Summary
A bioinformática é uma maneira útil de processar conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem obter aplicações perspicazes e de forma eficiente e de forma rápida. Este artigo demonstra a utilização da bioinformática na pesquisa do câncer de ovário. Ele também valida com sucesso os achados de bioinformática através da experimentação.
Abstract
A sinalização de notch é uma via regulatória altamente conservada envolvida em muitos processos celulares. A desregulação desta via de sinalização muitas vezes leva à interferência com o desenvolvimento adequado e pode até resultar em iniciação ou progressão de cânceres em certos casos. Porque este caminho sere funções complexas e versáteis, pode ser estudado extensivamente com muitas aproximações diferentes. Destes, a bioinformática fornece um método de estudo inegavelmente econômico, acessível e amigável. A bioinformática é uma maneira útil de extrair informações menores de conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de várias abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem interpretar de forma rápida, confiável e eficiente esses grandes conjuntos de dados, produzindo aplicações perspicazes e descobertas científicas. Aqui, um protocolo é apresentado para a integração de abordagens bioinformáticas para investigar o papel da sinalização notch no câncer de ovário. Além disso, os achados bioinformática são validados por meio de experimentação.
Introduction
A via de sinalização notch é uma via altamente conservada que é importante para muitos processos de desenvolvimento dentro de organismos biológicos. Notch sinalização tem sido mostrado para desempenhar um papel significativo na proliferação celular e auto-renovação, e defeitos na via de sinalização Notch pode levar a muitos tipos de cânceres1,2,3,4,5,6. Em algumas circunstâncias, a via de sinalização notch tem sido associada ao crescimento do tecido e câncer, bem como a morte celular e supressão do tumor7. Vários receptores Notch (NOTCH 1-4) e co\u2012ativator Mastermind (MAML 1-3), todos com funções diversas, adicionam um nível adicional de complexidade. Quando o caminho de sinalização do entalhe for sofisticado nos termos das funções, seu caminho do núcleo é simples em uma base molecular8. Receptores de entalhe atuam como proteínas transmembranacompostas de regiões extracelulares e intracelulares9. Uma ligação para a região extracelular dos receptores Notch facilita a clivagem proteolítica, o que permite que o domínio intracelular Notch (NICD) seja liberado no núcleo. NICD, em seguida, liga-se a co\u2012activatetor Mastermind para ativar a expressão genética a jusante10.
Nos últimos anos, notch sinalização tem sido mostrado para desempenhar uma variedade de papéis na iniciação e progressão de vários tipos de cânceres em diferentes espécies6,11. Por exemplo, a sinalização de Notch tem sido associada à tumorigênese envolvendo o gene NOTCH1 humano12. Recentemente, os genes NOTCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind\u2012like protein 1 (MAML1), e um domínio dedesintegrina e metalloproteinase\u2012contendo genes de proteína 17 (ADAM17) mostraram-se fortemente associados ao câncer de ovário, especialmente com a má sobrevida geral dos pacientes13.
À medida que a quantidade de dados experimentais e associados ao paciente aumenta continuamente, a demanda por análise dos dados disponíveis também aumenta. Os dados disponíveis estão espalhados por publicações e podem fornecer descobertas inconsistentes ou até contraditórias. Com o desenvolvimento de novas tecnologias nas últimas décadas, como o sequenciamento de última geração, a quantidade de dados disponíveis cresceu exponencialmente. Embora isso represente avanços rápidos na ciência e oportunidades para a pesquisa biológica contínua, avaliar o significado dos dados disponíveis publicamente para resolver questões de pesquisa é um grande desafio14. Acreditamos que a bioinformática é uma maneira útil de extrair informações menores de conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de várias abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem interpretar de forma rápida, confiável e eficiente esses grandes conjuntos de dados, produzindo descobertas perspicazes. Essas descobertas podem variar desde a identificação de potenciais novos alvos de terapia medicamentosa ou biomarcadores de doenças, até tratamentos personalizados para pacientes15,16.
A bioinformática em si está evoluindo rapidamente, e as abordagens estão em constante mudança à medida que os avanços tecnológicos varrem a ciência médica e biológica. Atualmente, abordagens comuns de bioinformática incluem a utilização de bancos de dados e programas de software acessíveis ao público para analisar sequências de DNA ou proteínas, identificar genes de particular relevância ou importância e determinar a relevância de genes e produtos genéticos por meio da genômica funcional16. Embora o campo da bioinformática certamente não se limite a essas abordagens, elas são significativas para ajudar clínicos e pesquisadores a gerenciar dados biológicos para o benefício dos pacientes como um todo.
Este estudo tem como objetivo destacar vários bancos de dados importantes e seu uso para pesquisas sobre a via de sinalização Notch. NOTCH2, NOTCH3,e seu co\u2012activator MAML1 foram usados como exemplos para o estudo de banco de dados. Estes genes foram usados porque a importância do caminho de sinalização notch no câncer de ovário foi validada. Análises sistemáticas de dados recuperados confirmaram a importância da sinalização de Notch no câncer de ovário. Além disso, como a sinalização de Notch é bem conservada entre as espécies, confirmou-se que a superexpressão da Drosophila melanogaster NICD e Mastermind juntos pode induzir tumores nos ovários de Drosophila, apoiando os achados do banco de dados e o papel significativo e conservado da sinalização de Notch no câncer de ovário.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Previsão de resultados clínicos de perfis genômicos (PRECOG)
NOTA: O portal PRECOG (precog.stanford.edu) acessa dados disponíveis publicamente de 165 conjuntos de dados de expressão de câncer, incluindo níveis de expressão gênica e resultados clínicos do paciente17. Ele fornece especificamente a análise Meta\u2012Z, que incorpora grandes conjuntos de dados para fornecer Z\u2012scores de genes diferentes em 39 tipos de câncer para indicar a sobrevivência geral do paciente. As taxas de sobrevivência pobres e boas são indicadas por valores positivos e negativos de Z\u2012score, respectivamente.
- Crie uma conta com um e-mail afiliado acadêmico para acessar esse banco de dados. Digite o endereço de e-mail e senha associada com a conta.
- Clique no botão Detalhes de Visualização localizado embaixo do título de análise Meta-Z.
- Insume o gene do interesse na barra da busca.
- Use a barra de rolagem localizada na parte inferior da tela para obter a sobrevivência Z-score para o tipo específico de câncer de interesse.
2. CSIOVDB CSIOVDB
NOTA: CSIOVDB(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html)é um banco de dados de microarray desenvolvido pelo Cancer Science Institute of Singapore para estudar o câncer de ovário18. Este banco de dados contém dados de carcinomas de diferentes locais tumorais, bem como dados normais do tecido do ovário. Além disso, o CSIOVDB fornece parcelas de sobrevivência Kaplan\u2012Meier para avaliar a sobrevivência do paciente com níveis diferenciais de expressão gênica. Csiovdb pode ser aplicado para investigar a associação entre os níveis de expressão gênica e estágios/notas de câncer de ovário.
- Insumo gene de interesse, em seguida, clique no botão de pesquisa.
- Clique na guia estado da doença.
NOTA: Esta guia fornece estatísticas sumárias da expressão gênica do gene-alvo de interesse em estados de doença do câncer de ovário. - Clique na guia Histologia.
NOTA: Esta guia fornece estatísticas sumárias da expressão gênica do gene-alvo de interesse em grandes histologias de câncer de ovário. - Clique na aba Clinico-patológico parâmetros.
NOTA: Esta guia fornece uma comparação dos níveis de expressão gênica entre diferentes estágios de câncer de ovário, notas e respostas clínicas com testes Mann-Whitney. - Clique na aba Survival.
NOTA: Esta guia fornece parcelas Kaplan-Meier associadas com a sobrevivência global e sobrevivência livre de doenças. Para este banco de dados, a sobrevida livre de doenças é considerada a sobrevivência livre de progressão e recorrência18. Análises multivariadas para sobrevivência global e sobrevivência livre de doenças também são encontradas esta guia. As análises multivariadas comparam características relacionadas ao prognóstico do câncer de ovário (estágio, grau, desmaioria cirúrgico, histologia, idade) e o gene de interesse. - Clique na aba Subtype.
NOTA: Esta guia fornece estatísticas sumárias e testes Mann-Whitney para o nível de expressão do gene de interesse em subtipos moleculares de câncer de ovário. Esta guia também fornece parcelas Kaplan-Meier associadas com a sobrevivência global e sobrevivência livre de doenças do gene de interesse em subtipos moleculares de câncer de ovário.
3. Expressão gênica em tecido normal e tumoral (GENT)
NOTA: O portal GENT (médico\u2012genome.kribb.re.kr/GENT) é desenvolvido e mantido pelo Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)19. Ele coleta 16.400 (U133A; 241 conjuntos de dados) e 24.300 (U133plus2; 306 conjuntos de dados) amostras disponíveis publicamente. Após a padronização, o GENT oferece dados de expressão gênica em diversos tecidos, que são ainda mais divididos em tumores e tecidos normais.
- Clique na guia de pesquisa na parte superior da tela.
- Na seção rotulada 1. Palavra-chave, selecione o símbolo gene para os termos do menu dropdown, entrada do símbolo genético do gene de interesse na área em branco da seção palavra-chave, e selecionar tecido para a opção tipo.
- Clique no botão de pesquisa na parte inferior do 1. Seção de palavras-chave. Ele mostra os gráficos sumários da expressão gênica em tecidos normais e tumorais de diferentes tipos de câncer com base nas plataformas U133A e U122Plus2.
NOTA: É opcional selecionar a opção de filtragem de dados na parte superior do gráfico sumário para destacar um banco de dados específico para estudar. - Clique no link ao lado do Download de Dados de Resultado para acessar as informações detalhadas sobre os valores de expressão gênica, tipos de tecidos e fontes de dados.
4. Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) 4. Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)
NOTA: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) foi criado pelo Instituto Broad e fornece perfis genômicos e mutações de 947 linhas de células cancerosas humanas20.
- Insira os genes desejados na barra de pesquisa e, em seguida, clique no botão de pesquisa.
- Na seção rotulada Select Dataset,clique na opção de expressão mRNA (RNAseq) do menu de desistente.
NOTA: Outras opções incluem expressão mRNA (Affy), knockdown de Aquiles shRNAe número de cópia. - Clique no botão Toggle All Traces. Selecione o tipo de tecido de interesse da caixa cinza à direita. Desça para a parte inferior da tela e clique no botão de expressão Download mRNA.
- Abra o documento de texto baixado. Copiar e colar todo o texto na Folha 1. Copiar todo o texto na Folha 1.
- Clique na folha na conta de software de planilha Folha 2 na parte inferior da planilha. Clique à direita na coluna A, selecione Colar Especiale, em seguida, selecione a opção Transpose na Folha 2.
- Uma vez que o texto é transposto em duas colunas na Folha 2,clique na seta de queda para a posição da opção Sort & Filter e, em seguida, selecione a opção Filtro. Uma seta aparecerá na área de posição rotulada gene. Clique na seta e digite o tipo de tecido de interesse.
NOTA: Esta etapa filtrará todos os dados e indicará somente níveis da expressão do gene para o tipo do tecido de interesse.
5. cBioPortal 5. cBioPortal
NOTA: cBioPortal (www.cioportal.org) foi desenvolvido no Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), e acessa, analisa e visualiza dados genômicos de câncer em grande escala21,22. Especificamente, este portal permite aos pesquisadores procurar alterações genéticas e redes de sinalização.
- Usando a consulta na página de destino, clique nos órgãos/tecidos de interesse a seção rotulada de Estudos Selecionados. Selecione o estudo particular do interesse, a seguir aperte a pergunta pela tecla do gene.
- Na seção rotulada Select Genomic Profiles, selecione entre as três opções: Mutações, alterações putativas de números de cópia do GISTIC,ou expressão de mRNA. Selecione ainda mais os dados correspondentes do menu de entrega para o conjunto de pacientes/casos selecionados.
- Digite o símbolo do gene alvo (s) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão de consulta de envio.
- Clique na aba Network no topo da página para recuperar a rede de genes desejada.
NOTA: A rede de sinalização é codificada por cores. Os genes introduzidos são indicados por nós de sementes com uma borda grossa. Cada gene é representado por um círculo vermelho, e a intensidade da cor do círculo vermelho reflete sua freqüência da mutação. Os genes são conectados por linhas de cores diferentes. Linhas marrons significam "In Same Component", indicando o envolvimento no mesmo componente biológico. Linhas azuis significam "Reage com", indicando reações gênicas. Linhas verdes significam "Mudança de Estado", sugerindo que um gene pode causar uma mudança de estado de outro gene. - Clique na aba Arquivo na parte superior da imagem para escolher Save as Image (PNG) para download de imagem de rede.
6. Dissecação de Drosophila com genótipos desejados e manchas DAPI
NOTA: Recolher a Drosophila feminino com os genótipos desejados, em seguida, dissecar os ovários de mosca para se submeter aos procedimentos de coloração DAPI para imagem.
- Prepare estoques de mosca tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w*; UAS-mam.A; e w[1118] para criar moscas com NICD-superexpressão (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+e NICD e mam-superexpressão(tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; Capacidade UAS-NICD-GFP/+.
- Aplique a técnica de segmentação de expressão gênica temporal e regional (TARGET) para controlar a expressão gênica espaçotemporal23. Levante as moscas a 18 °C até a idade adulta, em seguida, mude para 29 °C para 48 h com levedura antes da dissecação.
NOTA: tj-Gal4 só pode conduzir a expressão uas temperaturas mais elevadas, quando a inibição por Gal80ts é aliviado. A adição de levedura antes da dissecação amplia os ovários para a colheita. - Coloque 3 mL de sisina 1x fosfato -buffered (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) em um prato de coleta de embriões. Use um bloco de CO2 para anestesiar as moscas.
- Escolha uma mosca fêmea, em seguida, pegue cuidadosamente o tórax inferior da mosca usando um par de fórceps dissecando e submergi-lo na solução PBS 1x em um prato de coleta de embriões. Use um segundo par de fórceps para beliscar o abdômen inferior e puxe suavemente para liberar os órgãos internos.
- Identifique e desaconda o par de ovários do corpo da mosca. Quebre a bainha muscular localizada na extremidade posterior dos ovários e separe os ovarioles.
NOTA: Separar os ovarioles e quebrar a bainha muscular é necessário, a fim de alcançar resultados de coloração de maior qualidade. - Coloque os ovários em um tubo de centrífuga de 1,5 mL que contém 500 μL de 1x PBS. O tubo deve permanecer no gelo até que todos os ovários sejam coletados.
- Retire o PBS 1x e coloque 0,5 mL de solução de correção (4% de formaldeído) no tubo. Coloque o tubo no nutator por 10 min.
- Retire a solução de correção do tubo e descartá-lo em um recipiente de resíduos adequado. Use 1 mL de 1x PBT (1x PBS complementado com 0,4% Triton™ X-100) para lavar os ovários 3x por 15 min.
- Descarte a lavagem final de PBT e adicione 1 mL de PBTG (albumina de soro bovina de 0,2%, 5% soro de cabra normal em 1x PBT) para evitar a ligação inespecífica.
NOTA: Esta etapa poderia ser ignorada para a coloração DAPI, mas é essencial para a coloração de anticorpos. A coloração detalhada da imunohistoquímica pode ser encontrada em Jia eoutros24. - Coloque 150 μL de DAPI (10 μg/mL) no tubo por 10 a 15 minutos de noz., Descarte o DAPI e lave os ovários 1x por 10 min usando 1 mL de 1x PBT. Retire o PBT e lave 2x por 10 min usando 1x PBS.
- Remova o excesso de PBS até que aproximadamente 300 μL de PBS permaneça no tubo com os ovários. Pipet os ovários para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta 200 μL, a fim de libertar as câmaras de ovos.
- Gire delicadamente abaixo do tubo e remova com cuidado tanta solução de PBS 1x como possível sem remover os ovário. Coloque 120 μL de solução de montagem (1 g de gallate n-propyl, 5 ml de 10X PBS, 40 ml de glicerol e 5 ml de dH2O) no tubo.
NOTA: A solução de montagem é pegajosa, por isso é difícil transferir exatamente 120 μL de solução de montagem em um tubo. Para aliviar este problema, uma ponta pipette de 1.000 μL pode ser usada para adicionar três gotas de solução de montagem no tubo. - Retire aproximadamente 0,33 mm de uma ponta de pipeta de 200 μL e use a ponta da pipeta recém-cortada para colocar a solução de montagem em um slide de vidro do microscópio.
- Coloque suavemente o vidro coverslip na solução de montagem e selar as bordas do deslizamento de tampa com esmalte transparente.
NOTA: Selar as bordas do vidro de tampa é necessário impedir que as câmaras do ovo fluam dentro da solução da montagem ao tomar imagens confocal. - Adquirir imagens com microscópio confocal usando as seguintes configurações: lente objetiva = ampliação de 10x; abertura numérica = 0,8; Comprimento de onda de emissão da DAPI = 410-513 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando o procedimento mencionado na etapa 1 utilizando o portal PRECOG, foram obtidos os escores Z de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 em câncer de ovário (1,3, 2,32, 1,62, respectivamente). Os valores negativos de Z\u2012score indicam a sobrevivência global pobre dos pacientes com níveis elevados da expressão dos três genes. Usando a formatação condicional do software de planilha, os valores z\u2012score são mostrados em um gráfico de barra colorido na Figura 1.
O banco de dados CSIOVDB foi utilizado para confirmar os resultados. Usando as instruções na etapa 2, NOTCH2, NOTCH3,e MAML1 foram sequencialmente inseridos na área de pesquisa do banco de dados CSIOVDB, e os dados de sobrevivência do paciente localizados a guia Survival foram recuperados. Além dos dados gerais de sobrevivência, o CSIOVDB fornece sobrevivência sem doenças. Csiovdb separa ainda mais os pacientes para apresentar os dados de sobrevivência com base no Q1 vs Q4 (quartil inferior vs quartil superior) dos níveis de expressão gênica. Consistente com os resultados anteriores, alta expressão de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 correlacionam-se com a má sobrevida global e a sobrevivência livre de doenças(Figura 2A,B). Enquanto isso, a guia Clinico-patológico parâmetros do CSIOVDB também fornece uma comparação dos níveis de expressão gênica entre diferentes estágios de câncer de ovário, graus e respostas clínicas com testes Mann-Whitney. Os resultados mostram que níveis mais elevados de expressão de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 estão associados a estágios avançados de câncer de ovário(Figura 2C).
Como notch2, NOTCH3e MAML1 são críticos para a sobrevivência geral do paciente, os níveis de expressão gênica em tumores ovarianos e linhas de células cancerosas foram investigados ainda mais. Os dados de expressão de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 em tecidos ovarianos normais e tumorais foram baixados da plataforma U133A usando as instruções de etapa 3 para GENT. Os cientistas podem processar os dados baixados de acordo com sua própria finalidade específica da pesquisa. Aqui, utilizamos os dados para produzir as parcelas de caixa e bigode usando o GraphPad Prism (versão 8). Outros testes de permutação sugeriram que NOTCH2, NOTCH3e MAML1 são altamente expressos nos tecidos tumorais (Figura 3A). Em seguida, os dados de expressão de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 em linhas de células de câncer de ovário foram baixados de acordo com o protocolo passo 4, usando CCLE. Os níveis de expressão gênica nas linhas celulares cancerosas são mostrados pelas parcelas de caixa e bigode(Figura 3B). Mesmo que os níveis de expressão de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sejam elevados em linhas de células cancerosas, as conclusões não podem ser tiradas devido à falta de controles normais da linha celular no banco de dados ccle. No entanto, os cientistas podem identificar a origem das linhas de células cancerosas e comparar os níveis de expressão com base em diferentes graus, estágios e outros parâmetros clinicopatológicos.
Uma vez confirmada a importância de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 no câncer de ovário, o cBioPortal foi utilizado para estudar sua rede de sinal associada. Usando o protocolo passo 5, Ovário / Tíope Tube foi selecionado para Estudos Selecionados, em seguida, o Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) conjunto de dados foi escolhido para análise. Para a seção rotulada Select Genomic Profiles, a expressão mRNA foi selecionada e, finalmente, seu perfil mRNA expressão Z-scores (todos os genes). Para a seção Select Patient/Case Set,as amostras com dados mRNA (Microarray Agilent) (489) opção foi escolhida a partir do menu de desistente. Ao final, os genes NOTCH2, NOTCH3e MAML1 foram selecionados para enviar a consulta. Com base nos três genes centrais, uma rede de sinalização foi criada para fornecer os 50 genes vizinhos mais frequentemente alterados, que também estão na mesma via com as maiores taxas de mutação (Figura 4).
Como a sinalização de Notch é bem conservada entre as espécies, foi investigada no câncer de ovário drosophila. Notch sinalização já foi relatado para regular a proliferação de células folículos25, diferenciação26,27,e regulação do ciclo celular28,29. A superexpressão do NICD por si só não induz tumores em Drosophila (Figura 5A),já que o epitélio das câmaras de ovos de Drosophila permaneceu intacto com uma única camada. No entanto, a superexpressão de NICD e Mam juntos induziram tumores em Drosophila (Figura 5B), que é demonstrada por múltiplas camadas epiteliais e células acumuladas.
Figura 1: Expressão de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 no câncer de ovário está associada à baixa sobrevida global. A sobrevivência Z-scores de NOTCH2, NOTCH3,e MAML1 em pacientes com câncer de ovário são apresentados. A má sobrevivência é indicada por valores negativos de Z\u2012score. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Altos níveis de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 no câncer de ovário estão associados à má sobrevida global, má sobrevida livre de doenças e estágios avançados de câncer. O banco de dados de microarray CSIOVDB fornece kaplan-meier sobrevivência global e parcelas de sobrevivência livre de doenças de NOTCH2, NOTCH3,e MAML1 em pacientes com câncer de ovário, e os níveis de expressão gênica em diferentes estágios de câncer. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: NOTCH2, NOTCH3,e MAML1 são altamente expressos em tumores ovarianos e linhas de células cancerosas. Os valores p são indicados para comparar a expressão gênica em ovários normais e tumores ovarianos correspondentes. (Abreviaturas: Ovário-N = tecidos ovários normais; Ovário-C = tecidos de câncer de ovário). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: OS genes NOTCH2/NOTCH3/ MAML1 e sua rede de sinalização associada com os 50 genes vizinhos mais frequentemente alterados. A rede de sinalização é codificada por cores. Os genes introduzidos são indicados por nós de sementes com uma borda grossa. Cada gene é representado por um círculo vermelho, e a intensidade da cor do círculo vermelho reflete sua freqüência da mutação. Os genes são conectados por linhas de cores diferentes. Linhas marrons significam "In Same Component", indicando o envolvimento no mesmo componente biológico. Linhas azuis significam "Reage com", indicando reações gênicas. Linhas verdes significam "Mudança de Estado", sugerindo que um gene pode causar uma mudança de estado de outro gene. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: NICD e mam em Drosophila também induzem tumores ovarianos. R. A superexpressão do NICD por si só não induz a formação tumoral em Drosophila. B. Superexpressão de NICD e mam juntos induzir tumores em Drosophila. Barra de escala = 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Como existem inúmeras abordagens e métodos para a utilização de bioinformática, existem inúmeros bancos de dados disponíveis on-line para o público em geral. Uma abundância de informações pode ser extraída de cada um desses bancos de dados, mas algumas são mais adequadas para fins específicos, como avaliar a sobrevida do paciente com base em certas entradas. Análises sistemáticas de dados recuperados de diferentes bancos de dados individuais podem produzir resultados científicos importantes de forma convincente.
A análise atual se concentra no papel da sinalização de Notch no câncer de ovário através da utilização de abordagens de bioinformática. Por exemplo, a análise meta-z no banco de dados do portal PRECOG foi usada para obter pontuações Z que indicam resultados de sobrevida do paciente em estudos clínicos de câncer. CSIOVDB é outro banco de dados de meta-análise que foi usado para estudar os resultados de sobrevida de pacientes com câncer de ovário. Os dados do CSIOVDB validaram com sucesso os resultados do portal PRECOG de que NOTCH2, NOTCH3e MAML1 são fundamentais para a sobrevida geral do paciente. Mais tarde, as aplicações dos bancos de dados GENT e CCLE demonstraram ainda que NOTCH2, NOTCH3e MAML1 são altamente expressos em tumores ovarianos e linhas de células cancerosas. A combinação desses bancos de dados revelou sistematicamente os papéis significativos de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 no câncer de ovário. Esse uso de métodos de bioinformática forneceu uma maneira eficiente de fazer pesquisas sobre o câncer de forma econômica e mostra como ele pode produzir resultados importantes para futuras aplicações experimentais e clínicas.
A Bioinformática fornece ao público a capacidade de acessar os resultados de milhares de experimentos de uma só vez. As informações derivadas de bancos de dados públicos fornecem uma maneira econômica e eficiente de estabelecer um projeto experimental antes de realizar experimentos. Além disso, é importante notar que os dados disponíveis publicamente podem ser espalhados por publicações e podem fornecer achados inconsistentes ou até contraditórios, o que requer que as metaanálises sejam realizadas por meio de abordagens de bioinformática. Os cientistas podem projetar e realizar experimentos com base nos dados encontrados através de grandes bancos de dados de bioinformática para validar hipóteses científicas específicas. Os resultados do experimento Drosophila confirmaram os resultados dos bancos de dados de bioinformática e apoiaram ainda mais a idéia de que os componentes da via Notch devem continuar a ser investigados como potenciais alvos de drogas terapêuticas. A validação bem-sucedida de achados bioinformática por meio da experimentação também sugere a importância das abordagens de bioinformática para descobertas científicas.
Pode haver algumas limitações da bioinformática. Primeiro, alguns sites/ferramentas podem não atualizar suas descobertas devido a esforços de tempo ou custos associados à manutenção. Em segundo lugar, alguns sites/ferramentas atualizam constantemente, mas a atualização com entrada adicional pode alterar os resultados obtidos anteriormente. Em terceiro lugar, os desenvolvedores de alguns sites/ferramentas reservam direitos autorais e restringem o uso de seu conteúdo. Em quarto lugar, análises ou algoritmos de determinados sites/ferramentas nem sempre podem ser precisos.
Para superar essas limitações, algumas etapas ou modificações e solução de problemas para melhores aplicações futuras são sugeridas. Primeiro, alguns sites/ferramentas permitem que os pesquisadores carreguem manualmente novos dados para análise. Se não, os pesquisadores podem baixar e analisar os dados mais recentes por conta própria. Em segundo lugar, os pesquisadores precisam executar repetidamente suas análises e manter o registro das datas. Se os resultados mudarem significativamente, os pesquisadores talvez precisem usar a entrada adicional de dados para descobrir as razões. Em terceiro lugar, os pesquisadores podem encontrar um site alternativo / ferramenta para executar suas análises para evitar potenciais problemas de direitos autorais. Em quarto lugar, os pesquisadores podem obter sites/ferramentas adicionais para validar suas descobertas importantes. Se houver algum problema com análises ou algoritmos, os pesquisadores podem baixar e reanalisar os dados para corrigir os erros ou usar outros sites/ferramentas com as configurações apropriadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Start-Up Funding, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award e Research Seed Funding Award da Georgia Southern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 1:1000 Dilution |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 | ThermoFisher | FLBP6651 | Dissolved with ddH2O to make 1X PBS |
| Goat serum | Gibco | 16210064 | Serum |
| Embryo dish | Electron Microscopy Sciences | 70543-45 | Dissection Dish |
| Nutating mixers | Fisherbrand | 88861041 | Nutator |
| tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B | Dr. Wu-Min Deng at Florida State University | N/A | Fly stock |
| w*; UAS-mam.A | Bloomington Drosophila Stock Center | #27743 | Fly stock |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | #5905 | Fly stock |
| The PRECOG portal | Stanford University | precog.stanford.edu | Publicly accessible database of cancer expression datasets |
| CSIOVDB | Cancer Science Institute of Singapore | csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html | Microarray database used to study ovarian cancer |
| The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal | Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) | medical–genome.kribb.re.kr/GENT | Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues. |
| Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) | Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research | portals.broadinstitute.org/ccle | Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines |
| cBioPortal | Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) | cioportal.org | Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks |
| Zeiss 710 Inverted confocal microscope | Carl Zeiss | ID #M 210491 | Examination and image collection of fluorescently labeled specimens |
References
- Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
- Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21 (7), 702-712 (2019).
- Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43 (1), 70-76 (2019).
- Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
- Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
- Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
- Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 722-735 (2016).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5 (2), 207-216 (2000).
- Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7761-7774 (2001).
- Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9 (5), 837-854 (2019).
- Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1 (5), 466-476 (2002).
- Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17 (6), 4914-4920 (2019).
- Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
- Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2 (9), 470-489 (2013).
- Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324 (7344), 1018-1022 (2002).
- Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21 (8), 938-945 (2015).
- Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6 (41), 43843-43852 (2015).
- Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6 (269), (2013).
- Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004 (220), 6 (2004).
- Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
- Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132 (2), (2019).
- Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209 (5), 301-311 (1999).
- Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132 (19), 4299-4308 (2005).
- Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
- Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131 (13), 3169-3181 (2004).
