Summary
المعلوماتية الحيوية هي طريقه مفيده لمعالجه مجموعات البيانات واسعه النطاق. ومن خلال تطبيق نهج المعلوماتية الحيوية ، يمكن للباحثين الحصول بسرعة وموثوقيه وكفاءه علي التطبيقات الثاقبة والاكتشافات العلمية. توضح هذه المقالة استخدام المعلوماتية الحيوية في أبحاث سرطان المبيض. كما نجح في التحقق من صحة نتائج المعلوماتية الحيوية من خلال التجريب.
Abstract
اشاره الشق هو مسار التنظيمية التي تم الحفاظ عليها للغاية المشاركة في العديد من العمليات الخلوية. Dysregulation هذا المسار الإشارات غالبا ما يؤدي إلى التدخل في التنمية السليمة وقد يؤدي حتى في بدء أو تطور السرطان في حالات معينه. لان هذا المسار يخدم وظائف معقده ومتعددة الاستخدامات ، ويمكن دراستها علي نطاق واسع من خلال العديد من النهج المختلفة. ومن بين هذه الوسائل ، توفر المعلوماتية الحيوية أسلوبا للدراسة يتسم بالفعالية من حيث التكلفة والسهولة وسهوله الاستعمال. المعلوماتية الحيوية هي وسيله مفيده لاستخراج أجزاء أصغر من المعلومات من مجموعات البيانات واسعه النطاق. ومن خلال تنفيذ مختلف نهج المعلوماتية الحيوية ، يمكن للباحثين ان يفسروا بسرعة وموثوقيه وكفاءه هذه البيانات الكبيرة ، وان ينتجوا تطبيقات ثاقبه واكتشافات علميه. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لدمج نهج المعلوماتية الحيوية للتحقيق في دور الإشارات الشق في سرطان المبيض. وعلاوة علي ذلك ، يتم التحقق من صحة نتائج المعلوماتية الحيوية من خلال التجريب.
Introduction
ومسار الإشارات من الدرجة الاولي هو مسار مصان بدرجه كبيره ومهم للعديد من العمليات التنموية داخل الكائنات البيولوجية. وقد أظهرت الإشارات الشق للعب دورا هاما في انتشار الخلايا والتجديد الذاتي ، والعيوب في مسار الإشارات الشق يمكن ان يؤدي إلى أنواع كثيره من السرطانات1،2،3،4،5،6. في بعض الحالات ، وقد تم ربط مسار الإشارات الشق إلى كل من نمو الانسجه والسرطان ، فضلا عن موت الخلايا وقمع الأورام7. مستقبلات الشق متعددة (الشق 1 − 4) و co\u2012activator منشط العقل المدبر (MAML 1 − 3) ، كل مع وظائف متنوعة ، أضافه مستوي إضافي من التعقيد. في حين ان الشق يشير المسار متطورة من حيث الوظائف ، مساره الأساسي بسيط علي أساس الجزيئية8. مستقبلات الشق بمثابه بروتينات الغشاء تتكون من المناطق خارج الخلية وداخل الخلايا9. والربط إلى المنطقة خارج الخلية من مستقبلات الشق يسهل الانقسام بروتينيه ، والذي يسمح المجال داخل الخلايا الشق (NICD) ليتم الإفراج عنهم في النواة. NICD ثم يربط إلى co\u2012activator منشط العقل المدبر لتنشيط التعبير الجينات المصب10.
في السنوات الاخيره ، وقد أظهرت الإشارات الشق للعب مجموعه متنوعة من الأدوار في بدء وتطور عده أنواع من السرطانات عبر الأنواع المختلفة6،11. علي سبيل المثال ، وقد تم ربط الإشارات الشق إلى نشاه التي تنطوي علي الإنسان NOTCH1 الجينات12. في الاونه الاخيره ، NOTCH2 ، NOTCH3 ، دلتا--مثل 3 (DLL3) ، Mastermind\u2012like البروتين 1 (MAML1)، وتحلل والمعادن التي تحتوي علي البروتين 17 (ADAM17) الجينات وقد ثبت ان ترتبط ارتباطا وثيقا مع سرطان المبيض ، وخاصه مع الفقراء البقاء الكلي للمرضي13.
ومع زيادة كميه البيانات التجريبية والمرتبطة بالمريض باستمرار ، يزداد أيضا الطلب علي تحليل البيانات المتاحة. وتنتشر البيانات المتاحة عبر المنشورات ، وقد تقدم نتائج متضاربة أو حتى متناقضة. ومع تطور التكنولوجيا الجديدة في العقود الاخيره ، مثل تسلسل الجيل التالي ، ازدادت كميه البيانات المتاحة باطراد. وعلي الرغم من ان هذا يمثل تقدما سريعا في العلوم وفرصا لمواصله البحوث البيولوجية ، فان تقييم معني البيانات المتاحة للعموم لحل المسائل البحثية يمثل تحديا كبيرا14. ونحن نعتقد ان المعلوماتية الحيوية هي طريقه مفيده لاستخراج قطع صغيره من المعلومات من مجموعات البيانات الواسعة النطاق. ومن خلال تنفيذ مختلف نهج المعلوماتية الحيوية ، يمكن للباحثين بسرعة وموثوقيه وكفاءه تفسير هذه البيانات الكبيرة ، مما يؤدي إلى اكتشافات ثاقبه. قد تتراوح هذه الاكتشافات من تحديد أهداف العلاج الدوائي الجديدة المحتملة أو الامراض الحيوية المرض ، لعلاج المريض شخصيه15،16.
المعلوماتية الحيوية نفسها تتطور بسرعة ، والنهج تتغير باستمرار مع التقدم التكنولوجي اكتساح العلوم الطبية والبيولوجية. وتشمل نهج المعلوماتية الحيوية الشائعة حاليا استخدام قواعد البيانات والبرامج الحاسوبية المتاحة للجمهور لتحليل تسلسل الحمض النووي أو البروتين ، وتحديد الجينات ذات الصلة أو الاهميه الخاصة ، وتحديد اهميه الجينات والمنتجات الجينية من خلال الجينوم الوظيفي16. وعلي الرغم من ان مجال المعلوماتية الحيوية لا يقتصر بالتاكيد علي هذه النهج ، الا انها هامه في مساعده الأطباء والباحثين علي أداره البيانات البيولوجية لصالح المرضي ككل.
تهدف هذه الدراسة إلى تسليط الضوء علي العديد من قواعد البيانات الهامه واستخدامها للبحوث حول مسار الإشارات الشق. NOTCH2، NOTCH3، والمنشطة co\u2012activator واستخدمت كامثله للدراسة قاعده البيانات. وقد استخدمت هذه الجينات لأنه تم التحقق من اهميه المسار الإشارات الشق في سرطان المبيض. وأكدت التحليلات المنهجية للبيانات المستردة اهميه الإشارات الشق في سرطان المبيض. الاضافه إلى ذلك ، لان الإشارات الشق مصانة جيدا عبر الأنواع ، وأكد ان الإفراط في التعبير عن الورم الخبيث والعقل المدبر معا يمكن ان تحفز الأورام في دروفيا المبيضين ، ودعم نتائج قاعده البيانات والدور الهام والمحفوظ للاشاره الشق في سرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التنبؤ بالنتائج السريرية من الملامح الجينية (PRECOG)
ملاحظه: المدخل PRECOG (precog.stanford.edu) الوصول إلى البيانات المتاحة علنا من 165 مجموعات بيانات التعبير عن السرطان ، بما في ذلك مستويات التعبير الجيني والنتائج السريرية المريض17. وهو يوفر علي وجه التحديد تحليل Meta\u2012Z ، الذي يتضمن مجموعات بيانات كبيره لتوفير العشرات من الجينات المختلفة في 39 أنواع السرطان للاشاره إلى بقاء المريض عموما. ويشار إلى معدلات البقاء علي قيد الحياة الفقيرة والجيدة بقيم ايجابيه وسلبيه لنقاط Z\u2012score علي التوالي.
- إنشاء حساب مع البريد الكتروني التابع لاكاديميه للوصول إلى قاعده البيانات هذه. ادخل عنوان البريد الكتروني وكلمه المرور المرتبطة بالحساب.
- انقر علي زر عرض التفاصيل الموجود أسفل عنوان تحليل Meta-Z .
- إدخال جين الفائدة في شريط البحث .
- استخدام شريط التمرير الموجود في الجزء السفلي من الشاشة للحصول علي البقاء علي قيد الحياة Z-درجه لنوع السرطان محدده من الفائدة.
2. CSIOVDB
ملاحظه: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) هو قاعده بيانات ميكروصفيف وضعت من قبل معهد علوم السرطان في سنغافورة لدراسة سرطان المبيض18. تحتوي قاعده البيانات هذه علي بيانات الأورام السرطانية من مواقع الأورام المختلفة بالاضافه إلى بيانات انسجه المبيض العادية. الاضافه إلى ذلك ، يوفر CSIOVDB خطط البقاء علي قيد الحياة Kaplan\u2012Meier لتقييم بقاء المريض مع مستويات التعبير الجيني التفاضلية. CSIOVDB يمكن تطبيقها للتحقيق في العلاقة بين مستويات التعبير الجيني وسرطان المبيض مراحل/الدرجات.
- إدخال الجينات الفائدة ، ثم انقر فوق زر البحث .
- انقر فوق علامة التبويب حاله المرض .
ملاحظه: توفر علامة التبويب هذه إحصاءات موجزه عن التعبير الجيني عن الجينات المستهدفة التي تهم الدول المصابة بمرض سرطان المبيض. - انقر علي علامة التبويب الانسجه .
ملاحظه: توفر علامة التبويب هذه إحصاءات موجزه عن التعبير الجيني للجينات المستهدفة للفائدة في النسيجيات الرئيسية لسرطان المبيض. - انقر علي كلينيكو-العلامات المرضية التبويب.
ملاحظه: توفر علامة التبويب هذه مقارنه بين مستويات التعبير الجيني بين مراحل سرطان المبيض المختلفة ، والدرجات ، والاستجابات السريرية مع اختبارات مان-ويتني. - انقر علي علامة التبويب البقاء علي قيد الحياة .
ملاحظه: هذه العلامة التبويب يوفر كابلان-ماير المؤامرات المرتبطة البقاء علي قيد الحياة الشامل والبقاء علي قيد الحياة خاليه من الامراض. لقاعده البيانات هذه ، ويعتبر البقاء علي قيد الحياة خاليه من المرض التقدم-وتكرار خاليه من البقاء علي قيد الحياة18. كما يتم العثور علي تحليلات متعددة المتغيرات للبقاء الشامل والبقاء علي قيد الحياة خاليه من الامراض تحت علامة التبويب هذه. التحليلات متعددة المتغيرات مقارنه الميزات التي تتعلق التكهنات سرطان المبيض (المرحلة ، الصف ، الجراحية debulking ، الانسجه ، العمر) والجينات من الفائدة. - انقر فوق علامة التبويب النوع الفرعي.
ملاحظه: توفر علامة التبويب هذه إحصائيات موجزه واختبارات مان-ويتني لمستوي التعبير لجين الفائدة في الأنواع الفرعية الجزيئية لسرطان المبيض. هذه العلامة التبويب أيضا يوفر كابلان-ماير المؤامرات المرتبطة بالبقاء الشامل والبقاء علي قيد الحياة خاليه من المرض من الجينات الاهتمام في الأنواع الفرعية الجزيئية من سرطان المبيض.
3. التعبير الجيني عبر الانسجه الطبيعية والأورام (GENT)
ملاحظه: تم تطوير بوابه GENT (الطبية \ u2012genome/GENT) وصيانتها من قبل معهد كوريا للبحوث العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية (KRIBB)19. ويجمع ال16,400 (U133A ؛ 241 مجموعات البيانات) و 24,300 (U133plus2 ؛ 306 مجموعات البيانات) العينات المتاحة للعموم. بعد التوحيد ، تقدم GENT بيانات التعبير الجيني عبر الانسجه المتنوعة ، والتي تنقسم أيضا إلى الورم والانسجه الطبيعية.
- انقر علي علامة التبويب بحث في الأعلى من الشاشة.
- في المقطع المسمي 1. الكلمة الرئيسية، حدد رمز الجينات للمصطلحات من القائمة المنسدلة ، وإدخال رمز الجينات من الجينات الفائدة في المنطقة الفارغة من قسم الكلمات الرئيسية ، وحدد الانسجه للخيار النوع .
- انقر فوق زر البحث في الجزء السفلي من 1. قسم الكلمات الرئيسية . وهو يعرض الرسوم البيانية الموجزة للتعبير الجيني في الانسجه الطبيعية والأورام من أنواع مختلفه من السرطان استنادا إلى منصات U133A و U122Plus2.
ملاحظه: انه اختياري لتحديد خيار تصفيه البيانات في الأعلى من الرسم البياني الموجز إلى واحد من قاعده بيانات معينه للدراسة. - انقر فوق الارتباط المجاور لنتيجة تحميل البيانات للوصول إلى المعلومات التفصيلية حول قيم التعبير الجيني وأنواع الانسجه ومصادر البيانات.
4-المعهد الواسع لموسوعة الخلايا السرطانية (CCLE)
ملاحظه: تم إنشاء CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) من قبل المعهد واسعه ويوفر ملامح الجينوم والطفرات من 947 الخلايا السرطانية البشرية خطوط20.
- إدخال الجينات المطلوبة في شريط البحث ثم انقر فوق زر البحث .
- في المقطع المسمي تحديد Dataset، انقر فوق الخيار تعبير Mrna (rnaseq) من القائمة المنسدلة.
ملاحظه: تشمل الخيارات الأخرى التعبير mrna (affy)، اخيل شرانا ضربه قاضيه، ورقم النسخة. - انقر علي زر تبديل كل الآثار . حدد نوع الانسجه من الفائدة من المربع الرمادي علي اليمين. مرر لأسفل إلى أسفل الشاشة وانقر علي زر تعبير mRNA التحميل .
- افتح المستند النصي الذي تم تنزيله. انسخ النص وألصقه في الورقة 1. نسخ كافة النص في الورقة 1.
- انقر علي الورقة في التبويب ورقه برنامج جدول البيانات 2 في الجزء السفلي من جدول البيانات. انقر بزر الماوس الأيمن علي عمود ، حدد لصق خاص، ثم حدد خيار تبديل في ورقه 2.
- بمجرد نقل النص إلى عمودين علي الورقة 2، انقر فوق السهم المنسدل لعنوان خيار التصفية & الفرز ثم حدد خيار التصفية . سيظهر سهم في منطقه العنوان المسمية جين. انقر علي السهم واكتب في نوع الانسجه من الفائدة.
ملاحظه: ستقوم هذه الخطوة بتصفية كافة البيانات وعرض مستويات التعبير الجيني فقط لنوع الانسجه من الفائدة.
5. كوبيوكورتال
ملاحظه: تم تطوير cbioportal (www.cioportal.org) في مركز سلون كيتيرنج التذكاري للسرطان (msk) ، ويقوم بالوصول إلى البيانات الجينية للسرطان الواسعة النطاق21،22وتحليلها وتصورها. وعلي وجه التحديد ، تتيح هذه البوابة للباحثين البحث عن التعديلات الجينية وشبكات الإشارات.
- باستخدام الاستعلام في الصفحة المقصودة ، انقر علي الاجهزه/الانسجه التي تهمك تحت القسم المسمي تحديد الدراسات. حدد دراسة معينه من الفائدة ، ثم ضرب الاستعلام بواسطة زر الجينات .
- في القسم المسمي تحديد الملامح الجينية، حدد من بين الخيارات الثلاثة: الطفرات، التغييرات المفترضة لعدد النسخ من Gistic، أو تعبير mrna. حدد المزيد من البيانات المقابلة من القائمة المنسدلة لتحديد المريض/حاله مجموعه.
- ادخل رمز (رموز) الجينات المستهدفة في مربع الاستعلام الخاص بإدخال الجينات. انقر فوق الزر " إرسال الاستعلام ".
- انقر علي علامة التبويب الشبكة في اعلي الصفحة لاسترداد الشبكة الجينية المطلوبة.
ملاحظه: الشبكة الإشارات مرمزه بألوان. يشار إلى الجينات التي يتم إدخالها بواسطة عقد البذور ذات الحد السميك. ويمثل كل جين من قبل دائره حمراء ، وكثافة اللون من الدائرة الحمراء يعكس تردد الطفرة. ترتبط الجينات بخطوط ملونه بشكل مختلف. وتعني الخطوط البنية "في نفس المكون" ، مما يشير إلى المشاركة في نفس المكون البيولوجي. الخطوط الزرقاء تعني "يتفاعل مع" ، مشيرا إلى ردود فعل الجينات. الخطوط الخضراء تعني "تغيير الدولة" ، مما يوحي بان أحد الجينات قد يتسبب في تغيير الدولة لجين آخر. - انقر علي علامة التبويب ملف في الأعلى من الصورة لاختيار حفظ كصوره (PNG) لتحميل صوره الشبكة.
6. تشريح دروفيا مع الأنماط الجينية المطلوبة وتلطيخ dapi
ملاحظه: جمع دروفيبيلا الإناث مع الأنماط الجينية المطلوبة ، ثم تشريح المبيضين يطير للخضوع لإجراءات تلطيخ dapi للتصوير.
- اعداد ذبابه الأسهم tj-Gal4 ، Gal80ts/CyO ؛ UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; UAS-mam. و w [1118] لإنشاء الذباب مع nicd-التعبير الفوقي (tj-Gal4 ، Gal80ts/+ ؛ UAS-NICD-GFP/+) و nicd و mam-التعبير الفوقي (TJ-Gal4, Gal80ts/uas-mam; UAS-NICD-GFP/+) القدرة.
- تطبيق تقنيه استهداف التعبير الجيني الزماني والإقليمي (TARGET) للتحكم في التعبير الجيني المكاني23. رفع الذباب في 18 درجه مئوية حتى سن الرشد ، ثم التحول إلى 29 درجه مئوية ل 48 h مع الخميرة قبل تشريح.
ملاحظه: Gal4 يمكن ان تدفع فقط uas التعبير تحت درجات حرارة اعلي ، عندما يتم تخفيف تثبيط بواسطة Gal80ts . أضافه الخميرة قبل تشريح يوسع المبيضين للحصاد. - مكان 3 مل من 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) (137 mM كلوريد الصوديوم ، 2.7 mM KCl ، 10 ملم Na2hpo4، 1.8 mm KH2PO4) في صحن جمع الاجنه. استخدام لوحه CO2 لتخدير الذباب.
- اختيار ذبابه الإناث ، ثم انتزاع بعناية الصدر السفلي من ذبابه باستخدام زوج من ملقط تشريح وغمرها في الحل 1x تلفزيوني في صحن جمع الاجنه. استخدمي زوجا ثانيا من الملقط لقرصه أسفل البطن واسحبيه برفق لتحرير الأعضاء الداخلية.
- تحديد وفصل زوج من المبيضين من جسم الذبابة. كسر غمد العضلات الموجودة في الطرف الخلفي من المبيضين وفصل الاوفاريوليس.
ملاحظه: يلزم فصل المتغيرات وكسر غمد العضلات من أجل تحقيق نتائج اعلي جوده تلطيخ. - وضع المبيضين في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL الذي يحتوي علي 500 μL من 1x تلفزيوني. يجب ان يبقي الأنبوب علي الجليد حتى يتم جمع جميع المبيضين.
- أزاله 1x تلفزيوني ومكان 0.5 mL من حل الإصلاح (4 ٪ الفورمالديهايد) في الأنبوب. ضع الأنبوب علي البندق لمده 10 دقائق.
- أزاله حل الإصلاح من الأنبوب والتخلص منه في حاويه نفايات مناسبه. استخدام 1 مل من PBT 1x (1x تلفزيوني تستكمل مع 0.4 ٪ تريتون™ X-100) لغسل المبيضين 3x لمده 15 دقيقه.
- تجاهل النهائي غسل PBT وأضافه 1 مل من PBTG (0.2 ٪ الزلال المصل البقري ، 5 ٪ مصل الماعز الطبيعي في 1x PBT) لمنع ربط غير محدد.
ملاحظه: يمكن تخطي هذه الخطوة لتلطيخ DAPI ، ولكن من الضروري لتلطيخ الأجسام المضادة. يمكن العثور علي تلوين مفصل مناعي في جيا et al.24. - ضع 150 μL من DAPI (10 ميكروغرام/مل) في الأنبوب لمده 10 − 15 دقيقه. تجاهل DAPI وغسل المبيضين 1x لمده 10 دقيقه باستخدام 1 مل من PBT 1x. أزاله PBT وغسل 2x لمده 10 دقيقه باستخدام 1x تلفزيوني.
- أزاله الزائدة التلفزيونية حتى ما يقرب من 300 μL من تلفزيوني يبقي في أنبوب مع المبيضين. Pipet المبيضين صعودا وهبوطا عده مرات باستخدام ماصه 200 μL ، من أجل تحرير غرف البيض.
- تدور برفق أسفل الأنبوب وأزاله بعناية بقدر 1x الحل تلفزيوني ممكن دون أزاله المبيضين. مكان 120 μL من الحل المتصاعد (1 ز ن-بروبيل gallate ، 5 مل من 10X تلفزيوني ، 40 مل من الجلسرين و 5 مل من dH2س) في الأنبوب.
ملاحظه: الحل المتصاعد هو لزجه ، لذلك فمن الصعب نقل بالبالضبط 120 μL من الحل المتصاعد في أنبوب. للتخفيف من حده هذه المشكلة ، يمكن استخدام طرف ماصه 1,000 μL لأضافه ثلاث قطرات من المحلول المتصاعد إلى الأنبوب. - قم بازاله حوالي 0.33 مم من طرف ماصه 200 μL واستخدم طرف الماصة الذي تم قطعه حديثا لوضع الحل المتصاعد علي شريحة زجاجيه بالمجهر.
- ضعي الكوب الزجاجي برفق علي المحلول المتصاعد واغلقي حواف زلة الغطاء مع طلاء الأظافر الشفاف.
ملاحظه: هناك حاجه إلى ختم حواف الزجاج الغطاء لمنع غرف البيض من تتدفق داخل الحل المتصاعد عند أخذ الصور مبائره. - الحصول علي الصور مع المجهر البؤري باستخدام الإعدادات التالية: عدسه الهدف = 10x التكبير; الفتحة العددية = 0.8 ؛ الطول الموجي للانبعاثات DAPI = 410 − 513 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الاجراء المذكور في الخطوة 1 باستخدام بوابه PRECOG ، تم الحصول علي Z-العشرات من NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في سرطان المبيض (1.3 ، 2.32 ، 1.62 ، علي التوالي). تشير القيم السالبة لنقاط Z\u2012score البقاء العام الضعيف للمرضي الذين لديهم مستويات عاليه من التعبير عن الجينات الثلاثة. باستخدام التنسيق الشرطي لبرنامج جداول البيانات ، يتم عرض قيم النقاط Z\u2012score في رسم شريطي ملون في الشكل 1.
تم استخدام قاعده بيانات CSIOVDB لتاكيد النتائج. باستخدام الإرشادات الموجودة في الخطوة 2 ، NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 تم إدخالها بشكل تسلسلي في منطقه البحث قاعده بيانات csiovdb ، وتم استرداد بيانات بقاء المريض الموجودة تحت علامة التبويب البقاء علي قيد الحياة . بالاضافه إلى بيانات البقاء علي قيد الحياة عموما ، CSIOVDB يوفر البقاء علي قيد الحياة خاليه من الامراض. كما يفصل CSIOVDB المرضي لتقديم بيانات البقاء علي قيد الحياة علي أساس Q1 مقابل Q4 (الربع الأدنى مقابل الربع العلوي) من مستويات التعبير الجيني. وتماشيا مع النتائج السابقة ، فان التعبير العالي عن NOTCH2و NOTCH3و MAML1 يرتبط بالبقاء العام الضعيف والبقاء الخالي من الامراض (الشكل 2ا ، ب). وفي الوقت نفسه ، فان علامة التبويب المعلمات المرضية كلينيكو من CSIOVDB يوفر أيضا مقارنه بين مستويات التعبير الجيني بين مختلف مراحل سرطان المبيض ، والدرجات ، والاستجابات السريرية مع اختبارات مان ويتني. تظهر النتائج ان مستويات التعبير الأعلى من NOTCH2و NOTCH3و MAML1 مرتبطة بمراحل متقدمة لسرطان المبيض (الشكل 2ج).
لان NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 هي حاسمه لبقاء المريض عموما ، تم التحقيق في مستويات التعبير الجيني في أورام المبيض وخطوط الخلايا السرطانية أكثر. تم تحميل بيانات التعبير من NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في انسجه المبيض العادية والأورام من منصة U133A باستخدام تعليمات الخطوة 3 ل GENT. يمكن للعلماء معالجه البيانات التي تم تحميلها وفقا لغرض البحث الخاصة بهم. هنا ، استخدمنا البيانات لإنتاج مربع والمؤامرات الويسكي باستخدام غراباد بريزم (الإصدار 8). واقترح المزيد من الاختبارات الطفرة ان NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 يتم التعبير عنها بشكل كبير في انسجه الورم (الشكل 3ا). التالي ، تم تحميل بيانات التعبير من NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في خطوط خلايا سرطان المبيض وفقا للبروتوكول الخطوة 4 ، وذلك باستخدام ccle. وتظهر مستويات التعبير الجيني في خطوط الخلايا السرطانية بواسطة المربع والمؤامرات المخفوقة (الشكل 3ب). علي الرغم من ان مستويات التعبير من NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 عاليه في خطوط الخلايا السرطانية ، لا يمكن استخلاص الاستنتاجات بسبب عدم وجود عناصر تحكم خط الخلية العادية في قاعده بيانات ccle. ومع ذلك ، يمكن للعلماء تحديد منشا خطوط الخلايا السرطانية ، ومقارنه مستويات التعبير علي أساس درجات مختلفه ، ومراحل ، وغيرها من المعلمات الباثولوجية.
وبمجرد تاكيد اهميه NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في سرطان المبيض ، تم استخدام cbioportal لدراسة شبكه الإشارات المرتبطة بها. باستخدام بروتوكول الخطوة 5 ، تم اختيار المبيض/قناه فالوب للدراساتالمختارة ، ثم تم اختيار مجموعه البيانات المصلية المبيضة (tcga ، Nature 2011) للتحليل. بالنسبة للقسم المسمي تحديد الملامح الجينية، تم تحديد التعبير mrna ، وأخيرا ملفه mrna التعبير Z-العشرات (جميع الجينات). للقسم حدد المريض/حاله مجموعه، تم اختيار العينات مع بيانات Mrna (agilent microarray) (489) الخيار من القائمة المنسدلة. في النهاية ، تم اختيار الجينات NOTCH2و NOTCH3و MAML1 لإرسال الاستعلام. استنادا إلى الجينات الاساسيه الثلاثة ، تم إنشاء شبكه الإشارات لتوفير 50 الجينات المجاورة الأكثر تكرارا ، والتي هي أيضا في نفس المسار مع اعلي معدلات الطفرة (الشكل 4).
لأنه تم الحفاظ علي الإشارات الشق جيدا عبر الأنواع ، تم التحقيق في سرطان المبيض دروفيا . وقد تم الإبلاغ عن الإشارات من الدرجة الاولي لتنظيم تكاثر خلايا الجريب الانتشار25، التمايز26،27، ودوره الخلية المادة28،29. ولم تحدث المبالغة في التعبير عن الأورام الخبيثة وحدها ورما في دروفيسيلا (الشكل 5ا) ، حيث ظلت ظهاره البيض الخاصة بالبويضات الغضروفية سليمه بطبقه واحده. ومع ذلك ، الإفراط في التعبير عن NICD و Mam معا الأورام المستحثة في دروفيبيلا (الشكل 5ب) ، والذي يظهر من قبل الطبقات الظهاريه متعددة والخلايا المتراكمة.
الشكل 1: التعبير عن NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في سرطان المبيض يرتبط بالبقاء العام الفقير. يتم عرض البقاء علي قيد الحياة Z-العشرات من NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في مرضي سرطان المبيض. ويشار إلى الفقراء البقاء علي قيد الحياة من قبل القيم السلبية Z\u2012score يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مستويات عاليه من NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 في سرطان المبيض ترتبط بالبقاء العام الفقراء ، وسوء البقاء علي قيد الحياة خاليه من الامراض ، ومراحل السرطان المتقدمة. قاعده بيانات ميكروصفيف CSIOVDB يوفر كابلان-ماير البقاء علي قيد الحياة الشامل والامراض خاليه من المرض المؤامرات من NOTCH2, NOTCH3, و MAML1 في مرضي سرطان المبيض, ومستويات التعبير الجيني في مراحل السرطان المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: NOTCH2، NOTCH3، وMAML1 يتم التعبير عنها بشكل كبير في أورام المبيض وخطوط الخلايا السرطانية. يتم الاشاره إلى قيم P لمقارنه التعبير الجيني في المبيضين العاديين وأورام المبيض المناظرة. (الاختصارات: المبيض-N = انسجه المبيض العادية ؛ المبيض-C = انسجه سرطان المبيض). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 الجينات وشبكه الإشارات المرتبطة بها مع 50 الجينات المجاورة الأكثر تغيرا في كثير من الأحيان. شبكه الإشارات مرمزه بألوان. يشار إلى الجينات التي يتم إدخالها بواسطة عقد البذور ذات الحد السميك. ويمثل كل جين من قبل دائره حمراء ، وكثافة اللون من الدائرة الحمراء يعكس تردد الطفرة. ترتبط الجينات بخطوط ملونه بشكل مختلف. وتعني الخطوط البنية "في نفس المكون" ، مما يشير إلى المشاركة في نفس المكون البيولوجي. الخطوط الزرقاء تعني "يتفاعل مع" ، مشيرا إلى ردود فعل الجينات. الخطوط الخضراء تعني "تغيير الدولة" ، مما يوحي بان أحد الجينات قد يتسبب في تغيير الدولة لجين آخر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النيكل و مام في دروفيا أيضا الحث علي أورام المبيض. ا. الإفراط في التعبير عن Nicd وحده لا يحفز تكوين الورم في دروفيسيلا. ب. الإفراط في التعبير عن Nicd ومام معا للحث علي الأورام في دروفيا. شريط مقياس = 50 μm الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وبما ان هناك عددا لا يحصي من النهج والأساليب لاستخدام المعلوماتية الحيوية ، هناك قواعد بيانات عديده متاحه علي الإنترنت لعامه الجمهور. ويمكن استخراج وفره من المعلومات من كل من قواعد البيانات هذه ، ولكن البعض منها هو الأنسب لأغراض معينه ، مثل تقييم بقاء المريض علي أساس بعض المدخلات. ويمكن للتحليلات المنهجية للبيانات المسترجعة من قواعد بيانات فرديه مختلفه ان تسفر بشكل مقنع عن نتائج علميه هامه.
ويركز التحليل الحالي علي دور الإشارات الدرجة في سرطان المبيض من خلال استخدام نهج المعلوماتية الحيوية. علي سبيل المثال ، تم استخدام تحليل Meta-Z علي قاعده بيانات البوابة PRECOG للحصول علي درجات Z التي تشير إلى نتائج بقاء المريض في دراسات السرطان السريرية. CSIOVDB هو آخر قاعده بيانات التحليل التلوي التي تم استخدامها لدراسة نتائج البقاء علي قيد الحياة من مرضي سرطان المبيض. نجحت بيانات CSIOVDB في التحقق من صحة النتائج التي توصلت اليها بوابه PRECOG التي NOTCH2و NOTCH3و MAML1 هي مهمة لبقاء المريض بشكل عام. وفي وقت لاحق ، أظهرت التطبيقات من قواعد البيانات GENT و CCLE كذلك ان NOTCH2، NOTCH3، و MAML1 يتم التعبير عنها بشكل كبير في أورام المبيض وخطوط الخلايا السرطانية. وقد كشف الجمع بين قواعد البيانات هذه بشكل منهجي عن الأدوار الهامه لNOTCH2و NOTCH3و MAML1 في سرطان المبيض. وقد وفر هذا الاستخدام لوسائل المعلوماتية الحيوية وسيله فعاله لاجراء بحوث السرطان بفعالية من حيث التكلفة ويبين كيف يمكن ان تسفر عن نتائج هامه للتطبيقات التجريبية والسريرية في المستقبل.
توفر المعلوماتية الحيوية للجمهور القدرة علي الوصول إلى النتائج من آلاف التجارب في وقت واحد. وتوفر المعلومات المستمدة من قواعد البيانات العامة طريقه فعاله من حيث التكلفة وتتسم بالكفاءة لوضع تصميم تجريبي قبل اجراء التجارب. الاضافه إلى ذلك ، من المهم الاشاره إلى ان البيانات المتاحة علنا يمكن ان تكون مبعثرة في المنشورات وقد تؤدي إلى نتائج متضاربة أو حتى متناقضة ، مما يتطلب اجراء تحليلات وصفيه من خلال نهج المعلوماتية الحيوية. يمكن للعلماء تصميم واجراء التجارب استنادا إلى البيانات الموجودة من خلال قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية الكبيرة للتحقق من صحة فرضيات علميه محدده. وأكدت نتائج تجربه دروفيا النتائج التي توصلت اليها قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية وأيدت كذلك فكره ان مكونات مسار الشق ينبغي الاستمرار في التحقيق فيها كاهداف محتمله للادويه العلاجية. ويشير النجاح في التحقق من نتائج المعلوماتية الحيوية من خلال التجريب أيضا إلى اهميه نهج المعلوماتية الحيوية للاكتشافات العلمية.
قد يكون هناك بعض القيود علي المعلوماتية الحيوية. أولا ، قد لا تقوم بعض المواقع/الاداات بتحديث نتائجها بسبب الجهود الزمنيه أو التكاليف المرتبطة بالصيانة. ثانيا ، بعض المواقع/الاداات تحديث باستمرار ، ولكن التحديث مع مدخلات اضافيه قد يغير النتائج التي تم الحصول عليها سابقا. ثالثا ، المطورين من بعض المواقع/أدوات الاحتفاظ بحقوق التاليف والنشر وتقييد استخدام محتوياتها. رابعا ، قد لا تكون التحليلات أو الخوارزميات الخاصة ببعض المواقع/الاداات دقيقه دائما.
للتغلب علي هذه القيود ، يتم اقتراح بعض الخطوات أو التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتطبيقات المستقبلية أفضل. أولا ، بعض المواقع/الاداات تسمح للباحثين بتحميل البيانات الجديدة يدويا للتحليل. إذا لم يكن كذلك ، يمكن للباحثين تحميل وتحليل أحدث البيانات من تلقاء نفسها. ثانيا ، يحتاج الباحثون إلى تشغيل تحليلاتهم بشكل متكرر ، والاحتفاظ بسجل للتواريخ. إذا تغيرت النتائج بشكل كبير ، قد يحتاج الباحثون إلى استخدام المدخلات الاضافيه من البيانات لمعرفه الأسباب. ثالثا ، يمكن للباحثين العثور علي موقع/أداه بديله لتشغيل تحليلاتهم لتجنب القضايا المحتملة لحق المؤلف. رابعا ، يمكن للباحثين الحصول علي مواقع اضافيه/أدوات للتحقق من صحة النتائج الهامه. إذا كان هناك اي مشاكل مع التحليلات أو الخوارزميات ، يمكن للباحثين تحميل وأعاده تحليل البيانات لتصحيح الأخطاء أو استخدام مواقع/أدوات أخرى مع الإعدادات المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بتمويل البدء ، ومنحه بحوث كليه العلوم والرياضيات ، وجائزه دوره البحوث الصيفية ، وجائزه تمويل البحوث الاوليه من جامعه جورجيا الجنوبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 1:1000 Dilution |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 | ThermoFisher | FLBP6651 | Dissolved with ddH2O to make 1X PBS |
| Goat serum | Gibco | 16210064 | Serum |
| Embryo dish | Electron Microscopy Sciences | 70543-45 | Dissection Dish |
| Nutating mixers | Fisherbrand | 88861041 | Nutator |
| tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B | Dr. Wu-Min Deng at Florida State University | N/A | Fly stock |
| w*; UAS-mam.A | Bloomington Drosophila Stock Center | #27743 | Fly stock |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | #5905 | Fly stock |
| The PRECOG portal | Stanford University | precog.stanford.edu | Publicly accessible database of cancer expression datasets |
| CSIOVDB | Cancer Science Institute of Singapore | csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html | Microarray database used to study ovarian cancer |
| The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal | Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) | medical–genome.kribb.re.kr/GENT | Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues. |
| Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) | Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research | portals.broadinstitute.org/ccle | Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines |
| cBioPortal | Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) | cioportal.org | Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks |
| Zeiss 710 Inverted confocal microscope | Carl Zeiss | ID #M 210491 | Examination and image collection of fluorescently labeled specimens |
References
- Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
- Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21 (7), 702-712 (2019).
- Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43 (1), 70-76 (2019).
- Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
- Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
- Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
- Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 722-735 (2016).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5 (2), 207-216 (2000).
- Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7761-7774 (2001).
- Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9 (5), 837-854 (2019).
- Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1 (5), 466-476 (2002).
- Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17 (6), 4914-4920 (2019).
- Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
- Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2 (9), 470-489 (2013).
- Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324 (7344), 1018-1022 (2002).
- Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21 (8), 938-945 (2015).
- Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6 (41), 43843-43852 (2015).
- Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6 (269), (2013).
- Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004 (220), 6 (2004).
- Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
- Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132 (2), (2019).
- Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209 (5), 301-311 (1999).
- Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132 (19), 4299-4308 (2005).
- Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
- Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131 (13), 3169-3181 (2004).
