Summary
Wir beschreiben eine Plattform, die eine Bibliothek von isogenen antibiotikaresistenten Escherichia coli für die Dereplikation von Antibiotika nutzt. Die Identität eines von Bakterien oder Pilzen produzierten Antibiotikums kann durch das Wachstum von E. coli abgeleitet werden, das sein jeweiliges Resistenzgen ausdrückt. Diese Plattform ist wirtschaftlich effektiv und zeiteffizient.
Abstract
Eine der größten Herausforderungen bei der Suche nach neuen Antibiotika aus Naturproduktextrakten ist die Wiederentdeckung gängiger Verbindungen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird die Dereplikation, d. h. der Prozess der Identifizierung bekannter Verbindungen, an Voninteresse steilenProben durchgeführt. Methoden zur Dereplikation wie die analytische Trennung gefolgt von der Massenspektrometrie sind zeitaufwändig und ressourcenintensiv. Um den Dereplikationsprozess zu verbessern, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP) entwickelt. Die ARP ist eine Bibliothek von etwa 100 Antibiotikaresistenzgenen, die einzeln in Escherichia coli geklont wurden. Diese Stammsammlung hat viele Anwendungen, einschließlich einer kostengünstigen und einfachen Methode für die Dereplikation von Antibiotika. Der Prozess beinhaltet die Fermentation von antibiotikaproduzierenden Mikroben auf der Oberfläche von rechteckigen Petrischalen, die festes Medium enthalten, wodurch die Sekretion und Diffusion von sekundären Metaboliten durch das Medium ermöglicht wird. Nach einer 6-tägigen Fermentationsphase wird die mikrobielle Biomasse entfernt und der Petrischale wird ein dünnes Agar-Overlay hinzugefügt, um eine glatte Oberfläche zu schaffen und das Wachstum der E. coli-Indikatorstämme zu ermöglichen. Unsere Sammlung von ARP-Stämmen wird dann auf die Oberfläche der antibiotikahaltigen Petrischale gepinnt. Die Platte wird als nächstes über Nacht inkubiert, um E. coli-Wachstum auf der Oberfläche der Überlagerung zu ermöglichen. Nur Stämme, die Resistenzen gegen ein bestimmtes Antibiotikum (oder eine bestimmte Klasse) enthalten, wachsen auf dieser Oberfläche, was eine schnelle Identifizierung der produzierten Verbindung ermöglicht. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung von Herstellern bekannter Antibiotika und als Mittel zur Identifizierung der Hersteller neuartiger Verbindungen eingesetzt.
Introduction
Seit der Entdeckung von Penicillin im Jahr 1928 haben sich natürliche Produkte aus Umweltmikroorganismen als reiche Quelle antimikrobieller Verbindungen erwiesen1. Ungefähr 80% der Natürlichen Produkte Antibiotika werden von Bakterien der Gattung Streptomyces und anderen Actinomycetes abgeleitet, während die restlichen 20% von Pilzarten produziert werden1. Einige der häufigsten Antibiotika-Gerüste, die in der Klinik verwendet werden, wie die Lactams, Tetracycline, Rifamycine und Aminoglykoside, wurden ursprünglich aus Mikroben isoliert2. Aufgrund des Anstiegs von multiresistenten (MDR) Bakterien ist unser aktuelles Antibiotika-Panel in der Behandlung3,4weniger wirksam geworden. Dazu gehören die "ESKAPE"-Erreger (d.h. vancomycinresistente Enterokokken und Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, und Enterobacter sp.), die eine Teilmenge von Bakterien sind, die von einer Reihe wichtiger Gesundheitsbehörden wie der Weltgesundheitsorganisation3,4,5als mit dem höchsten Risiko assoziiert angesehen werden. Das Aufkommen und die weltweite Ausbreitung dieser MDR-Erreger führen zu einem konstanten Bedarf an neuartigen Antibiotika3,4,5. Bedauerlicherweise haben die letzten zwei Jahrzehnte gezeigt, dass die Entdeckung neuartiger Antibiotika aus mikrobiellen Quellen immer schwieriger wird6. Aktuelle Ansätze zur Arzneimittelentdeckung umfassen das Hochdurchsatz-Screening von bioaktiven Verbindungen, einschließlich Natürlicherextraktbibliotheken, so dass Tausende von Extrakten zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können2. Sobald jedoch antimikrobielle Aktivität erkannt wird, besteht der nächste Schritt darin, den Inhalt des Rohextrakts zu analysieren, um die aktive Komponente zu identifizieren und diejenigen zu beseitigen, die bekannte oder redundante Verbindungen enthalten7,8. Dieser Prozess, der als Dereplikation bezeichnet wird, ist von entscheidender Bedeutung, um die Zeit, die für die Wiederentdeckung bekannter Antibiotika aufgewendet wird, zu verhindern und/oder erheblich zu reduzieren7,9. Obwohl ein notwendiger Schritt in der Entdeckung von Naturprodukten, Ist die Dereplikation notorisch mühsam und ressourcenintensiv10.
Seit Beutler et al. den Begriff "Dereplikation" erstmals geprägt haben, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um innovative Strategien zur schnellen Identifizierung bekannter Antibiotika zu entwickeln11,12. Heute sind die häufigsten Werkzeuge für die Dereplikation analytische chromatographische Systeme wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanz-basierte Detektionsmethoden11,13. Leider erfordert jede dieser Methoden den Einsatz teurer Analysegeräte und ausgeklügelter Dateninterpretation.
In dem Versuch, eine Dereplikationsmethode zu entwickeln, die schnell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP)10eingerichtet. Die ARP kann für die Entdeckung von Antibiotika-Adjuvantien, die Profilierung neuer Antibiotika-Verbindungen gegen bekannte Resistenzmechanismen und die Dereplikation bekannter Antibiotika in Extrakten aus Aktinobakterien und anderen Mikroben verwendet werden. Hier konzentrieren wir uns auf seine Anwendung bei der Dereplikation von Antibiotika. Die ARP nutzt eine Bibliothek von isogenen Escherichia coli-Stämmen, die individuelle Resistenzgene exdrücken, die gegen die am häufigsten wiederentdeckten Antibiotika14,15wirksam sind. Wenn die E. coli-Bibliothek in Gegenwart eines sekundären Metaboliten produzierenden Organismus angebaut wird, kann die Identität der Verbindung durch das Wachstum von E. coli-Stämmen abgeleitet werden, die das zugehörige Resistenzgen10ausdrücken. Als die ARP zum ersten Mal gemeldet wurde, bestand die Bibliothek aus >40 Genen, die eine Resistenz für 16 Antibiotikaklassen verliehen. Die ursprüngliche Dereplikationsvorlage wurde entwickelt, um eine Teilmenge von Resistenzgenen pro Antibiotikaklasse zu umfassen, um Informationen über die Unterklasse von Antibiotika während des Dereplikationsprozesses bereitzustellen. Heute besteht die ARP aus >90 Genen, die 18 Antibiotikaklassen Resistenzen verleihen. Mit unserer umfangreichen Sammlung von Resistenzgenen wurde eine sekundäre Dereplikationsvorlage entwickelt, die als minimale Antibiotikaresistenzplattform (MARP) bekannt ist. Diese Vorlage wurde erstellt, um Genredundanz zu beseitigen und einfach Informationen über die allgemeine Antibiotikaklasse bereitzustellen, mit der ein dereplizierter Metabolit verwandt ist. Darüber hinaus besitzt die MARP-Vorlage sowohl Wildtyp als auch einen hyperpermeablen/efflux-defizienten Stamm von E. coli BW25113 (E. coli BW25113 nutzt die hyperpermeable Sorte. Dieser einzigartige Aspekt erzeugt zusätzliche Phänotypen während der Dereplikation, was auf eine Verbindungen Fähigkeit, die äußere Membran von Gram-negativen Bakterien zu überqueren. Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll, das bei der Dereplikation mit dem ARP und/oder MARP zu befolgen ist, heben die wichtigsten Schritte hervor, die befolgt werden müssen, und besprechen die verschiedenen möglichen Ergebnisse.
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Protocol
1. Herstellung von E. coli Bibliothek Glycerin Bestände (von Agar Slants)
- Streichen Sie die ARP/MARP E. coli-Stämme aus Lysogeny-Brühe (LB) Agar schräg auf Petrischalen, die LB-Agar und den entsprechenden wählbaren Marker enthalten (Tabelle 1).
- Bereiten Sie Kulturen für jede der E. coli-Stämme vor, indem Sie 3 ml LB impfen, die den entsprechenden wählbaren Marker mit einer einzigen Kolonie enthalten. Über Nacht bei 37 °C mit Belüftung (250 Rpm) wachsen.
- Kombinieren Sie 800 l Kultur und 200 l steriles 80% Glycerin in einem 1,8 ml Kryovial. Mischen Sie die Rohre 3 bis 4 Mal, und lagern Sie bei -80 °C.
2. ARP/MARP Frozen Stock Library Plattenvorbereitung
- Streichen Sie die ARP/MARP-Stämme aus den in Abschnitt 1 zubereiteten Glycerinbeständen auf einen neuen Satz Petrischalen, die LB-Agar und den entsprechenden wählbaren Marker enthalten. Über Nacht bei 37 °C wachsen.
- Mit aseptischer Technik passte die Pipette 500 l kationens auf die Müller Hinton Brühe (MHB) aus einem sterilen Reservoir in jeden Brunnen einer sterilen 96-Tiefenbrunnenplatte.
- Mit den in Schritt 2.1 vorbereiteten Platten verwenden Sie einen Applikatorstab, um die 96-Tiefe-Brunnenplatte gemäß der ARP/MARP-Karte zu impfen (Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass jedem Brunnen der entsprechende wählbare Marker hinzugefügt wird. Legen Sie eine atmungsaktive Dichtmembran über die Oberfläche der Tiefbrunnenplatte und bebrüten Sie sie über Nacht bei 37 °C (250 Umdrehungen pro Minute).
- Stellen Sie sicher, dass keine kontaminierten Brunnen vorhanden sind, indem Sie auf die ARP/MARP-Karte verweisen. Wiederholen Sie dies, wenn sie kontaminiert sind. Übertragen Sie mit einem Mehrkanal-Pipettor 100 l von jedem Brunnen der Tiefenbrunnenplatte auf eine sterile 96-Well-Rundbodenplatte. Wiederholen Sie diesen Schritt, um mehrere eingefrorene Lagerbibliotheksplatten zu erstellen.
HINWEIS: Es ist am besten, mindestens 5 Bibliotheksplatten gleichzeitig vorzubereiten, um die Wiederholung der Schritte 2.1-2.4 im Falle einer Kontamination der Tiefkühl-Bibliotheksplatte zu verhindern. - Beenden Sie die Herstellung der ARP/MARP gefrorenen LagerbibliothekPlatten durch Pipettieren 100 l steriles 50% Glycerin in jeden Brunnen und mischen durch sanftepipetting nach oben und unten.
- Bedecken Sie die Platten mit sterilen Aluminiumdichtungen und sorgen Sie dafür, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt ist.
- Nummerieren Sie die Platten und widmen Sie nur ein gefrorenes Stockbibliotheksschild, um neue Vorlagen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu impfen. Bewahren Sie den Rest als Back-ups bei Kontamination der Tiefkühlplattenplatte auf.
- Den Plattendeckel auf die Aluminiumdichtung legen und bei -80 °C lagern.
3. Saatgutkultur und Dereplikationsplattenvorbereitung
- Mit einem Applikatorstab 3 ml Streptomyces-Antibiotikum-Medium (SAM) (oder ein anderes geeignetes Medium für den untersuchten Organismus) in einem Reagenzglas impfen, das eine sterile Glasperle (zum Aufbrechen des Myzels) mit dem produzierenden Stamm enthält, der derepiert werden. Für Streptomyces, vorsichtig kratzen Sporen von der Oberfläche einer Kolonie.
- Mit dem gleichen hölzernen Applikator-Stick, streifen Sie eine Sterilitätskontrolle auf einer Petrischale mit Bennetts Agar.
- Inkubieren Sie die Samenkultur bei 30 °C mit Belüftung für 6 Tage (250 Rpm) und inkubieren Sie die Sterilitätskontrollplatte bei 30 °C für 6 Tage.
HINWEIS: Siehe Tabelle 2 für SAM und Bennetts Medienrezepte. Die obigen Anweisungen sind für die meisten Actinomycetes geeignet. Ändern Sie Wachstumsmedien, wie sie für andere Bakterien und Pilze notwendig sind. - Bereiten Sie Dereplikationsplatten vor, indem Sie 23 ml warmen Bennett-Agar in eine serologische Pipette einschließen und 20 ml gleichmäßig über die Oberfläche einer rechteckigen Petrischale(Materialtisch)verteilen, so dass der Rest des Mediums in der Pipette bleibt, um dies zu verhindern Luftblasenbildung.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche, die zum Gießen von Platten verwendet wird, eben ist, und führen Sie diesen Schritt aus, bevor der Agar zu stark abgekühlt ist; eine flache Oberfläche ist für das Anheften der Bibliothek in den nächsten Phasen unerlässlich. - Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche der Platte abdeckt und sie nicht stört, bis der Agar vollständig eingestellt ist.
- Bereiten Sie Nitrozellulose-Membranplatten(Materialtabelle) vor, indem Sie einen rechteckigen Petrischalendeckel als Rückverfolgungsschablone verwenden, damit die Platten an die Oberfläche der Dereplikationsplatte passen. Schneiden Sie die Blätter und autoklavieren Sie sie in einem sterilen Beutel.
HINWEIS: Diese Membran ermöglicht es Organismen, auf ihrer Oberfläche zu sporulaten, während sekundäre Metaboliten in das Medium unten ausgeschieden werden können. Nach dem Anbau wird die Membran entfernt, um eine saubere Oberfläche für die Dereplikation zu schaffen. Je enger das Membranpapier auf der Oberfläche des Bennett-Agars passt, desto sauberer entsteht die Dereplikation. - Überprüfen Sie die Sterilitätskontrollplatte, um sicherzustellen, dass nach 6 Tagen Inkubation keine Verunreinigungen vorhanden sind. Wenn kontaminationsfrei, entfernen Sie den Deckel der rechteckigen Petrischale und Pipette 200 L der Samenkultur auf die Oberfläche des Bennett-Agars.
- Gleichmäßig die Kultur über die Oberfläche der gesamten Platte mit einem sterilen Wattestäbchen verteilen.
- Legen Sie die in Schritt 3.6 vorbereitete Nitrocellulosemembran über der Kultur auf die Oberfläche der Petrischale. Beginnen Sie, indem Sie den unteren Rand der Membran am unteren Rand der Petrischale ausrichten, und wenden Sie die Membran langsam vom unteren Rand bis zum oberen Rand der Platte an.
- Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um Luftblasen zu glätten, die sich zwischen der Membran-Agar-Schnittstelle gebildet haben könnten, um sicherzustellen, dass die Membran bündig zum Agar ist.
- Legen Sie den Deckel wieder auf die rechteckige Petrischale und legen Sie ihn kopfüber in eine versiegelte Plastiktüte. 6 Tage bei 30 °C inkubieren.
4. Dereplikationsplatte MHB-Overlay und ARP/MARP-Bibliotheksplattenvorbereitung
- Entfernen Sie nach 6 Tagen die Dereplikationsplatte aus dem 30 °C-Inkubator. Entfernen Sie mit steriler Pinzette (autoklaviert oder gründlich mit 70% Ethanol gesprüht) die Nitrocellulosemembran vorsichtig von der Oberfläche des Bennett-Agars.
HINWEIS: Dieser Schritt wird die hydrophoben Sporen und Mycelia auf der Oberfläche der Membran gewachsen entfernen, um eine saubere Oberfläche für die Dereplikation zu bieten, was Schritt 4.2 erleichtert. - Wie in Schritt 3.4 beschrieben, stellen Sie sicher, dass die Arbeitsfläche eben ist, und verwenden Sie eine serologische Pipette, um 23 ml warmkationsangepassten MHB-Agar zu aspirieren. Erstellen Sie eine Überlagerung, indem Sie 20 ml gleichmäßig über die Oberfläche der Dereplikationsplatte verteilen, sodass der Rest des Mediums in der Pipette bleibt, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
- Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche abdeckt und stört sie nicht, bis der Agar vollständig eingestellt ist. Nach dem Abkühlen und Erstarren die Dereplikationsplatte in den versiegelten Plastikbeutel zurückgeben und über Nacht bei 4 °C aufbewahren.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Diffusion von sekundären Metaboliten aus dem fermentierten Bennett-Medium in die MHB-Agar-Overlay. Wenn die Nitrocellulosemembran nicht richtig vorbereitet wurde, wird es sporendes Wachstum an den Rändern der Platte geben, die hydrophobe Eigenschaften haben, die den MHB-Agar abstoßen. Gießen Sie die Überlagerung nicht auf diese Sporen, da sie zu einer Kontamination der Überlagerung führen kann. - Am selben Tag, an dem die Überlagerung gegossen wird, impfen Sie eine frische ARP/MARP-Schablone, indem Sie 100 l Kation enden, die MHB in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte einstellt.
HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination während der Dereplikation zu verringern, verwenden Sie eine einzige ARP/MARP-Bibliotheksplatte, um nur 2-3 Dereplikationsplatten zu derepieren. Impfen Sie daher genügend 96-Well-ARP/MARP-Platten basierend auf der Anzahl der Stämme, die derepiert werden. - Nehmen Sie die gefrorene Lagerplatte ARP/MARP aus dem -80 °C Gefrierschrank. Entfernen Sie die Aluminiumdichtung, bevor sich auf der Unterseite Kondensation bildet, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, benachbarte Brunnen in der Bibliotheksplatte zu kontaminieren.
- Mit sterilen 96-Well-Pinning-Werkzeugen (oder anderen Formen von Impfgeräten) werden Sie sorgfältig aus dem gefrorenen ARP/MARP-Bibliotheksteller anheften und die frischen MHB-haltigen 96-Well-Platten impfen. Um die Kontamination während der Dereplikation zu minimieren, bereiten Sie so viele ARP- oder MARP-Bibliotheksplatten vor, die nur für die Dereplikation von 2-3 Dereplikationsplatten pro Bibliotheksplatte erforderlich sind. Sterilisieren Sie Pinning-Werkzeuge zwischen der Impfung jeder Platte.
- Legen Sie eine neue sterile Aluminiumdichtung auf die gefrorene Schablone, sobald sie fertig ist, und geben Sie sie in den -80 °C-Gefrierschrank zurück. Die geimpften 96-Well-Platten in eine versiegelte Plastiktüte geben und bei 37 °C mit Belüftung (250 U/min) für 18 h bebrüten.
HINWEIS: Aus diesem Schritt können neue gefrorene Lagerbibliotheksplatten hergestellt werden, ohne sicherzustellen, dass keine Kontamination vorliegt. Glycerin auf die Platte geben, bevor Sie bei -80 °C lagern, wie in Schritt 2.5 beschrieben.
5. Dereplikierung mit dem ARP/MARP
- Entfernen Sie die ARP/MARP-Vorlage aus dem Inkubator, und stellen Sie sicher, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind. Immer mit einer Vorlage derepieren, die frisch zubereitet wird und nicht direkt aus dem gefrorenen Lager.
- Entfernen Sie die Dereplikationsplatten von 4 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausrichten. Wenn es Kondensation gibt, öffnen Sie die Deckel und lassen Sie in einer sterilen Umgebung trocknen.
- Mit sterilen Pinning-Werkzeugen (oder anderen Impfgeräten) von der ARP/MARP-Bibliotheksplatte auf die Oberfläche der MHB-Agar-Überlagerung der Dereplikationsplatten. Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen. Sterilisieren Sie Pinning-Werkzeuge zwischen der Impfung jeder Dereplikationsplatte.
- Nach dem Anheften der Schablone auf die Oberfläche der Dereplikationsplatten, lassen Sie die Schablone inoculum für 3-5 min trocknen. Legen Sie die geimpften Dereplikationsplatten kopfüber in einen versiegelten Plastikbeutel und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C.
- Analysieren Sie die Ergebnisse der Dereplikation am nächsten Tag, indem Sie das Wachstum auf der Dereplikationsplatte mit Bohrungen vergleichen, die der ARP/MARP-Karte entsprechen (Tabelle 3 und Tabelle 4).
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Representative Results
Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt, als eine Sammlung von antibiotikaproduzierenden Stämmen von Interesse mit dem ARP und/oder MARP derepliziert wurde.
Ein Diagramm des ARP/MARP-Dereplikationsworkflows ist in Abbildung 1dargestellt, und Bibliotheksplattenkarten sind in Ergänzenden Abbildung1 und Ergänzenden Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2 zeigt ein positives Dereplikationsergebnis, bei dem der Umweltextrakt WAC 8921 als Chloramphenicol-Produzent identifiziert wird. Abbildung 3 zeigt einen Mangel an ARP-Wachstum vollständig, was auf das Vorhandensein eines unbekannten Antibiotikums oder eines weniger häufig gefundenen Antibiotikums hinweist, das nicht in der ARP/MARP-Bibliotheksplatte berücksichtigt wird. Abbildung 4 zeigt ein Wachstumsmuster, das für das MARP aufgrund seiner Verwendung sowohl des Wildtyps E. coli BW25113 als auch eines hyperpermeablen und efflux defizienten Mutanten E. coli BW25113bamB-tolC einzigartig ist. Dieses Ergebnis deutet auf das Vorhandensein einer Verbindung mit antimikrobieller Aktivität hin, die nicht in der Lage ist, eine intakte äußere Membran zu übertreffen. Abbildung 5 zeigt ein E. coli-Wachstumsmuster, das auf eine unsachgemäße Sterilisation von Pinning-Werkzeugen hindeutet, und Abbildung 6 zeigt ein Beispiel für die Kontamination von ARP/MARP-Gefriermaterialplatten. Abbildung 7 zeigt, was passiert, wenn die Agar-Overlay während der Dereplikation durchbohrt wird. Schließlich zeigt Abbildung 8 MHB-Überlagerungen, die während des Dereplikationsprozesses auftreten können.
Abbildung 1: Ein Schaltplan des Dereplikationsprozesses. Der zu dereplizierende Produktionsstamm wird auf eine rechteckige Petrischale gestreift, da ein Rasen und eine Nitrozellulosemembran auf die Oberseite gelegt werden. Die Platte wird dann für 6 Tage inkubiert, wobei die produktions-stammbezogene Biomasse auf der Oberfläche der Membran wächst, während und sekundäre Metaboliten produziert werden in die Petrischale Medien sezerniert. Nach einer 6-tägigen Fermentationsphase wird die Membran entfernt und der Oberfläche des antibiotikahaltigen Mediums ein MHB-Overlay hinzugefügt, um eine glatte Oberfläche zum Anheften zu gewährleisten. Die ARP/MARP E. coli-Bibliothek, die in einem 96-Well-Plattenformat nach den ARP/MARP Maps angeordnet ist, wird dann auf die Oberfläche des Overlays gepinnt. Nach der Inkubation der Schale über Nacht bei 37 °C zeigt das Wachstum von E. coli-Stämmen, die bestimmte Resistenzgene exdrücken, die Identität der produzierten Verbindung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Dereplikation eines bekannten Antibiotikums. Der produzierende Stamm WAC 8921 wurde mit der ARP-Vorlage derepliziert. Wachstum von E. coli BW25113 -bamB-tolC pGDP1:CAT auf der Oberfläche des MHB Agar-Overlays zeigt an, dass WAC 8921 ein Chloramphenicol-Produzent ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dereplikation eines unbekannten Antibiotikums. Der produzierende Stamm WAC 9941 wurde mit der ARP-Vorlage derepliziert. Ein Mangel an E. coli Bibliothek Wachstum wurde auf der Oberfläche der rechteckigen Petrischale gesehen, was darauf hindeutet, dass entweder WAC 9441 produziert eine unbekannte antimikrobielle Verbindung oder ein seltenes Antibiotikum, das nicht in der ARP berücksichtigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Identifizierung einer antimikrobiellen Verbindung, die eine intakte äußere Membran nicht durchqueren kann. Der produzierende Stamm WAC 4178 wurde mit der MARP-Vorlage derepliziert. Stämme von E. coli BW25113 sind in der Lage, auf der Oberfläche des sekundären Metaboliten-haltigen Mediums zu wachsen, während alle Stämme von E. coli BW25113bamBtolC nicht wachsen können. Dies deutet darauf hin, dass WAC 4178 eine antimikrobielle Verbindung produziert, die eine intakte äußere Membran nicht durchqueren kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Kontamination durch nicht sterile Pinning-Werkzeuge. Der produzierende Stamm WAC 7094 wurde mit der ARP-Vorlage derepliziert. Das Vorhandensein von E. coli Bibliothek Wachstum in Bereichen, die nicht über einen zugewiesenen E. coli-Stamm haben, deutet darauf hin, dass die Pinning-Werkzeuge verwendet, um die MHB Agar-Overlay der rechteckigen Petrischale wurden nicht richtig sterilisiert. Dies führt zur Übertragung unbekannter E. coli-Stämme über das Overlay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Kontamination durch eine kontaminierte Tiefkühlaktie ARP/MARP-Vorlage. Der produzierende Stamm WAC 3683 wurde mit der ARP-Vorlage derepliziert. Auf der rechteckigen Petrischalenoberfläche wuchsen drei verschiedene E. coli-Kolonien: zwei entsprechen E. coli BW25113bamB-tolC, das STAT, ein Streptothricin-Resistenzenzym, exzessiert, und das andere entspricht E. coli. BW25113 -bamB-tolC exzessigran VIM-2ss, ein Enzym mit Lactam-Resistenz. Aufgrund des Mangels an replizierenden blaVIM2ss Kolonie Wachstum, zusätzlich zu dem Mangel an Kreuzresistenz bekannt, zwischen diesen beiden Antibiotika-Klassen auftreten, kann es angenommen werden, dass ein anderer Stamm als E. coli bamB tolC pGDP1: blaVIM2ss wächst in der jeweiligen eingefrorenen Bibliotheksplatte gut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Durchbohrte MHB-Agar-Overlay. Der produzierende Stamm WAC 5106 wurde mit der ARP-Vorlage derepliziert. Dieser Stamm wurde als Streptomycin-Produzent gefunden, wie das Wachstum von E. coli BW25113bamB- tolC pGDP3:aph(6)-Ia zeigt. Punktionslöcher sind auf der Oberfläche der MHB-Agar-Überlagerung entlang des Plattenumfangs zu sehen. Dies wirkt sich zwar nicht auf die Dereplikationsergebnisse aus, kann die Interpretation der Daten jedoch auf den ersten Blick schwierig machen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Kontamination der MHB-Agar-Overlay. Kontaminierter MHB-Agar erzeugt ein unregelmäßiges Wachstumsmuster auf der Oberfläche der Überlagerung, das nach der Inkubation der Platte über Nacht bei 37 °C sichtbar wird. Obwohl das E. coli-Wachstum durch die Kontamination noch sichtbar sein kann, wird empfohlen, das Experiment zu wiederholen, bevor Daten von der Platte extrapoliert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Plasmid | Wählbarer Marker |
| pBIP1 | Kanamycin 50 g/ml |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicillin 100 g/ml |
| pGDP4 | |
| nichts | - |
Tabelle 1: Wählbare Marker, die in der pGDP-Plasmidreihe verwendet werden. Streichen Sie die ARP/MARP E. coli-Stämme auf LB-Agar Petri-Schalen, die den entsprechenden wählbaren Marker mit der richtigen Konzentration für jedes Plasmid enthalten.
| medien | zutat | betrag |
| Sam | glukose | 15 g |
| Soja-Pepton | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| Hefe-Extrakt | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glycerin | 2,5 ml | |
| ddH2O | Bis 1 L | |
| Bennett es | Kartoffelstärke | 10 g |
| Casaminosäuren | 2 g | |
| Hefe-Extrakt | 1,8 g | |
| Czapek Mineralmischung | 2 mL | |
| Agar (optional) | 15 g | |
| ddH2O | Bis 1 L | |
| Czapek Mineralmischung | Kcl | 10 g |
| MgSO4bei 7H2O | 10 g | |
| NaNO3 | 12 g | |
| FeSO4x 7H2O | 0,2 g | |
| Konzentriertes HCl | 200 l | |
| ddH2O | Bis 100 ml |
Tabelle 2: Rezepte für SAM und Bennetts Medien und Czapek Mineralmischung. SAM und Bennett es vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 einstellen und die Czapek-Mineralmischung sterilisieren.
| Antibiotika-Klasse | antibiotikum | Widerstands-Gen | E. coli-Stamm | Well Position |
| Aminoglykoside | Streptomycin | aph(3'')-Ia | B25113 BW25113 | B3, G10 |
| 2- Deoxystreptamin | rmtB | B25113 BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycin | apmA | B25113 BW25113 | C5, F8 | |
| Spectinomycin | aph(9)-Ia | B25113 BW25113 | B5, G8 | |
| lactams | penizillin | NDM-1 | B25113 BW25113 | B4, G9 |
| Cephalosporin | ||||
| Carbapenam | ||||
| Lincosamides | Lincosamides | ermC | B25113 BW25113 | D4, E9 |
| Makrolide | Makrolide | ermC | ||
| Typ B Streptogramine | Typ B Streptogramine | ermC | ||
| Typ A Streptogramine | Typ A Streptogramine | vatD | B25113 BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | Stat | B25113 BW25113 | D3, E10 |
| Tetracycline | Tetracyclin | tet(A) | B25113 BW25113 | D5, E8 |
| Chloramphenicols | Chloramphenicols | katze | B25113 BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | B25113 BW25113 | F6, C7 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | B25113 BW25113 | E3, D10 |
| Polymyxine | Polymyxine | MCR-1 | Wildtyp BW25113 | C6, F7 |
| Echinomycins | Echinomycins | uvrA | B25113 BW25113 | F4, C9 |
| Sideromycins | Albomycin | fhuB mutant | B25113 BW25113 | C4, F9 |
| Tubractinomycine | Viomycin | Vph | B25113 BW25113 | F5, C8 |
| N/A | N/A | N/A | Wildtyp BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/A | N/A | N/A | B25113 BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabelle 3: Brunnenbezeichnungstabelle für die minimalen ARP-Stämme. Diese Tabelle zeigt an, in welchem Brunnen einer 96-Well-Platte jeder der minimalen ARP-Stämme gemäß der minimalen ARP-Bibliotheksplatte karte zu finden ist. Die Tabelle listet auch auf, gegen welche Antibiotikaklasse jedes Gen Resistenzen verleiht. Bitte beachten Sie, dass einige Gene Resistenzen gegen mehr als ein Antibiotikum innerhalb der gegebenen Antibiotikaklasse verleihen können.
| Antibiotika-Klasse | antibiotikum | Widerstands-Gen | E. coli-Stamm | Well Position |
| Aminoglykoside | Streptomycin | aph(3'')-Ia | B25113 BW25113 | B2, G11 |
| aph(6)-Ia | B25113 BW25113 | C6,F7 | ||
| Spectinomycin | aph(9)-Ia | B25113 BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicin | aac(3)-Ia | B25113 BW25113 | A3,H10 | |
| ant(2'')-Ia | B25113 BW25113 | A5, H8 | ||
| aph(2'')-Id | B25113 BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | B25113 BW25113 | A6, H7 | ||
| aac(6')-aph(2'')-Ia | B25113 BW25113 | B5,G8 | ||
| Kanamycin | aph(3')-Ia | B25113 BW25113 | B4, G9 | |
| aph(3')-Illa | B25113 BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycin | aph(4)-Ia | B25113 BW25113 | B6,G7 | |
| lactams | Amoxicillin | TEM-1 | B25113 BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidime | CTX-M-15 | B25113 BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacillin | OXA-10 | B25113 BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | B25113 BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | B25113 BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | B25113 BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | B25113 BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | B25113 BW25113 | F4, C9 | |
| Lincosamides | Lincosamides | ermC | B25113 BW25113 | C4, F9 |
| lnu(A) | B25113 BW25113 | C5, F8 | ||
| Makrolide | Makrolide | ermC | B25113 BW25113 | C4, F9 |
| mphA | B25113 BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | B25113 BW25113 | C2, F11 | ||
| Typ B Streptogramine | Typ B Streptogramine | ermC | B25113 BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | B25113 BW25113 | D4, E9 | ||
| Typ A Streptogramine | Typ A Streptogramine | vatD | B25113 BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | Stat | B25113 BW25113 | D3, E10 |
| Tetracycline | Tetracyclin | tet(M) | B25113 BW25113 | E5, D8 |
| Chloramphenicols | Chloramphenicols | katze | B25113 BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | B25113 BW25113 | H4, A9 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | B25113 BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | B25113 BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabelle 4: Brunnenbezeichnungstabelle für die ARP-Stämme. Diese Tabelle zeigt an, in welchem Brunnen einer 96-Well-Platte jeder der ARP-Stämme gemäß der ARP-Bibliotheksplatte karte zu finden ist. Die Tabelle listet auch auf, gegen welche Antibiotikaklasse jedes Gen Resistenzen verleiht. Bitte beachten Sie, dass einige Gene Resistenzen gegen mehr als ein Antibiotikum innerhalb der gegebenen Antibiotikaklasse verleihen können.
Ergänzende Abbildung 1: Bibliotheksplattenkarte, die für die ursprüngliche ARP-Vorlage (Antibiotikaresistenzplattform) verwendet wird. Organisieren Sie die jeweiligen E. coli-Stämme in einer 96-Well-Platte mit diesem Format, um sicherzustellen, dass alle notwendigen Kontrollen und Duplikate enthalten sind. Diese Zahl wurde von Cox et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Bibliotheksplattenkarte für die Vorlage für eine minimale Antibiotikaresistenzplattform (MARP). Organisieren Sie die jeweiligen E. coli-Stämme in einer 96-Well-Platte mit diesem Format, um sicherzustellen, dass alle notwendigen Kontrollen und Duplikate enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Das oben beschriebene Protokoll kann sowohl auf die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Verbindungen als auch auf Hilfsstoffe angewendet werden, die in Verbindung mit bestehenden Antibiotika zur Rettung ihrer Aktivität verwendet werden können. Die Plattform nutzt die hohe Substratspezifität von Resistenzmechanismen und deren Kognatenantibiotika, um Verbindungen in rohen Naturproduktextrakten zu dereplizieren. Obwohl die Fürdieherzustellenszeit benötigte Zeit lang ist (ca. 2 Wochen), ist der Dereplikationsprozess selbst nach einer einzigen innachten Inkubationszeit abgeschlossen, was im Vergleich zu der Zeit, die zum Isolieren und Charakterisieren eines Verbindung aus Rohextrakten. Darüber hinaus ist keine teure oder hochspezialisierte Ausrüstung erforderlich, was diese Plattform zugänglich und kostengünstig macht.
Ein weiterer großer Vorteil dieser Plattform ist ihre Flexibilität. Die ARP kann erweitert werden, um Resistenzgene zu enthalten, die mehr Antibiotikaklassen umfassen. Dies wird erreicht, indem Literatur zur Entstehung neuartiger Resistenzenzyme überwacht und grundlegende molekulare Klontechniken verwendet werden, um die Gene in die E. coli-Bibliothek einzutragen. Darüber hinaus ist die Dereplikationsvorlage basierend auf dem gewünschten Niveau der Breiten- oder Schmalbereichssubstratspezifität anpassbar, die eine Person beim Dereplikieren verwenden möchte. Jede Kombination von Genen in der E. coli-Bibliothek kann verwendet werden, um neuartige Bibliotheksplatten mit der Fähigkeit zu erstellen, Verbindungen mit verschiedenen Profilen zu erkennen. So könnte z.B. eine E. coli-Vorlage für die E. coli-Vorlage entwickelt werden, um die hochspezifische Dereplikation von S-Lactams und deren verschiedenen Unterklassen zu ermöglichen.
Während diese Plattform ursprünglich entwickelt wurde, um Verbindungen auf festen Medien zu dereplizieren, es war auch in flüssigen Medien. Dies ist nützlich bei der Arbeit mit Verbindungen, die bereits gereinigt wurden, wobei nur eine begrenzte Menge für Tests zur Verfügung steht, oder bei der Arbeit mit Verbindungen, die nicht leicht oder konsistent in festen Medien diffundieren. Während dieses Protokoll mit den E. coli-Stämmen BW25113 und BW25113bamB-tolCbeschriebenwurde, kann die Plattform mit der Resistenz-Genbibliothek verwendet werden, die in verschiedenen Stämmen von E. coli (Dereplikation Phänotypen können variieren). Letztlich ist die Antibiotikaresistenzplattform flexibel, hat viele Anwendungen und ist vorteilhaft gegenüber anderen Dereplikationsmethoden.
Um sicherzustellen, dass reproduzierbare und nicht kontaminierte Ergebnisse erzielt werden, ist es wichtig, geeignete Sterilisations- und aseptische Techniken zu befolgen. Andernfalls werden die Anheftwerkzeuge, die Bibliotheksplatte oder die Dereplikationsplatte selbst kontaminiert. Während wählbare Marker in der E. coli-Bibliothek vorhanden sind, die dazu beitragen können, eine Kontamination durch Bakterien zu verhindern, die den Marker verfehlen, verhindert dies nicht die Kreuzkontamination von Stämmen mit demselben Marker. Um das Risiko zu reduzieren, ist es wichtig, die bakteriellen Pinning-Werkzeuge sorgfältig zu sterilisieren, bevor sie von der Bibliotheksplatte geheftet werden. Jede Bibliotheksplatte sollte nur maximal 3-4 mal angeheftet werden, bevor sie für eine neue Vorlage verworfen wird. Dadurch wird die Ausbreitung von Verunreinigungen auf alle Dereplikationsplatten verhindert, wenn eine Bibliotheksplatte während des Pinning-Prozesses kontaminiert wird. Darüber hinaus werden bei der Impfung der Dereplikationsplatte keine Antibiotika verwendet, so dass sehr darauf geachtet werden muss, eine Kontamination zu verhindern, bevor sie sechs Tage lang gärung. Eine weitere mögliche Kontaminationsquelle ist die MHB-Agar-Überlagerung der Dereplikationsplatte. Wenn das Overlay-Medium kontaminiert ist, tritt das Wachstum erst nach der nächtlichen Inkubation bei 37 °C nach dem Pinning auf. Eine Überlagerungskontamination kann es extrem schwierig machen, das Wachstum der E. coli-Bibliothek auf der Overlay-Oberfläche zu analysieren. Um die Wahrscheinlichkeit einer Überlagerungzuverunreinigung zu reduzieren, bereiten Sie den MHB-Agar frisch vor, bevor Sie die Überlagerung gießen. Es wird empfohlen, dass, bis eine Person mit dieser Methode vertraut ist, Dereplikationsplatten immer in dupliziert oder dreifach so vorbereitet werden, dass im Falle einer Kontamination einer Platte die Daten noch aus der hoffentlich nicht kontaminierte Platten.
Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass das ARP/MARP Einschränkungen hat. Dieses Protokoll eignet sich nicht für die Dereplikation von Produktionsstämmen, die mehr als eine bioaktive Verbindung produzieren. Jeder Stamm in der E. coli-Bibliothek wurde entwickelt, um ein einzelnes Resistenzgen auszudrücken. Wenn zwei Antibiotika von einem Organismus produziert werden, wird kein Resistenzgen Resistenzgegenstoß gegen das zweite Antibiotikum verleihen, was zum Zelltod beider Stämme führt. Daher muss diese Möglichkeit in Betracht gezogen werden, wenn Dereplikationsergebnisse auf das Vorhandensein eines neuartigen Antibiotikums hindeuten, da die Produktion mehrerer Antibiotika durch das aktuelle Einzelkonstrukt E. coli-Bibliothek nicht nachgewiesen werden kann. Ein Ansatz, der ergriffen werden kann, um die Herausforderung der Dereplikation von Stämmen zu bekämpfen, die mehr als ein Antibiotikum produzieren, beinhaltet die Verwendung des Agar-Plug-Verfahrens, das im ursprünglichen ARP-Papier von Cox et al.10beschrieben wird. Bei dieser Methode wird ein Teil eines fermentierten feststoffhaltigen Mediums von einem Antibiotika-Produzenten entfernt, der Platte enthält, und auf einen Rasen mit Indikator-ARP-Stamm gelegt. Der Indikatorstamm kann einer der resistenten E. coli-Stämme in der ARP-Bibliothek sein. Hemmungszonen werden dann verwendet, um die Bioaktivität eines Produzierenden Stammes mit den ARP-Stämmen und einem Wildstamm zu vergleichen. ARP-Stämme, die eine hemmende Zone von verminderter Größe im Vergleich zum Wild-Typ-Stamm bilden, können der produzierten Verbindung widerstehen. Diese Methode hat sich bei der Identifizierung von Stämmen, die mehrere Antibiotika produzieren können, als wirksam erwiesen10.
Zusammenfassend wird empfohlen, dereplikationsplatten doppelt oder dreifach herzustellen, um die besten Ergebnisse bei der Dereplikation mit dem ARP/MARP zu erzielen. Weitere wichtige Schritte des Protokolls sind das Anheften von einer frischen Bibliotheksplatte (nie eingefroren) und das Entfernen von so viel Biomasse wie möglich aus dem Produktionsstamm während der Membranentfernungsphase. Wenn alle notwendigen Schritte befolgt werden, sollte man innerhalb von zwei Wochen erfolgreiche Dereplikationsergebnisse für eine Produktions-Interessens-Sorte haben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Forschung im Wright-Labor im Bereich aRP/MARP wurde vom Ontario Research Fund und dem Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463) unterstützt. Wir möchten Sommer Chou für seine Unterstützung bei der Erweiterung und Organisation der ARP-Bibliothek danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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