsflaska. Frys omedelbart flaskan med serum vid-80 ° c.
- CSF insamling med överlevnad förfarande
Obs: detta förfarande är för överlevnad kirurgi, och det är baserat på det protokoll som publicerats av LiU och Duff i 200815. Mössen är sövda av en ketamin (20 mg/ml), xylazin (0,5 mg/ml), och Acepromazin (0,5 mg/ml) cocktail administreras intraperitonealt.- Flytta burar som innehåller möss från racket till en utsedd kirurgi arbetsområde. Förbered kirurgi utrymme i en steril miljö. Säkerställ att alla instrument och material som används är steriliserade före operationen.
- Väg musen och beräkna anestesi volymen behövs (0,1 mL anestesi cocktail för en 20 g mus). Injicera anestesi intraperitonealt16. Efter några minuter, testa musen genom att nypa fotplattan för att säkerställa adekvat anestesi. Om mer bedövningsmedel krävs, ytterligare injicera 0,01 − 0,03 mL av bedövningsmedlet cocktail.
- Använd antingen sax eller en rakapparat för att raka en liten del av huvudet, på caudal slutet, mediala på skallen, att exponera tillräckligt stor arbetsyta för CSF samling. Placera musen i den liggande positionen på stereotaxiinstrumentet och stadig huvudet med hjälp av öron stänger (figur 2A).
Obs: musen är fastlagd så att huvudet bildar en nästan 135 ° vinkel med kroppen (figur 2A). När djuret väl är placerat används ett kirurgiskt draperi för att upprätthålla ett sterilt fält på operationsstället. Tydliga självhäftande draperier är att föredra för CSF samling i möss, eftersom de möjliggör direkt och mer fokuserad visualisering av djuret. - Svabb operationsområdet med 30% klorhexidindiacetat. Med hjälp av en steril skalpell, göra en sagittal snitt av huden sämre än nackknöl att exponera muskler överliggande den Cisterna magna.
- Genom Blunt dissektion med tång, separera subkutan vävnad och muskler för att exponera Cisterna magna (figur 2b). Använd mikroretraktorer för att hålla musklerna isär (figur 2b) och exponera dura mater meningeal skikt över Cisterna magna.
- Tvätta försiktigt med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna eventuell blod förorening. Blot torka dura mater med en steril bomullspinne och försiktigt punktera membranet som täcker Cisterna magna med en 30 G nål. Snabbt och försiktigt in ett litet glas kapillärrör för att samla CSF (figur 2C).
Anmärkning: intrakraniellt tryck gör att CSF kan flöda spontant in i Kapillärtrycket (figur 2C). Beroende på musens ålder och storlek erhålls cirka 5 − 12 μL CSF från varje mus. - Ta försiktigt bort kapillärröret från membranet. Anslut röret till en 3 mL spruta genom en polyeten slang (tabell över material) och injicera den insamlade CSF i en märkt 0,5 ml tub (figur 2D). Förvara injektionsflaskorna i is.
- Nära snitt genom att använda polydioxanonsutur (PDS) med engångsnål och använda begravda suturer17. Rengör området av torkat blod eller vävnad.
- Injicera möss, subkutant eller intraperitonealt16, med 0,05 − 0,1 mg/kg buprenorfinhydroklorid som analgetisk behandling. Injicera också subkutant 1 mL steril saltlösning för att förhindra uttorkning.
- Placera musen tillbaka i en ren och varm bur för återhämtning. När musen är mobil och kan nå mat och vatten, placera buren tillbaka på racket.
- Centrifugera CSF i 10 min vid 1 000 x g i en kyl centrifug på 4 ° c. Kontrollera graden av blod förorening genom visuell inspektion för identifiering av xanthochromia och förekomst av en röd pellet i botten av röret. Kassera blodkontaminerade prover.
Anmärkning: den formel som används för korrigering av CSF protein belopp i blodkontaminerade prover är baserad på ekvation parametrar som innehåller proteinhalt i CSF och serum, hematokrit (HCT), och röda blodkroppar (RBC) räkna i CSF och blod18. En sådan korrigerings strategi kan dock inte lätt tillämpas på mus CSF preparat på grund av den lilla volymen, därför begränsar korrigerings strategin till en visuell inspektion. - Med hjälp av en ren pipett teknik, samla CSF i en ny 0,2 mL rör, lämnar bakom pelleten med celler. Späd CSF 1:3 med PBS för att minska volymförlusten på grund av aerosol. Frys omedelbart injektionsflaskan med CSF vid-80 ° c.
- Retro-orbital blödning förfarande för serum samling.
- Serum-och CSF-insamling med icke-överlevnadsprocedurer
Anmärkning: för insamling av icke-överlevnadsvätska, CSF samling föregår serum insamling som musen måste ha en puls.- CSF insamling på obduktion
Anmärkning: detta förfarande är för icke-överlevnad kirurgi, och cirka 10 − 20 μL av CSF erhålls från varje mus. Ett sterilt kirurgiskt fält rekommenderas, men krävs inte för icke-överlevnadskirurgi.- Flytta burar som innehåller möss från racket till en bekväm arbetsplats. Följ stegen 1.1.2.2 − 1.1.2.7 och 1.1.2.11 − 1.1.2.12 för CSF-samling. Fortsätt till avsnitt 1.2.2 för serum uppsamling.
- Blod insamling via intrakardiell punktering (öppen metod)
Obs: blod volymerna förväntas vara cirka 3% av kroppsvikten, t ex 0,6 mL från en 20 g mus.- Efter CSF insamling se till att musen är fortfarande tillräckligt sövda genom att nypa fotplattan. Om någon reaktion observeras, administrera en andra dos av bedövningsmedlet. Om ingen reaktion observeras, Fortsätt.
- Placera djuret på ryggen och Svabb huden på buken med 70% alkohol. Med kirurgisk sax, öppna bröstkorg hålighet och exponera hjärtat. Sätt in en 25 G nål (fäst på en 3 mL spruta) i vänster kammare och Applicera försiktigt det negativa trycket på sprutkolven. Dra ut nålen efter att blod har samlats in.
- Utföra en sekundär metod av eutanasi såsom halshuggning eller cervikal dislokation för att säkerställa att djuret är avliden.
- Skjut ner sprutkolven och injicera det insamlade blodet i en 1,5 mL injektionsflaska. Låt blodet koagulera för 30-60 min vid RT och sedan Centrifugera det för 10 min vid 2 000 x g i en 4 ° c kyld centrifug.
- Använd ren pipett teknik, samla serum i en ny, märkt 0,5 mL injektionsflaska. Omedelbart frys flaska med serum vid a-80 ° c frys.
- CSF insamling på obduktion
2. protein analys
- Använd en föredragen metod, till exempel Luminex Technology, för att kvantifiera målprotein (er) och albumin i matchade serum-och CSF-preparat.
Anmärkning: här ges ett exempel med Luminex magnetisk teknik, men praktiskt taget alla tekniker som mäter protein mängder, inklusive enzymlänkade immunosorbent analyser (Elisas), kan tillämpas på det aktuella protokollet. Helst körs CSF-och serumprover för både albumin och målproteiner på samma plattform. Analys villkoren måste optimeras för viktiga steg i protokollet, såsom antigen-Bead koppling koncentration, serum och CSF provspädningar, bäst lämpade standardkurvor för varje analyt och buffert sammansättning för att minska icke-specifik reaktivitet. Om ett kommersiellt Kit används för protein mätningar (s), t. ex.Tabell över material) som används för att få fram dataFigur 3måste tillverkarens anvisningar följas.- Vid upptinning och före analys, Centrifugera CSF-och serumprover (2 000 x g för 10 min) och Använd supernatanten för att förhindra igensättning av filter plattorna och/eller sonden. Följ analys proceduren som medföljer satsen för lämpliga provspädningar. I annat fall, Bestäm lämplig utspädning för varje analyt och vätska. Späd proverna i PBS i enlighet med detta.
Anmärkning: om det inte finns några särskilda riktlinjer eller instruktioner måste spädningar för varje analyt och vätska fastställas före studie testet, genom bestämning av lämpliga spädnings intervall som är nödvändiga för att uppnå koncentrations uppskattningar som faller inom de mest tillförlitligt område av en standardkurva. Att känna till egenskaperna hos det biologiska provet som skall analyseras, t. ex. fysiologiska och patologiska koncentrationer i vätskan, gör det möjligt att pröva olika utspädningar med prover av lågt, medel och högt analyt innehåll. Om det förväntade intervallet av koncentrationer i proverna är känt på förhand, kan spädningar väljas efter beräkning av hur många gånger provet måste spädas för att vara inom det valda standardintervallet för kurvan.
Varning: genom att beräkna utspädningsfaktorer, kom ihåg att CSF redan har späts 1:3. - Bered en standardkurva för varje protein av intresse, t. ex., albumin och IgG som används för att generera data i figur 3, genom seriell spädning referensstandard proteiner. Vid beredning av standardkurvor, blanda noggrant varje högre koncentration innan du gör nästa spädning.
Anmärkning: oberoende av den valda kvantifieringsmetoden är det viktigt att inkludera en standardkurva varje gång analysen utförs för att uppskatta proteiners koncentration i prover. Det bästa valet för en referensstandard är en renad, känd koncentration av proteinet av intresse. Att besluta om de specifika utspädningar, liksom antalet datapunkter och replikat som används för att definiera standardkurvan, beror på graden av icke-linearitet i standardkurvan. - Välj lämpliga antikropp-kopplade magnetiska pärlsatser (tabell över material). För enskilda flaskor med pärlor, Sonikera varje injektionsflaska för 30 s och Vortex för 1 min. Förbered en "arbets pärlor blandning" genom att späda pärla lagren till en slutlig koncentration av 50 pärlor av varje set/μL i assay/tvättbuffert (PBS, 1% bovint serum albumin [BSA]). Tillsätt 50 μL av de blandade pärlorna till varje brunn i en platt-botten 96-brunn plattan (tabell över material).
Varning: de fluorescerande pärlorna är ljuskänsliga. Därför bör de skyddas från långvarig exponering för ljus under hela förfarandet. - Diagram placeringen av bakgrunder, standarder och exempel på ett väl Kartblad.
- Tillsätt 50 μL analys/tvättbuffert till varje bakgrunds brunn, och 50 μL av varje standard till brunnarna för standardkurvan. Fyll på 50 mL av varje utspätt prov i de lämpliga brunnarna sist. Linda plattan med folie och inkubera med agitation (~ 800 RPM) på en tallrik Shaker för 30 min vid RT.
- Placera plattan på en handhållen magnet (tabell över material) och vila plattan på magneten för ~ 60 s för att möjliggöra fullständig inställning av magnetiska pärlor. Ta bort väl innehåll genom att försiktigt Dekantera plattan och knacka plattan på absorberande kuddar för att ta bort kvarvarande vätska.
- Tvätta plattan genom att ta bort den från magneten, genom att tillsätta 200 μL av assay/tvättbuffert, genom att skaka för ~ 30 s, och slutligen genom att sätta tillbaka den till magneten. Upprepa tvätt 3x.
- Späd den biotinylerade detektions antikroppen, dvs, biotin-märkt antikropp upp mot proteinet värdarter, till 4 μg/mL i assay/tvättbuffert. Tillsätt 50 μL av den utspädda detektions antikroppen till varje brunn. Täck plattan och inkubera i 30 min vid RT på plattan shaker på ~ 800 RPM. Placera plattan på magneten och upprepa steg 2.1.6 och 2.1.7.
- Späd phycoerythrin (PE)-konjugerat konjugerat (sape) till 4 μg/ml i analys/tvättbuffert. Tillsätt 50 μL utspädd SAPE i varje brunn. Täck plattan och inkubera i 30 min vid RT på plattan shaker på ~ 800 RPM. Placera plattan på magneten och upprepa steg 2.1.6 och 2.1.7.
- Ta bort plattan från magneten och Omsuspendera pärlorna i 100 μL analys/tvättbuffert. Läs brunnar med ett dubbelt laserflödesbaserat detektions instrument som gör det möjligt att detektera storleken på PE-fluorescensintensiteten (FI).
Obs: signalen, t ex FI, som genereras är proportionell mot mängden målantigen som fästs på pärlytan. - Exportera rådata och skapa standardkurvor genom att grafera detektions signalen FI kontra standard proteinkoncentrationer. Använd standardkurvan (-kurvorna) för att beräkna koncentrationen av analyten (-erna) i proverna.
Anmärkning: albumin uttrycks företrädesvis i g/dL, medan proteiner av intresse uttrycks företrädesvis i mg/dL.
- Vid upptinning och före analys, Centrifugera CSF-och serumprover (2 000 x g för 10 min) och Använd supernatanten för att förhindra igensättning av filter plattorna och/eller sonden. Följ analys proceduren som medföljer satsen för lämpliga provspädningar. I annat fall, Bestäm lämplig utspädning för varje analyt och vätska. Späd proverna i PBS i enlighet med detta.
3. intrateala index beräkningar
- Organisera proteinkoncentrationsvärdena i ett kalkylblad och analysera resultaten genom att använda följande formler.
- Beräkna Qalbumin:
där CSF-albumin ochserumalbumin är koncentrationer av albumin i matchade serum respektive CSF-preparat. - Beräkna Qprotein:
där CSF-protein och serumprotein är koncentrationer av målproteiner i MATCHADE serum-respektive CSF-preparat. - Beräkna protein indexet:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta representativa experiment syftade till att jämföra intratekal syntes av IgG i två kliniskt relevanta gnagare modeller av multipel skleros (MS): den PLP139-151-inducerad skovvis experimentell autoimmun encefalomyelit (R-EAE) och kronisk progressiv, Theiler ' s murin encefalomyelitis virusinducerad demyeliniserande sjukdom (TMEV-IDD). R-EAE är en användbar modell för att förstå skovvis förlöpande MS, medan TMEV-IDD-modellen har kronisk progressiv MS19.
För den aktuella studien har en kvantitativ analys av den intrateala IgG-syntesen i R-EAE (n = 12) och TMEV-IDD (n = 28) utförts. Båda grupperna analyserades på toppen av sin sjukdom. En ytterligare grupp på 10 möss simulerades och tjänade som åldersmatchade kontrollgrupper (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD Sham n = 6).
En magnetisk pärlbaserad metod med det kommersiellt tillgängliga kitet (tabell över material) användes för att mäta totalt IgG i matchade serum-och CSF-preparat. Det totala IgG-värdet härleddes från summan av subklassen IgG1, IgG2a, IgG2b och IgG3 värden. Albumin mättes med en kommersiell mus albumin ELISA-Kit (tabell över material) eftersom en Luminex-analys för albumin inte fanns tillgänglig vid den tidpunkten. Alla mätningar utfördes noggrant efter tillverkarens anvisningar. Albumin kvoten (Qalbumin) och IgG-index (qIgG/qalbumin) användes sedan för att differentiera blod-kontra CNS-härledda IgG i CSF.
Som framgår av figur 3aökas de faktiska nivåerna av totalt IgG avsevärt i GSR av båda gnagare modeller av MS jämfört med motsvarande åldersmatchade Sham kontroller (p ≤ 0,026). Emellertid, R-EAE möss visar signifikant förbättrade Qalbumin värden (p ≤ 0,019), vilket indikerar ökad permeabilitet av barriären i dessa möss (figur 3b). Omvänt finns det inga skillnader i Q-albumin mellan tmev-IDD-och Sham-möss (p = 0,49), vilket bekräftar vårt tidigare fynd av en intakt barriär i tmev-IDD-möss7,8. För att ytterligare diskriminera mellan transsudat och intratekalt producerat IgG i R-EAE och TMEV-IDD mättes IgG-indexet och visade signifikant högre värden hos TMEV-IDD-möss (p ≤ 0,0006), och därmed intratekal IgG-produktion i denna modell (figur 3c).
En intakt barriär i TMEV-IDD möss tillsammans med ett högt IgG-index tyder på att i denna modell, antikropp produceras inom CNS. Omvänt, i R-EAE, en betydande barriär uppdelning och ett lågt IgG-index ger belägg för att CSF IgG är främst produceras av perifera snarare än intrateala B-celler, också tyder på att i denna akuta modell av MS, CSF IgG är mestadels härrör från serum.
Figur 1: Retro-orbital blödning av möss. Vänster: korrekt placering av nålen i förhållande till retro-orbital sinus, ögongloben och bak i omloppsbana. Höger: pipetten plats börjar i mediala Cantus av ögat och glider till rygg aspekten av omloppsbana. Kapillärområdet sätts in i en vinkel på 45 °. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CSF-samling hos möss. (A) öron listerna stöder musens huvud och musen är fastlagd så att huvudet bildar en 135 ° vinkel mot kroppen. Pilen pekar mot de exponerade Cisterna magna. (B) genom trubbig dissektion med tång, är musklerna separerade för att exponera Cisterna magna (pekade på pilen). Mikroretraktorer används för att hålla musklerna isär. Cett litet kapillärrör av glas används för att samla in CSF från Cisterna magna. CSF strömmar spontant in i kapillär, på grund av det intrakraniella trycket. Pilen pekar på den insamlade CSF i kapillärområdet. D) CSF överförs till en 0,5 ml tub genom en modifierad 3 ml spruta. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: blod-hjärn barriärfunktion och intratekal syntes av IgG i R-EAE och tmev-IDD. Dot blot som representerar(a) CSF-nivåerna av totalt IgG (mg/dl) mätt med Luminex-teknik, B) albumincsf/serum kvoten (q-albumin) och (C) IgG-index (qig/qalbumin) i R-EAE-och tmev-IDD-möss samt åldersmatchade kontroll möss (CR-EAE och ctmev-IDD). Vågräta linjer representerar medianvärdet för gruppen. p < 0,0001; p < 0,001; * *p < 0,01; *p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantitativa metoder för utvärdering av förhöjda halter av CSF-protein är användbara verktyg i karakteriseringen av det fysiologiska och patologiska tillståndet i CNS. Men utöver tillförlitlig kvantifiering av CSF proteinnivåer, detektion av CSF proteiner kräver ett uttryck för resultat som diskriminerar mellan blod-och CNS-härledda fraktioner i CSF. Emellertid, hittills, de vanligaste protein kvantifiering analyser tillåter inte diskriminering mellan de två proteinkomponenterna, även med hjälp av hög kapacitet verktyg. Sålunda har specifika rättelser av protein mätningar föreslagits för att skilja mellan proteiner som syntetiseras i CNS-utrymmet och proteiner som härrör från blodet. Sådana korrigeringar kompenserar för individuell variation i både serumkoncentrationer och barriär integritet. Sammantaget är dessa korrigeringar baserade på beräkningar av en CSF/serum kvoten (Q-protein), vilket minskar variationen på grund av skillnader i den individuella koncentrationen av serumprotein. Variation av Q-proteinet relaterat till individuella skillnader i barriärfunktion kan sänkas ytterligare genom att man relaterar q-proteinet till en CSF/serumalbuminkvot (q-albumin). Kombinationen av båda korrigeringarna är allmänt känd som protein index och beräknas som Qprotein/qalbumin ratio4,6.
Albumin, syntetiseras och utsöndras av levern, är det stora plasmaproteinet som cirkulerar i blodomloppet. Eftersom albumin produceras uteslutande utanför CNS och dess nivåer i CSF är låga (~ 0,15 g/dL), ökade CSF albuminnivåer indikerar antingen skada på BBI eller blod förorening på grund av intratekal blödning eller traumatisk CSF samling. I något av dessa tillstånd, albumin transudates från serum i CSF i proportion till dess serumkoncentration. Därför, i avsaknad av blod förorening, Qalbumin kan användas som en indikator på barriärfunktion20. Omvänt är Q-albumin konstant inom normala intervall hos människor och djur med en intakt BBI21. Ett grundläggande antagande för att använda denna kvot4,6 i intratekalt proteinsyntes beräkning är att den ökade mängden av CSF protein i närvaro av en läckande barriär är proportionell mot ökningen av CSF albumin koncentration. Detta antagande har experimentellt bekräftats i en studie från 19774, där författarna övervakas hos MS-patienter i BLODET – CSF passage av radioaktivt märkt IgG och albumin som erhållits från friska humana sera.
Liknar albumin, något protein i blodet kan passera BBI. När barriären är intakt är Q-proteinet relativt konstant. Till skillnad från albumin, men, många proteiner kan också syntetiseras inom CNS. Som en följd av detta kan en förändrad Q-protein resultera från en skadad barriär och/eller ökad intratekal proteinproduktion. Icke desto mindre, när en förhöjd halt av CSF protein beror bara på en komprometterad BBI, värden för både Qprotein och qalbumin ökas, jämfört med värden för samma kvoter hos djur med en intakt barriär. Däremot, när barriären är intakt, ökade CSF proteinkoncentrationer är mest sannolikt på grund av ökad intratekal syntes, och endast Q-proteinet är i slutändan ökas.
Användningen av protein indexet kan delvis begränsas av fem faktorer: 1) den stora variationen av CSF albumin koncentration hos friska djur, 2) den olika hydrodynamiska radien av proteiner, 3) det endogena CNS-uttrycket av proteiner, 4) olika provtagningstekniker, och 5) de morfologiska skillnaderna i BBI. Den stora variationen i CSF-albuminkoncentrationen hos friska djur leder till betydande variationer i värdena för det slutliga protein indexet. Hos människa är till exempel Q-albumin åldersberoende eftersom det ökar med22års ålder. En tidigare rapport nämnde också en könsbaserad skillnad i Q-albumin i en frisk population23. Likaså, i möss albuminkoncentrationer beror på ålder och mus stam24, t. ex., qalbumin för unga, manliga, C57BL/6 möss kan skilja sig från qalbumin för gamla, kvinnliga, DBA/1J möss. Standardiserade referensintervall för barriär integritet kan därför inte fastställas mellan och inom arter, och lämpliga tröskelvärden måste beräknas på grund av de särskilda försöks förhållandena.
En annan faktor som orsakar variationer i normala index bland proteiner är deras molekylstorlek. Passage av serumproteiner genom BBI beror på deras molekylstorlek, och sambandet mellan clearance hastighet och molekylvikt (MW) används ofta för att utvärdera permeabiliteten av BBI. Generella proteinstrukturer varierar i storlek från tiotals till flera tusen aminosyror. Vissa proteiner är av relativt liten molekylstorlek, såsom chemokiner, med en molekylvikt som sträcker sig mellan 8 och 20 kDa. En sådan låg MW gynnar passage av BBI, i slutändan resulterar i högre normala protein index. Annorlunda, andra proteiner, som IgM, är mycket stora (900 − 950 kDa), därför visar mycket låga index under normala förhållanden6. Emellertid, detta är inte alltid fallet, eftersom, trots en liknande MW, vissa proteiner genomsyrar barriären mycket bättre än andra proteiner, möjligen på grund av en annan form. Således, diffusion koefficienten av ett protein, och därmed hydrodynamiska radier beräknas från det, beror på både storlek och form av molekyler25. Den grundläggande skillnaden mellan den geometriska och hydrodynamiska volymen av ett protein blir tydligast med stora proteiner över 150 kDa. Den minskande clearance av till exempel ceruloplasmin (132 kDa), IgG (150 kDa), och IgA (150 kDa) återspeglar den hydrodynamiska heterogenitet av dessa tre proteiner, som har liknande MW25. Det är också möjligt att det finns intratekal produktion av proteiner under normala förhållanden. Några chemokines, e.g., CXCL10, produceras vanligt intratecally, stunder andra, e.g., CXCL13, är inte26,27. Detta innebär att tolkning av protein index under de flesta experimentella förhållanden i allmänhet kräver analys av ålders-, kön-och stammatchade obehandlade kontroller.
Protein nivåer i vätskor kan också påverkas av olika provtagningsmetoder. Även om detta inte kan vara ett problem för CSF insamling som beskrivs här-det finns inga skillnader i CSF provtagning mellan de beskrivna överlevnad och icke-överlevnad förfaranden-, olika blod insamlingsmetoder kan ha en inverkan på den totala serumprotein mängden. Vissa metoder för blod insamling avkastning arteriellt blod, andra ger venöst blod, medan andra fortfarande ger en blandning av båda14. Provet erhålls från överlevnad retro-orbital blödning är en blandning av venösa blod-och vävnadsvätska, medan terminalen blod insamling från hjärt punktering kan ge venösa eller arteriellt blod eller en blandning av båda14. Hos friska djur kan det totala protein-och albuminhalten i arteriella blod serum vara något högre än samma fraktioner av det venösa blod serum28. Detta bör tas i beaktande när överlevnad och icke-överlevnad prover jämförs.
Slutligen, en viktig funktion att överväga är den heterogena morfologiska strukturen av BBI, som består av minst två distinkta barriärer, den Blood-hjärnbarriären (BBB) ligger på endotelet i hjärnans mikrokärl och blod-CSF barriär (bcsf) ligger på epitelet i koroidea plexuses29. Båda hindren begränsar och reglerar passage av molekyler och celler mellan perifera och cerebrospinalavdelningar, även om de gör det genom olika mekanismer. Medan BBB är en verklig fysisk barriär, som kännetecknas av ett komplext samspel mellan celler, BCSF är mer av en fysiologisk barriär, som oftast beror på CSF flöde. Minskningar av CSF produktion, frisättning och flöde på grund av neurologiska tillstånd och/eller trauma försämra bcsf funktion, vilket ökar Qalbumin9,30,31,32. Därför, Qalbumin fungerar som en bättre markör för bcsf permeabilitet snarare än BBB eller allmänt BBI permeabilitet.
Sammanfattningsvis är beräkningen av ett protein index en relativt enkel och väl karaktäriserad metod för diskriminering mellan transsudat och intratekalt producerade proteiner. Fördelen med att tillämpa denna formel för att korrigera den allmänna mätningen av proteiner i CSF prover är att det genererar en objektiv variabel för att kvantifiera intratekal syntesen av proteiner och för att mäta BBI, särskilt BCSF, (DYS) funktion. Med tanke på robustheten i detta tillvägagångssätt, ger korrigering av CSF protein belopp genom Qalbumin och protein index en baslinje för att bedöma (1) det patofysiologiska ursprunget för något CSF protein och (2) stabiliteten och funktionell betydelse barriär integritet. Här presenteras ett detaljerat protokoll, från CSF och blod insamling till de slutliga beräkningarna korrigera den totala CSF protein belopp, som gäller för musmodeller för neurologiska sjukdomar. Emellertid, samma protokoll kan lätt anpassas till studiet av CSF och intratekal syntes av proteiner i alla djur, inklusive människor. Qalbumin och IgG-index används redan ofta i klinisk praxis för diagnos av inflammatoriska neurologiska sjukdomar6. Dessa samma parametrar har också framgångsrikt använts för att utvärdera ett brett spektrum av cytokiner och chemokiner hos patienter med inflammatoriska demyelinierande sjukdomar26,33,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar personalen vid centrum för Komparativ medicin och forskning (CCMR) vid Dartmouth för deras expert vård av möss som används för dessa studier. Forskningsfonden Bornstein finansierade denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
- Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
- Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
- Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
- DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
- Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
- Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
- Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
- Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
- Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
- Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
- Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
- Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
- Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
- Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
- Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
- Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
- Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
- Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
- Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
- Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
- Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).
