Cytofast är ett visualiseringsverktyg som används för att analysera utdata från klustring. Cytofast kan användas för att jämföra två kluster metoder: Flowsom och cytosplore. Cytofast kan snabbt generera en kvantitativ och kvalitativ översikt av massan flödescytometrianalys data och belysa de viktigaste skillnaderna mellan olika klusteralgoritmer.
Komplexiteten av data som genereras av masscytometry har krävt nya verktyg för att snabbt visualisera analytiska resultat. Kluster metoder som Cytosplore eller flowsom används för visualisering och identifiering av cell kluster. För nedströms analys, ett nyutvecklat R-paket, Cytofast, kan generera en snabb visualisering av resultat från kluster metoder. Cytofast tar hänsyn till fenotypisk karakterisering av cell kluster, beräknar cell klustret överflöd, sedan kvantitativt Jämför grupper. Detta protokoll förklarar tillämpningarna av Cytofast till användningen av massa flödescytometrianalys data baserat på modulering av immunförsvaret i tumören mikromiljö (dvs, den naturliga mördaren [NK] cell Response) på tumör Challenge följt av immunterapi (PD-L1 blockad). Demonstration av nyttan av Cytofast med Flowsom och cytosplore visas. Cytofast genererar snabbt visuella representationer av grupprelaterade immun cells kluster och korrelationer med immunsystemets sammansättning. Skillnader observeras i klusteranalys, men separation mellan grupper är synliga med båda kluster metoder. Cytofast visuellt visar de mönster som INDUCERAS av PD-L1 behandling som omfattar ett högre överflöd av aktiverade NK cell undergrupper, uttrycker en högre intensitet av aktiverings markörer (dvs, CD54 eller CD11c).
Masscytometri (cytometri vid tiden för flygning, eller CyTOF) möjliggör detektion av ett brett spektrum av intracellulära eller extracellulära biomarkörer i miljontals enskilda celler. Den höga dimensionella karaktären hos masscytometry-data kräver vissa analysverktyg, till exempel cell klustertekniker som spade1, flowmaps2, flowsom3, fenograf4, VorteX5och byggnadsställning Maps6. Dessutom olika dimensionalitet reduktions tekniker har utvecklats (dvs., huvudsaklig komponent analys [PCA]7, t-distribuerad stokastisk granne inbäddning [t-sne]8, hierarkiska stokastiska granne inbäddning [hsne]9, enhetliga GRENRÖR tillnärmning och projektion [UMAP]10, och diffusion kartor11) för att förbättra hastighet, tolkning och visualisering av högdimensionella DataSet.
Nedströms analys av hög-dimensionell flöde och massa cytometriska data saknar ofta automatiska processer för att utföra statistiska tester på kluster frekvens och länkar med kliniska resultat. Tidigare utvecklade vi ett R-baserat arbetsflöde som kallas Cytofast12, vilket möjliggör visuella och kvantitativa nedströms analyser av klustertekniker av cytosplore eller flowsom.
Det protokoll som beskrivs här klargör användningen av Cytofast i R och visar hur man kan generera kvantitativa och kvalitativa heatmaps och grafer. Dessutom underlättar det bestämning av anslutningar mellan observerade immun fenotyper och kliniska utfall. Rapporten beskriver också analysen av en specifik masscytometry-datasetet med hjälp av två olika kluster procedurer: flowsom och cytosplore. Genom att använda Cytofast med båda kluster metoder, det är på motsvarande sätt visat att aktiveringen FENOTYP av NK-celler påverkas av PD-L1 immun kontrollpunkt blockad.
Cytofast är ett snabbt beräkningsverktyg som ger en snabb och global utforskning av cytometriska data genom att belysa och kvantifiera behandlingsspecifika cellulära undergrupper. Syftet med protokollet är att ytterligare bearbeta kluster analyser med Cytosplore eller flowsom. Andra klusteranalys verktyg lämpar sig för cytofast, men detta kräver användning av cytofast att tilldela varje cell till en delmängd. Cytofastär dock inte en kluster metod, och kräver därför kluster procedurer före användning.
Analysen utförs här visade att vissa CD161+ NK cell undergrupper i tumören mikromiljö var känsliga för en PD-L1 blockad. Detta styrdes av förändringar i deras fenotyp och överflöd, som observerades med både Cytosplore och flowsom som kluster metoder. Båda metoderna utmärkte huvud NK-cellsklustret (CD11b+ NKG2A+) med något olika frekvenser (15% – 20% för cytosplore, 30% – 40% för flowsom). Skillnaderna i överflöd och denna tillnärmning påverkade inte det globala mönstret, eftersom båda dendrograms visas i de högra panelerna i figur 2 och figur 3 visade liknande resultat. Genom att använda Cytofastär det möjligt (oberoende av den valda klustring metoden) att SEGREGERA PD-L1-behandlade och obehandlade möss baserat på analyser av NK cells kluster fenotyp och överflöd.
Beroende på de inspelade parametrarna behövs ändringar av protokollet. Specifika parametrar som tid och bakgrund måste tas bort när kluster analysen utförs. Dessutom är det viktigt att varje cell tilldelas en delmängd. CfData-funktionen lägger helt enkelt till de råa cell inventeringar per kluster per prov i cfList. Från detta steg kan cytoheatmap byggas som förklaras i avsnitt 3.
Cytofast har framgångsrikt använts som ett visualiserings-och kvantifieringsverktyg för att jämföra olika kluster metoder13. Detta R-paket är också kompatibelt med avancerade funktioner, till exempel globaltest14, som kan testa associationer mellan grupper av kluster med hjälp av kliniska variabler. I framtiden, den globaltest verktyg och andra algoritmer kan integreras med cytofast för mer djupgående visualisering och kvantifiering.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner finansieringen från Europeiska kommissionen av en Horisont 2020 MSCA Award enligt förslag nummer 675743 (ISPIC). Vi tackar Tetje van der Sluis och Iris Pardieck för att testa protokollet.