Summary
We beschrijven een platform dat gebruik maakt van een bibliotheek van isogene antibiotica resistente Escherichia coli voor de dereplicatie van antibiotica. De identiteit van een antibioticum dat door bacteriën of schimmels wordt geproduceerd, kan worden afgeleid uit de groei van E. coli , waarin het respectieve resistentie-gen wordt uitgesproken. Dit platform is economisch effectief en tijd efficiënt.
Abstract
Een van de belangrijkste uitdagingen bij het zoeken naar nieuwe antibiotica uit natuurlijke product extracten is de herontdekking van gemeenschappelijke verbindingen. Om deze uitdaging aan te pakken, wordt dereplication, dat is het proces van het identificeren van bekende verbindingen, uitgevoerd op monsters van belang. Methoden voor dereplicatie zoals analytische scheiding gevolgd door massaspectrometrie zijn tijdrovend en resource-intensieve. Om het dereplicatie proces te verbeteren hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP) ontwikkeld. De ARP is een bibliotheek met ongeveer 100 antibioticaresistentiegenen die individueel zijn gekloond tot Escherichia coli. Deze stam collectie heeft vele toepassingen, met inbegrip van een kosteneffectieve en facile methode voor antibioticum dereplication. Het proces omvat de fermentatie van antibiotica-producerende microben op het oppervlak van rechthoekige Petri schalen die een vast medium bevatten, waardoor de afscheiding en verspreiding van secundaire metabolieten via het medium mogelijk wordt. Na een fermentatie periode van 6 dagen wordt de microbiële biomassa verwijderd en wordt een dunne agar-overlay aan de Petri schaal toegevoegd om een glad oppervlak te creëren en de groei van de E. coli -indicator stammen mogelijk te maken. Onze verzameling van ARP-stammen wordt vervolgens vastgemaakt aan het oppervlak van de antibioticum bevattende Petri schaal. De plaat wordt vervolgens 's nachts geïnineerd om E. coli groei op het oppervlak van de overlay mogelijk te maken. Alleen stammen die resistentie tegen een specifiek antibioticum (of klasse) bevatten, groeien op dit oppervlak waardoor de geproduceerde stof snel geïdentificeerd wordt. Deze methode is met succes gebruikt voor de identificatie van producenten van bekende antibiotica en als middel om te identificeren die nieuwe verbindingen produceren.
Introduction
Sinds de ontdekking van penicillaire in 1928, natuurlijke producten afgeleid van milieu-micro-organismen hebben bewezen een rijke bron van antimicrobiële verbindingen1. Ongeveer 80% van de antibiotica van het natuurlijke product zijn afgeleid van bacteriën van het geslacht Streptomyces en andere Actinomyceten, terwijl de resterende 20% wordt geproduceerd door schimmelsoorten1. Enkele van de meest voorkomende antibiotica-steigers die in de kliniek worden gebruikt, zoals de β-lactams, tetracyclines, rifamycinen en aminoglycosiden, werden oorspronkelijk geïsoleerd van microben2. Vanwege de opkomst van multiresistente (MDR) bacteriën is ons huidige panel van antibiotica echter minder effectief geworden in de behandeling van3,4. Deze omvatten de "eskape" pathogenen (d.w.z. vancomycine-resistente enterokokken en β-lactam-resistente Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, en Enterobacter SP.), een subset van bacteriën die geacht worden geassocieerd te worden met het hoogste risico door een aantal grote volksgezondheidsinstanties zoals de Wereldgezondheidsorganisatie3,4,5. De opkomst en wereldwijde verspreiding van deze MDR-pathogenen resulteert in een constante behoefte aan nieuwe antibiotica3,4,5. Helaas hebben de voorbije twintig jaar aangetoond dat de ontdekking van nieuwe antibiotica uit microbiële bronnen steeds moeilijker wordt6. Huidige benaderingen van Drug Discovery omvatten de hoge doorvoer screening van bioactieve verbindingen, met inbegrip van natuurlijke product extract Bibliotheken, waardoor duizenden extracten worden getest op een gegeven moment2. Echter, zodra antimicrobiële activiteit wordt gedetecteerd, de volgende stap is het analyseren van de inhoud van het ruwe extract om de actieve component te identificeren en elimineren die met bekende of redundante verbindingen7,8. Dit proces, "dereplication" genoemd, is van vitaal belang om de tijd die aan de herontdekking van bekende antibiotica7,9wordt besteed, te voorkomen en/of aanzienlijk te verkorten. Hoewel een noodzakelijke stap in het opsporen van natuurlijke geneesmiddelen, dereplication is berukker bewerkelijk en resource-intensieve10.
Sinds Beutler et al. eerst bedacht de term "dereplication", uitgebreide inspanningen zijn gedaan om innovatieve strategieën voor de snelle identificatie van bekende antibiotica te ontwikkelen11,12. Vandaag de dag zijn de meest gebruikte instrumenten voor dereplicatie analytische chromatografische systemen zoals krachtige vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en op nucleaire magnetische resonantie gebaseerde detectiemethoden11,13. Helaas vereist elk van deze methoden het gebruik van dure analytische apparatuur en geavanceerde gegevens interpretatie.
In een poging om een dereplication methode te ontwikkelen die snel kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur, hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP)10opgericht. De ARP kan worden gebruikt voor de ontdekking van antibiotica-adjuvantia, de profilering van nieuwe antibiotica verbindingen tegen bekende resistentiemechanismen en de dereplicatie van bekende antibiotica in extracten afkomstig van actinobacteriën en andere microben. Hier, we richten ons op de toepassing ervan in antibioticum dereplication. De ARP gebruikt een bibliotheek van isogene Escherichia coli stammen die individuele resistentiegenen uitdrukken die effectief zijn tegen de meest in het algemeen opnieuw ontdekte antibiotica14,15. Wanneer de E. coli bibliotheek wordt geteeld in aanwezigheid van een secundaire metaboliet-producerende organisme, de identiteit van de compound kan worden afgeleid door de groei van e. coli stammen die de bijbehorende weerstand gen10uitdrukken. Toen de ARP voor het eerst werd gerapporteerd, bestond de bibliotheek uit > 40 genen die resistentie tegen 16 antibiotica klassen verlenen. De oorspronkelijke dereplication template is ontworpen om een subset van resistentiegenen per antibiotica klasse te omvatten om informatie te verstrekken over antibiotica subklasse tijdens het dereplication proces. Tegenwoordig bestaat de ARP uit > 90 genen die resistentie verlenen aan 18 antibiotica klassen. Met behulp van onze uitgebreide collectie van resistentiegenen is een secundair dereplication template ontwikkeld en staat bekend als het minimale antibiotica Resistance platform (MARP). Deze sjabloon is gemaakt om te elimineren van Gene redundantie en eenvoudig informatie te verstrekken over de algemene antibiotica klasse die een dereplicated metaboliet is gerelateerd aan. Daarnaast bezit het MARP-template zowel wild type als een hyperpermeabele/effluxdeficiënte stam van e. coli BW25113 (E. coli BW25113 δBAMBδtolc), vergeleken met de oorspronkelijke incarnatie van de ARP, die alleen maakt gebruik van de hyperpermeabele stam. Dit unieke aspect creëert extra fenotypes tijdens dereplicatie, wat duidt op een verbindingen vermogen om het buitenste membraan van gram-negatieve bacteriën over te steken. Hier beschrijven we een robuust protocol dat moet worden gevolgd bij het derepliceren met ofwel de ARP en/of MARP, Markeer de meest kritieke stappen die moeten worden gevolgd, en bespreek de verschillende mogelijke uitkomsten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van E. coli bibliotheek glycerol voorraden (van agar slants)
- Streak de ARP/MARP E. coli stammen van lysogeny Bouillon (lb) agar op de Petri schaaltjes met lb agar en de geschikte markeerstift (tabel 1).
- Bereid culturen voor elk van de E. coli stammen door het inoculeren van 3 ml lb met de juiste selecteerbare marker met een enkele kolonie. Groei 's nachts bij 37 °C met beluchting (250 rpm).
- Combineer 800 μL cultuur en 200 μL steriele 80% glycerol in een 1,8 mL cryovial. Meng door de buizen 3 − 4 keer te inverteren en op-80 °C te bewaren.
2. ARP/MARP bevroren voorraad bibliotheek plaat voorbereiding
- Streak de ARP/MARP stammen uit de glycerol-voorraden bereid in sectie 1 op een nieuwe set van Petri schalen met LB agar en de juiste selecteerbare marker. Groei 's nachts bij 37 °C.
- Pipetteer met behulp van aseptische techniek 500 μL kationen aangepast Mueller Hinton Bouillon (MHB) van een steriel reservoir in elke put van een steriele 96 diepe put.
- Met de platen bereid in stap 2,1, gebruik een applicator stok te beënten de 96 diepe goed plaat in overeenstemming met de ARP/MARP kaart (aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2). Zorg ervoor dat de juiste selecteerbare marker aan elke put wordt toegevoegd. Plaats een ademend afdichtings membraan over het oppervlak van de diepe goed plaat en incuberen 's nachts bij 37 °C (250 rpm).
- Zorg ervoor dat er geen vervuilde putten zijn door te verwijzen naar de ARP/MARP-kaart. Herhaal dit indien verontreinigd. Gebruik een meerkanaals pipettor om 100 μL van elke put van de Deep well plate over te brengen naar een steriele 96-well ronde bodemplaat. Herhaal deze stap om meerdere bevroren voorraad bibliotheek platen te maken.
Opmerking: Het is het beste om ten minste 5 bibliotheek platen op een tijdstip voor te bereiden om te voorkomen dat stappen 2.1 − 2.4 worden herhaald in geval van verontreiniging van de voorraad bibliotheek plaat. - Eindig met het maken van de ARP/MARP-voorraad bibliotheek platen door Pipetteer 100 μL van steriele 50% glycerol in elke put en meng door zachtjes op en neer te pipetteren.
- Bedek de platen met steriele Aluminium afdichtingen en zorg ervoor dat elk goed afzonderlijk wordt verzegeld.
- Nummer de platen en wijden slechts één bevroren voorraad bibliotheek plaat voor het inoculeren van nieuwe templates op een bepaald moment. Houd de rest als back-ups in het geval van bevroren voorraad bibliotheekplaat verontreiniging.
- Plaats de plaat deksel bovenop de aluminium afdichting en bewaar bij-80 °C.
3. zaad cultuur en voorbereiding van de Dereplicatie plaat
- Gebruik een applicator stok, inoculeren 3 mL Streptomyces antibioticum medium (SAM) (of een ander geschikt medium voor het organisme dat wordt getest) in een reageerbuis met één steriele glazen kraal (om het mycelium te breken) met de producerende stam die moet worden dereplicated. Voor Streptomyces, schraagt de sporen voorzichtig van het oppervlak van een kolonie.
- Met behulp van dezelfde houten applicator stok, streak een steriliteit controle op een Petri schaaltje met Bennet's agar.
- Inbroed de zaad kweek bij 30 °C met beluchting gedurende 6 dagen (250 rpm) en inincubatie van de Steriliteits controleplaat bij 30 °C gedurende 6 dagen.
Opmerking: Zie tabel 2 voor de media recepten van Sam en Bennett. De bovenstaande instructies zijn geschikt voor de meeste Actinomyceten. Verander de groeimedia indien nodig voor andere bacteriën en schimmels. - Bereid de dereplicatie platen voor door 23 mL warme Bennett-agar in een serologische pipet te zuigen en 20 mL gelijkmatig over het oppervlak van een rechthoekige Petri schaal te verdelen (tabel met materialen), waardoor de rest van het medium in de pipet wordt voorkomen dat vorming van luchtbellen.
Opmerking: Zorg ervoor dat het oppervlak dat wordt gebruikt om platen te gieten niveau is en deze stap uitvoert voordat de agar te veel heeft afgekoeld; een plat oppervlak is noodzakelijk voor het vastzetten van de bibliotheek in de volgende fasen. - Draai de plaat voorzichtig totdat het medium alle delen van de plaat bedekt en niet verstoort totdat de agar volledig is ingesteld.
- Bereid nitrocellulose membraan vellen (Inhoudsopgave) met behulp van een rechthoekige Petri schaal deksel als een overtrek sjabloon zodat de vellen passen het oppervlak van de dereplication plaat. Snijd de vellen en autoclaaf ze in een steriel zakje.
Opmerking: Dit membraan maakt het mogelijk voor organismen om te sporuleren op het oppervlak, terwijl secundaire metabolieten kunnen worden uitgescheiden in het medium hieronder. Eenmaal gegroeid, wordt het membraan verwijderd om een schoon oppervlak voor dereplicatie te bieden. Hoe dichter de pasvorm dat het membraan papier op het oppervlak van de Bennet's agar, de schoner het dereplication resultaat. - Controleer de Steriliteits controle plaat om er zeker van te zijn dat er na 6 dagen incubatie geen verontreinigingen aanwezig zijn. Als het vuilvrij is, verwijder dan de deksel van het rechthoekige Petri schaaltje en Pipetteer 200 μL zaad cultuur op het oppervlak van de Bennet's agar.
- Verdeel de kweek gelijkmatig over het oppervlak van de hele plaat met een steriel wattenstaafje.
- Plaats de nitrocellulose membraan bereid in stap 3,6 over de top van de cultuur op het oppervlak van de Petri schaal. Begin met het uitlijnen van de onderrand van het membraan op de onderrand van de Petri schaal en breng het membraan langzaam van de onderrand naar de bovenrand van de plaat.
- Gebruik een steriel wattenstaafje om eventuele luchtbelletjes die zich tussen de membraan-agar-interface hebben gevormd, glad te strijken, zodat het membraan naar de agar wordt gespoeld.
- Zet de deksel terug op de rechthoekige Petri schaal en plaats hem ondersteboven in een verzegelde plastic zak. Incuberen bij 30 °C gedurende 6 dagen.
4. dereplication Plate MHB overlay en ARP/MARP Library Plate voorbereiding
- Verwijder na 6 dagen de dereplicatie plaat uit de incubator van 30 °C. Gebruik steriel pincet (autoclaved of grondig besproeid met 70% ethanol) en verwijder voorzichtig het nitrocellulose membraan van het oppervlak van de Benlo's agar.
Opmerking: Deze stap zal de hydrofobe sporen verwijderen en mycelia geteeld op het oppervlak van het membraan om een schoon oppervlak voor dereplicatie te bieden, waardoor stap 4,2 wordt vergemakkelijkt. - Zoals beschreven voor stap 3,4, zorg ervoor dat het werkoppervlak is niveau en gebruik een serologische pipet te aspireren 23 mL warme kation aangepast MHB agar. Maak een overlay door 20 mL gelijkmatig over het oppervlak van de dereplicatie plaat te doseren, waardoor de rest van het medium in de pipet overblijft om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
- Draai de plaat voorzichtig totdat het medium alle gebieden bedekt en niet verstoort totdat de agar volledig is ingesteld. Eenmaal gekoeld en gestijgd, retourneer de dereplicatie plaat naar de verzegelde plastic zak en bewaar deze op de kop bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: Deze stap maakt het mogelijk om secundaire metabolieten uit het medium van de gefermenteerde Bennett te diffusie in de MHB agar-overlay. Als het nitrocellulose membraan niet goed is voorbereid, zal er een Spore groei zijn rond de randen van de plaat, die hydrofobische eigenschappen hebben die de MHB agar afstoten. Giet de overlay niet bovenop deze sporen omdat het kan resulteren in contaminatie van de overlay. - Op dezelfde dag dat de overlay wordt gegoten, wordt een vers ARP/MARP-sjabloon inoculeren door pipetteren van 100 μL kationen aangepast MHB in elke put van een 96-well plaat.
Opmerking: Om de kans op verspreiding van verontreiniging tijdens de dereplicatie te verkleinen, gebruikt u een enkele ARP/MARP-bibliotheek plaat om alleen de 2 − 3-dereplicatie platen te verdrijven. Daarom, inoculeren genoeg 96-well ARP/MARP platen op basis van het aantal stammen die zal worden dereplicated. - Neem de bevroren voorraad ARP/MARP-bibliotheek plaat uit de vriezer-80 °C. Verwijder de aluminium afdichting voordat condensatie aan de onderzijde begint te vormen, waardoor de kans op besmetting van naburige putten in de bibliotheek plaat afneemt.
- Met behulp van steriele 96-well-vastmaken gereedschappen (of andere vormen van inoculatie apparatuur), voorzichtig pin van de bevroren voorraad ARP/MARP bibliotheek plaat en inoculeren de verse MHB-bevattende 96-well platen. Om besmetting tijdens de dereplicatie tot een minimum te beperken, bereidt u zoveel ARP-of MARP-bibliotheek platen voor dat ze slechts 2 − 3-dereplicatie platen per bibliotheek plaat hoeven te ontkrullen. Steriliseren vastmaken gereedschappen tussen het inoculeren van elke plaat.
- Zet een nieuwe steriele aluminium afdichting op de bevroren sjabloon zodra deze is voltooid en breng deze terug naar de vriezer-80 °C. Plaats de geënt 96-put-platen in een verzegelde plastic zak en incuberen bij 37 °C met beluchting (250 rpm) gedurende 18 uur.
Opmerking: Nieuwe bevroren voorraad bibliotheek platen kunnen worden bereid uit deze stap na ervoor te zorgen dat er geen besmetting aanwezig is. Voeg glycerol toe aan de plaat vóór opslag bij-80 °C, zoals beschreven in stap 2,5.
5. derepliceren met behulp van de ARP/MARP
- Verwijder het ARP/MARP-sjabloon uit de incubator en zorg ervoor dat er geen verontreinigingen aanwezig zijn. Altijd dereplicate met behulp van een sjabloon die vers is bereid en niet rechtstreeks uit de bevroren voorraad.
- Verwijder de dereplicatie platen van 4 °C en laat deze op kamertemperatuur komen. Als er condensatie is, open de deksels en laat drogen in een steriele omgeving.
- Met behulp van steriele pinnen (of andere inoculatie apparatuur), PIN van de ARP/MARP bibliotheek plaat op het oppervlak van de MHB agar overlay van de dereplication platen. Wees voorzichtig om de agar niet door te boren. Steriliseren vastmaken gereedschappen tussen het inoculeren van elke dereplication plaat.
- Na het vastzetten van de sjabloon op het oppervlak van de dereplication platen, laat de sjabloon entmateriaal drogen voor 3 − 5 min. plaats de geënt dereplication platen ondersteboven in een verzegelde plastic zak en incueren 's nachts bij 37 °c.
- Analyseer dereplication resultaten de volgende dag door de groei op de dereplicatie plaat te vergelijken met putten die corresponderen met de ARP/MARP-kaart (tabel 3 en tabel 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volgende resultaten werden verkregen wanneer een verzameling van belang zijnde antibiotica-producerende stammen werd gederepliceerd met behulp van de ARP en/of MARP.
Een diagram van de ARP/MARP-dereplication-workflow wordt afgebeeld in afbeelding 1en de kaarten van de bibliotheekplaat worden weergegeven in aanvullend figuur 1 en aanvullend figuur 2. Figuur 2 toont een positief dereplication resultaat waarbij het milieu-extract wac 8921 wordt geïdentificeerd als een chlooramfenicol producent. Figuur 3 toont een gebrek aan ARP-groei volledig, wat duidt op de aanwezigheid van een onbekend antibioticum of een minder vaak gevonden antibioticum dat niet wordt verantwoord in de ARP/marp-bibliotheek plaat. Figuur 4 toont een groeipatroon dat uniek is voor de marp vanwege het gebruik van zowel wild type E. coli BW25113 als een hyperpermeabele en Efflux deficiënte Mutant E. coli BW25113 δBAMBΔtolc. Dit resultaat suggereert de aanwezigheid van een verbinding met antimicrobiële activiteit die niet in staat is om een intact buitenste membraan overtreffen. Figuur 5 toont een E. coli -groeipatroon dat de onjuiste sterilisatie van vastgezette gereedschappen suggereert en Figuur 6 toont een voorbeeld van een ARP/marp-bevroren voorraad bibliotheek plaat verontreiniging. Figuur 7 laat zien wat er gebeurt als de agar-overlay tijdens het ontkrullen wordt doorgeprikt. Ten slotte toont Figuur 8 MHB-overlay gerelateerde verontreiniging die kan optreden tijdens het dereplicatie proces.
Figuur 1: een schematische voorstelling van het dereplicatie proces. De producerende stam moet worden gederepliceerd op een rechthoekige Petri schaal als gazon en een nitrocellulose membraan wordt bovenop geplaatst. De plaat wordt vervolgens gedurende 6 dagen geïnineerd, waarbij de aan de productie stam gerelateerde biomassa op het oppervlak van het membraan groeit en secundaire metabolieten worden uitgescheiden in de Petri schaalmedia. Na een fermentatie periode van 6 dagen wordt het membraan verwijderd en wordt een MHB-overlay aan het oppervlak van de antibioticum bevattende Media toegevoegd om een glad oppervlak voor vastzetten te bieden. De ARP/MARP E. coli -bibliotheek, die is gerangschikt in een 96-put-indeling volgens de ARP/Marp-kaarten, wordt vervolgens vastgemaakt op het oppervlak van de overlay. Nadat de lade 's nachts op 37 °C is geïnbroed, geeft de groei van E. coli stammen die specifieke resistentiegenen uitdrukken de identiteit van de geproduceerde stof aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Dereplicatie van een bekend antibioticum. De producerende stam WAC 8921 werd met behulp van de ARP-sjabloon van de Groei van E. coli BW25113 δBAMBΔtolc pGDP1:kat op het oppervlak van de MHB agar-overlay geeft aan dat WAC 8921 een chlooramfenicol-producent is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Dereplicatie van een onbekend antibioticum. De producerende stam WAC 9941 werd met behulp van de ARP-sjabloon van de Een gebrek aan E. coli bibliotheek groei werd gezien op het oppervlak van de rechthoekige Petri schaal, waaruit blijkt dat ofwel wac 9441 is het produceren van een onbekende antimicrobiële verbinding of een zeldzaam antibioticum dat niet wordt verantwoord in de ARP. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: identificatie van een antimicrobiële stof die geen intact buitenste membraan kan passeren. De producerende stam WAC 4178 werd met behulp van de MARP-sjabloon met de Stammen van e. coli BW25113 kunnen groeien op het oppervlak van de secundaire metaboliet-bevattende media, overwegende dat alle stammen van e. coli BW25113 δBAMBΔtolc kan niet groeien. Dit suggereert dat WAC 4178 een antimicrobiële stof produceert die geen intact buitenste membraan kan passeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: verontreiniging door niet-steriel vastpinnen. De producerende stam WAC 7094 werd met behulp van de ARP-sjabloon van de De aanwezigheid van e. coli bibliotheek groei in gebieden die niet over een toegewezen E. coli stam suggereert dat de vastmaken gereedschappen gebruikt om de MHB agar overlay van de rechthoekige Petri schaal werden niet goed gesteriliseerd. Dit resulteert in de overdracht van onbekende E. coli stammen over de overlay. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: verontreiniging door een ARP/MARP-template met verontreinigd bevroren voorraad. De producerende stam WAC 3683 werd met behulp van de ARP-sjabloon van de Drie verschillende E. coli kolonies groeide op het rechthoekige Petri schaaloppervlak: twee corresponderen met e. coli BW25113 δBAMBΔtolc uitdrukken stat, een enzym streptothricin resistentie, en de andere correspondeert met e. coli BW25113 δBAMBΔtolc uitdrukken vim-2SS, een β-lactam resistentie enzym. Als gevolg van een gebrek aan het repliceren blaVIM2ss kolonie groei, naast het ontbreken van kruisresistentie bekend te vinden tussen deze twee antibiotica klassen, kan worden verondersteld dat een andere stam dan E. coli δBAMBΔ tolC pGDP1: blaVIM2ss groeit in de respectieve bevroren bibliotheek plaat goed. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: doorboorde MHB agar-overlay. De producerende stam WAC 5106 werd met behulp van de ARP-sjabloon van de Deze stam bleek een streptomycine producent te zijn, zoals aangegeven door de groei van E. coli BW25113 δBAMBΔtolc pGDP3:APH (6)-IA. Op het oppervlak van de MHB agar-overlay langs de omtrek van de plaat kunnen lekgaten worden gezien. Hoewel dit geen invloed heeft op de resultaten van de dereplication, het kan de gegevens moeilijk te interpreteren op het eerste gezicht te maken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: besmetting van de MHB agar-overlay. De besmette MHB agar produceert een onregelmatig groeipatroon op het oppervlak van de overlay dat zichtbaar wordt nadat de plaat 's nachts op 37 °C is gebroed. Hoewel E. coli groei kan nog steeds zichtbaar door de besmetting, is het raadzaam om het experiment te herhalen voordat het extrapoleren van gegevens van de plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Plasmide | Selecteerbare marker |
| pGDP1 | Kanamycine 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicillaire 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| Geen | - |
Tabel 1: selecteerbare markers gebruikt in de pGDP plasmide serie. Streep de ARP/MARP E. coli stammen op lb agar Petri schaaltjes met de geschikte markeerstift in de juiste concentratie voor elk plasmide.
| Media | Ingrediënt | Bedrag |
| Sam | Glucose | 15 g |
| Soja pepton | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| Gistextract | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glycerol | 2,5 mL | |
| ddH2O | Tot 1 L | |
| Bennetts | Aardappelzetmeel | 10 g |
| Casamino zuren | 2 g | |
| Gistextract | 1,8 g | |
| Czapek minerale mix | 2 mL | |
| Agar (optioneel) | 15 g | |
| ddH2O | Tot 1 L | |
| Czapek minerale mix | Kcl | 10 g |
| MgSO4∙ 7h2O | 10 g | |
| NaNO3 | 12 g | |
| FeSO4∙ 7h2O | 0,2 g | |
| Geconcentreerde HCl | 200 μL | |
| ddH2O | Tot 100 mL |
Tabel 2: recepten voor Sam en Bennetts media, en Czapek Mineral mix. Pas SAM en Bennetts aan pH 6,8 voor autoclaven, en filter steriliseren de Czapek minerale mix.
| Antibiotica klasse | Antibioticum | Resistentie-gen | E. coli stam | Goede positie |
| Aminoglycosiden | Streptomycine | APH (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-deoxystreptamine | rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycine | apmA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | |
| Spectinomycine | APH (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | |
| β-lactams | Penicilline | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| Cefalosporine | ||||
| Carbapenam | ||||
| Lincosamiden | Lincosamiden | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| Macroliden | Macroliden | ermC | ||
| Type B Streptograminen | Type B Streptograminen | ermC | ||
| Typ een Streptograminen | Typ een Streptograminen | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracyclines | Tetracycline | Tet (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Chlooramfenicolen | Chlooramfenicolen | Cat | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| Polymyxinen | Polymyxinen | MCR-1 | wild-type BW25113 | C6, F7 |
| Echinomycinen | Echinomycinen | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 |
| Sideromycinen | Albomycine | fhuB Mutant | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Geoogde | Viomycine | vph | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 |
| N/a | N/a | N/a | wild-type BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/a | N/a | N/a | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabel 3: goed aanwijzings tafel voor de minimale ARP stammen. Deze tabel geeft aan welke put van een 96-well plaat dat elk van de minimale ARP stammen kan worden gevonden in volgens de minimale ARP bibliotheek plaat kaart. De tabel vermeldt ook welke antibiotica klasse elk gen resistentie verleent. Houd er rekening mee dat sommige genen resistentie kunnen verlenen aan meer dan één antibioticum binnen de gegeven antibiotica klasse.
| Antibiotica klasse | Antibioticum | Resistentie-gen | E. coli stam | Goede positie |
| Aminoglycosiden | Streptomycine | APH (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2, G11 |
| APH (6)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6, F7 | ||
| Spectinomycine | APH (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicine | AAC (3)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| ant (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, H8 | ||
| APH (2 ' ')-ID | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6, H7 | ||
| AAC (6 ')-APH (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | ||
| Kanamycine | APH (3 ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| APH (3 ')-Illa | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycine | APH (4)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6, G7 | |
| β-lactams | Amoxicillin | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidim | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacilline | OXA-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 | |
| Lincosamiden | Lincosamiden | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| LNU (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Macroliden | Macroliden | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| mphA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2, F11 | ||
| Type B Streptograminen | Type B Streptograminen | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| VGB | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| Typ een Streptograminen | Typ een Streptograminen | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracyclines | Tetracycline | Tet (M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5, D8 |
| Chlooramfenicolen | Chlooramfenicolen | Cat | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| N/a | N/a | N/a | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabel 4: goed aanwijzings tafel voor de ARP stammen. Deze tabel geeft aan welke put van een 96-put plaat dat elk van de ARP stammen kan worden gevonden in volgens de ARP Library Plate map. De tabel vermeldt ook welke antibiotica klasse elk gen resistentie verleent. Houd er rekening mee dat sommige genen resistentie kunnen verlenen aan meer dan één antibioticum binnen de gegeven antibiotica klasse.
Aanvullend figuur 1: Bibliotheekplaat kaart die wordt gebruikt voor de oorspronkelijke ARP-sjabloon (antibiotica Resistance platform). Organiseer de respectievelijke E. coli stammen in een 96-put plaat met behulp van dit formaat om ervoor te zorgen dat alle benodigde controles en duplicaten zijn opgenomen. Dit cijfer is gewijzigd van Cox et al.10. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend figuur 2: Bibliotheekplaat kaart gebruikt voor het minimale MARP-sjabloon (antibiotica Resistance platform). Organiseer de respectievelijke E. coli stammen in een 96-put plaat met behulp van dit formaat om ervoor te zorgen dat alle benodigde controles en duplicaten zijn opgenomen. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierboven beschreven protocol kan worden toegepast op zowel de ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen als adjuvantia die kunnen worden gebruikt in combinatie met bestaande antibiotica om hun activiteit te redden. Het platform maakt gebruik van de hoge substraat specificiteit van resistentiemechanismen en hun verwant antibiotica, tot dereplicate verbindingen binnen ruwe natuurlijke product extracten. Hoewel de tijd die nodig is voor de voorbereiding van de dereplicatie platen lang is (~ 2 weken), is het dereplicatie proces zelf voltooid na een enkele nachtelijke incubatieperiode, die snel is in vergelijking met de tijd die het kan nemen om te isoleren en karakteriseren van een samengestelde uit ruwe extracten. Bovendien is geen dure of zeer gespecialiseerde apparatuur vereist, waardoor dit platform toegankelijk en kosteneffectief is.
Een ander belangrijk voordeel van dit platform is de flexibiliteit. De ARP kan worden uitgebreid met resistentiegenen die meer antibiotica klassen omvatten. Dit wordt bereikt door het monitoren van de literatuur voor het ontstaan van nieuwe resistentie enzymen en het gebruik van elementaire moleculaire kloontechnieken om de genen toe te voegen aan de E. coli bibliotheek. Bovendien, de dereplication sjabloon is aanpasbaar op basis van het gewenste niveau van brede of smalle bereik substraat specificiteit die een individu wil gebruiken wanneer dereplicating. Elke combinatie van genen in de E. coli -bibliotheek kan worden gebruikt om nieuwe bibliotheek platen te maken met de mogelijkheid om verbindingen met verschillende profielen te detecteren. Bijvoorbeeld, een β-lactamase uitdrukken E. coli template kan worden ontwikkeld om toe te staan voor de zeer specifieke dereplicatie van β-lactams en hun verschillende subklassen.
Terwijl dit platform oorspronkelijk werd ontworpen om te dereplicate verbindingen op vaste media, het is ook werken in vloeibare media. Dit is handig bij het werken met verbindingen die al zijn gezuiverd, waarbij slechts een beperkte hoeveelheid beschikbaar is voor het testen, of bij het werken met verbindingen die niet gemakkelijk of consistent in vaste media diffuus. Ten slotte, terwijl dit protocol werd beschreven met behulp van de E. coli stammen BW25113 en BW25113 δBAMBΔtolc, het platform kan worden gebruikt met de resistentie genbibliotheek uitgedrukt in verschillende stammen van e. coli (dereplication fenotypes kunnen variëren). Uiteindelijk is het antibioticaresistentie platform flexibel, heeft het veel toepassingen en is het voordelig ten opzichte van andere dereplicatie methodes.
Om ervoor te zorgen dat reproduceerbare en niet-verontreinigde resultaten worden verkregen, is het van cruciaal belang om passende sterilisatie-en aseptische technieken te volgen. Als u dit niet doet, wordt de vastpinnen, de bibliotheek plaat of de dereplicatie plaat zelf verontreinigd. Terwijl selecteerbare markeringen aanwezig zijn in de E. coli bibliotheek, die kan helpen voorkomen dat besmetting veroorzaakt door bacteriën ontbrekende de marker, het is niet voorkomen dat de kruisbesmetting van stammen met behulp van dezelfde marker. Om het risico van dit gebeuren te verminderen, is het essentieel om de bacterieel vastmaak gereedschappen zorgvuldig te steriliseren voordat deze uit de bibliotheek plaat worden vastpinnen. Elke bibliotheek plaat mag alleen van 3 − 4 keer maximaal worden vastgemaakt voordat een nieuwe sjabloon wordt verwijderd. Dit voorkomt de verspreiding van verontreiniging over alle dereplication platen als een bibliotheek plaat vervuild raakt tijdens het vastzetten. Bovendien worden geen antibiotica gebruikt bij het inoculeren van de dereplicatie plaat en er moet zo veel zorg worden besteed om verontreiniging te voorkomen voordat het wordt overgelaten om zes dagen te gisten. Een andere mogelijke bron van verontreiniging is in de MHB agar-overlay van de dereplicatie plaat. Als de overlay-media verontreinigd zijn, zal de groei pas verschijnen na de nachtelijke incubatie bij 37 °C na het vastzetten. Overlay contaminatie kan het uiterst moeilijk maken om de groei van de E. coli -bibliotheek op het overlay-oppervlak te analyseren. Om de kans op besmetting van de overlay te verkleinen, bereidt u MHB agar Fresh voor voordat u de overlay giet. Het wordt aanbevolen dat, totdat een individu comfortabel is met deze methode, dereplication platen altijd in duplicaat of drievoud moeten worden bereid, zodat in het geval van besmetting van één plaat, gegevens nog steeds kunnen worden geëxtraheerd uit de hopelijk niet-verontreinigde platen.
Ten slotte is het belangrijk op te merken dat de ARP/MARP beperkingen heeft. Dit protocol is niet geschikt voor de de-replicatie van productie-stammen die meer dan één bioactieve verbinding produceren. Elke stam in de E. coli bibliotheek is ontworpen om een enkel resistentie gen uit te drukken. Als twee antibiotica worden geproduceerd door een organisme, zal geen van beide resistentie gen resistentie verlenen aan het tweede antibioticum, waardoor de celdood van beide stammen ontstaat. Deze mogelijkheid moet dus worden overwogen wanneer de resultaten van de dereplicatie wijzen op de aanwezigheid van een nieuw antibioticum omdat de productie van meerdere antibiotica niet kan worden opgespoord door de huidige single construct E. coli Library. Een benadering die kan worden genomen ter bestrijding van de uitdaging van dereplicerende stammen die meer dan één antibioticum produceren, omvat het gebruik van de agar-plug-procedure zoals beschreven in het oorspronkelijke ARP-document door Cox et al.10. Bij deze methode wordt een deel van een gefermenteerd vast medium verwijderd van een antibioticum-producent die plaat bevat en op een gazon van indicator ARP-stam wordt geplaatst. De indicator stam kan een van de resistente E. coli -stammen in de ARP-bibliotheek zijn. Zones van remming worden vervolgens gebruikt om de bioactiviteit van een productie stam tegen de ARP-stammen en een wild type stam te vergelijken. ARP stammen die een remmende zone van verminderde grootte in vergelijking met de wild-type stam vormen kunnen weerstaan de samengestelde wordt geproduceerd. Deze methode is effectief gebleken bij het identificeren van stammen die meerdere antibiotica kunnen produceren10.
Samenvattend, voor het verkrijgen van de beste resultaten bij het ontkrullen met de ARP/MARP wordt aanbevolen dat dereplication platen worden bereid in dubbele of drievoud. Andere belangrijke stappen in het protocol zijn het vastzetten van een nieuwe bibliotheek plaat (nooit bevroren) en het verwijderen van zoveel mogelijk biomassa uit de productie-stam tijdens de membraan verwijderingsfase. Als alle benodigde stappen worden gevolgd, moet een succesvolle dereplication resultaten voor een productie-spanning van belang binnen een periode van twee weken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek in het Wright Lab met betrekking tot de ARP/MARP werd ondersteund door het Ontario Research Fund en Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463). We willen Sommer Chou graag erkennen voor het ondersteunen van de uitbreiding en organisatie van de ARP-bibliotheek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
