Cytofast er et visualiseringsværktøj, der bruges til at analysere output fra klyngedannelse. Cytofast kan bruges til at sammenligne to metoder til klyngedannelse: Flowsom og cytosplore. Cytofast kan hurtigt generere en kvantitativ og kvalitativ oversigt over massecytometri data og fremhæve de vigtigste forskelle mellem forskellige klynge algoritmer.
Kompleksiteten af data genereret af massecytometri har nødvendiggjort nye værktøjer til hurtigt at visualisere analytiske resultater. Klyngedannelse metoder som Cytosplore eller flowsom bruges til visualisering og identifikation af celle klynger. For downstream analyse, en nyudviklet R-pakke, Cytofast, kan generere en hurtig visualisering af resultater fra klyngedannelse metoder. Cytofast tager hensyn til fænotypiske karakterisering af celle klynger, beregner celle klyngens overflod, derefter kvantitativt sammenlignes grupper. Denne protokol forklarer anvendelser af Cytofast til anvendelse af massecytometri data baseret på graduering af immunsystemet i tumor mikromiljø (dvs. den naturlige Killer [NK] celle respons) på tumor udfordring efterfulgt af immunterapi (PD-L1 blokade). Påvisning af nytten af Cytofast med Flowsom og cytosplore er vist. Cytofast genererer hurtigt visuelle repræsentationer af gruppe relaterede immuncelle klynger og korrelationer med immunsystemets sammensætning. Der observeres forskelle i klynge analysen, men adskillelsen mellem grupperne er synlig med begge klynge metoder. Cytofast viser visuelt de mønstre INDUCERET af PD-L1-behandling, der omfatter en højere overflod af aktiverede NK-celle undersæt, hvilket udtrykker en højere intensitet af aktiverings markører (dvs., CD54 eller CD11c).
Masse cytometri (cytometri ved time-of-Flight, eller CyTOF) giver mulighed for påvisning af en bred vifte af intracellulære eller ekstracellulære biomarkører i millioner af enkeltceller. Den høje dimensionelle karakter af massecytometri data nødvendiggør visse analyseværktøjer, såsom celle klynge teknikker som spade1, flowmaps2, flowsom3, phenograph4, VorteX5og stilladser kort6. Desuden er forskellige dimensionalitets reduktions baserede teknikker blevet udviklet (dvs. vigtigste komponent analyse [PCA]7, t-distribueret stokastisk nabo indlejring [t-sne]8, hierarkisk stokastisk nabo indlejring [hsne]9, ensartet manifold tilnærmelse og projektion [UMAP]10, og diffusion Maps11) for at forbedre hastigheden, fortolkning og visualisering af High-dimensionelle datasæt.
Downstream-analyse af højdimensionale flow og masse cytometriske data mangler ofte automatiske processer til at udføre statistiske tests på klynge frekvens og forbindelser med kliniske resultater. Tidligere udviklede vi en R-baseret arbejdsgang kendt som cytofast12, som giver mulighed for visuelle og kvantitative downstream analyser af klyngedannelse teknikker ved cytosplore eller flowsom.
Den protokol, der er beskrevet her, tydeliggør brugen af Cytofast i R og viser, hvordan man genererer kvantitative og kvalitative Heatmaps og grafer. Desuden letter det bestemmelsen af forbindelser mellem observerede immun fænotyper og kliniske resultater. Denne rapport beskriver også analysen af et specifikt massecytometri-datasæt ved hjælp af to forskellige klynge procedurer: Flowsom og cytosplore. Ved at bruge Cytofast med begge klynge metoder er det tilsvarende vist, at aktiverings Fænotypen af NK-celler påvirkes af PD-L1-immun kontrolpunkts blokade.
Cytofast er et hurtigt beregningsmæssige værktøj, der giver en hurtig og global udforskning af cytometriske data ved at fremhæve og kvantificere behandlings specifikke celle undersæt. Den beskrevne protokol har til formål at viderebehandle klynge analyser med Cytosplore eller flowsom. Andre analyseværktøjer til klyngedannelse er velegnede til cytofast, men dette kræver brug af cytofast for at tildele hver celle til en delmængde. Cytofaster imidlertid ikke en klynge metode, og kræver derfor klynge procedurer før brug.
Den analyse, der blev udført her, viste, at visse CD161+ NK-celle undersæt i Tumorens mikromiljø var følsomme over for en PD-L1-blokade. Dette fremgik af ændringer i deres fænotype og overflod, som blev observeret ved hjælp af både Cytosplore og flowsom som klyngedannelse metoder. Begge metoder udmærker de vigtigste NK celle klynge (CD11b+ NKG2A+) med lidt forskellige frekvenser (15% – 20% for cytosplore, 30% – 40% for flowsom). Forskellene i overflod og denne tilnærmelse påvirkede ikke det globale mønster, fordi begge dendrogrammer vises i de rigtige paneler i figur 2 og figur 3 viste lignende resultater. Ved at bruge Cytofaster det således muligt (uafhængigt af den valgte klynge metode) at UDSKILLER PD-L1-behandlede og ubehandlede mus baseret på analyser af NK-celle klynge fænotype og overflod.
Afhængigt af de registrerede parametre er der behov for ændringer af protokollen. Specifikt, visse parametre såsom tid og baggrund skal fjernes, mens du udfører klyngedannelse analyse. Desuden er det vigtigt, at hver celle er tildelt til en delmængde. Funktionen cfData vil blot tilføje RAW-celletal pr. klynge pr. prøve i cfList. Fra dette trin kan cytoheatmap bygges som forklaret i afsnit 3.
Cytofast er med held blevet brugt som et visualiserings-og kvantificerings værktøj til at sammenligne forskellige klynge metoder13. Denne R-pakke er også kompatibel med avancerede funktioner, såsom globaltest14, som kan teste foreninger mellem grupper af klynger ved hjælp af kliniske variabler. I fremtiden kan det globale test værktøj og andre algoritmer integreres med cytofast for mere dybtgående visualisering og kvantificering.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender midler fra Europa-Kommissionen til en MSCA-pris for Horisont 2020 under forslag nummer 675743 (ISPIC). Vi takker Tetje van der Sluis og iris Pardieck for at afprøve protokollen.