Cytofast er et visualiseringsverktøy som brukes til å analysere utdata fra klynger. Cytofast kan brukes til å sammenligne to klynge metoder: FlowSOM og Cytosplore. Cytofast kan raskt generere en kvantitativ og kvalitativ oversikt over masse flowcytometri data og fremheve de viktigste forskjellene mellom ulike klynger algoritmer.
Kompleksiteten av data generert av masse flowcytometri har nødvendig nye verktøy for å raskt visualisere analytiske utfall. Klynger metoder som Cytosplore eller FlowSOM brukes for visualisering og identifisering av celle klynger. For nedstrøms analyse, en nyutviklet R-pakke, Cytofast, kan generere en rask visualisering av resultater fra klynger metoder. Cytofast tar hensyn til fenotypiske karakterisering av celle klynger, beregner celle klyngen overflod, så kvantitativt sammenligner grupper. Denne protokollen forklarer anvendelser av Cytofast til bruk av masse flowcytometri data basert på modulering av immunsystemet i tumor mikromiljøet (dvs. den naturlige MORDEREN [NK] celle respons) på tumor utfordring etterfulgt av IMMUNTERAPI (PD-L1 blokade). Demonstrasjon av nytten av Cytofast med FlowSOM og Cytosplore vises. Cytofast genererer raskt visuelle representasjoner av gruppe-relaterte immun celle klynger og sammenhenger med immunsystem sammensetning. Forskjeller er observert i klynge analysen, men skille mellom grupper er synlige med både klynge metoder. Cytofast visuelt viser mønstrene indusert av PD-L1 behandling som inkluderer en høyere overflod av aktivert NK celle delsett, uttrykker en høyere intensitet av aktiverings markører (dvs. CD54 eller CD11c).
Masse flowcytometri (flowcytometri av tid-av-flyreise, eller CyTOF) innrømmer oppdagelsen av en rikt utvalg av intracellulære eller ekstracellulære biomarkører inne millioner av enkeltceller. De tredimensjonale egenskapene til masse flowcytometri data nødvendiggjør visse analyseverktøy, for eksempel celle klynge teknikker som SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5og stillas kart6. I tillegg har ulike dimensionality reduksjon-baserte teknikker er utviklet (dvs. rektor komponent analyse [PCA]7, t-distribuerte Stokastisk nabo embedding [t-sne]8, hierarkiske STOKASTISK nabo embedding [HSNE]9, UNIFORM manifold tilnærming og projeksjon [UMAP]10, og diffusjon kart11) for å forbedre hastigheten, tolkning og visualisering av høy-dimensjonale datasett.
Nedstrøms analyse av høy-dimensjonal flyt og masse analytiske data ofte mangler automatiske prosesser for å utføre statistiske tester på klynge frekvens og koblinger med kliniske utfall. Tidligere har vi utviklet en R-basert arbeidsflyt kjent som Cytofast12, som gir mulighet for visuell og kvantitativ nedstrøms analyser av klynger teknikker av Cytosplore eller FlowSOM.
Protokollen beskrevet her klargjør bruken av Cytofast i R og viser hvordan du kan generere kvantitative og kvalitative heatmaps og grafer. Videre forenkler det fastsettelse av forbindelser mellom observerte immun fenotyper og kliniske utfall. Denne rapporten beskriver også analysen av et bestemt masse flowcytometri datasett ved hjelp av to forskjellige klynge prosedyrer: FlowSOM og Cytosplore. Ved å bruke Cytofast med både Clustering metoder, er det tilsvarende vist at aktiveringen FENOTYPE av NK celler er påvirket av PD-L1 immune Checkpoint blokade.
Cytofast er en rask beregningsorientert verktøy som gir en rask og global utforskning av analytiske data ved å markere og kvantifisere behandling-spesifikke cellulære delsett. Protokollen beskrevet tar sikte på å videre behandle Clustering analyser med Cytosplore eller FlowSOM. Andre klynge analyseverktøy er egnet for Cytofast, men dette krever bruk av Cytofast for å tilordne hver celle til et delsett. Cytofaster imidlertid ikke en klynge metode, og krever derfor klynge prosedyrer før bruk.
Analysen utført her viste at visse CD161+ NK celle delsett i tumor mikromiljøet var følsomme for en PD-L1 blokade. Dette var dokumentert av endringer i deres fenotype og overflod, som ble observert ved hjelp av både Cytosplore og FlowSOM som Clustering metoder. Begge metodene skilte de viktigste NK celle klyngen (CD11b+ NKG2A+) med litt forskjellige frekvenser (15%-20% for Cytosplore, 30%-40% for FlowSOM). Forskjellene i overflod og denne tilnærmingen ikke påvirke det globale mønsteret, fordi begge dendrograms vises i høyre paneler av figur 2 og Figur 3 viste lignende resultater. Ved å bruke Cytofast, er det dermed mulig (uavhengig av Clustering metoden valgt) til skille PD-L1-behandlet og ubehandlet mus basert på analyser av NK celle klynge fenotype og overflod.
Avhengig av de registrerte parametrene, er endringer i protokollen nødvendig. Nærmere bestemt må enkelte parametere, for eksempel tid og bakgrunn, fjernes når du utfører klynge analysen. I tillegg er det viktig at hver celle er tilordnet et delsett. CfData-funksjonen vil ganske enkelt legge til rå celle antall per klynge per prøve i cfList. Fra dette trinnet kan cytoheatmap bygges som forklart i avsnitt 3.
Cytofast har blitt brukt som en visualisering og kvantifisering verktøy for å sammenligne ulike Clustering metoder13. Denne R-pakken er også kompatibel med avanserte funksjoner, for eksempel globaltest14, som kan teste assosiasjoner mellom grupper av klynger ved hjelp av kliniske variabler. I fremtiden kan globaltest verktøyet og andre algoritmer integreres med Cytofast for mer dyptgående visualisering og kvantifisering.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner finansiering fra Europakommisjonen av en H2020 MSCA-pris under forslagsnummer 675743 (ISPIC). Vi takker Tetje Van der Sluis og Iris Pardieck for å teste protokollen.