Summary
אנו מתארים פלטפורמה כי מנצל את הספרייה של עמידות לאנטיביוטיקה איזוגניים לdereplication של אנטיביוטיקה . הזהות של אנטיביוטיקה המיוצר על ידי חיידקים או פטריות ניתן להסיק על ידי הצמיחה של E. coli ביטוי ההתנגדות המתאים שלה הגן. פלטפורמה זו יעילה כלכלית וחסכונית בזמן.
Abstract
אחד האתגרים העיקריים בחיפוש אחר אנטיביוטיקה חדשה מתמציות המוצר הטבעי הוא גילוי מחדש של תרכובות נפוצות. כדי להתמודד עם האתגר הזה, dereplication, שהוא תהליך של זיהוי תרכובות ידועות, מבוצע על דגימות של עניין. שיטות לdereplication כגון הפרדה אנליטית ולאחריה ספקטרומטר מסה הינן צורכות זמן רב ועתירות משאבים. כדי לשפר את תהליך dereplication, פיתחנו את פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP). ARP היא ספריה של כ 100 גנים עמידות לאנטיביוטיקה ששוכפל בנפרד לתוך es, coli. אוסף זה הנבג יש יישומים רבים, כולל שיטה חסכונית ונתיישב עבור אנטיביוטיקה dereplication. התהליך כולל תסיסה של חיידקים המייצרים אנטיביוטיקה על פני השטח של מנות פטרי מלבני המכילות בינונית יציבה, ובכך מאפשר הפרשה ודיפוזיה של מטבוליטים משני דרך המדיום. לאחר תקופת תסיסה של 6 ימים, מסירים את ביומסה החיידקים, ומוסיפים לצלחת הפטרי דק שכבת-על כדי ליצור משטח חלק ולאפשר את התפתחותם של זנים מחוון ה-coli . האוסף שלנו של זני ARP מוצמד לאחר מכן על פני השטח של צלחת פטרי המכילה את האנטיביוטיקה. הצלחת היא הדגירה הבאה לילה כדי לאפשר צמיחה E. coli על פני השטח של כיסוי. רק זנים המכילים התנגדות אנטיביוטי ספציפי (או הכיתה) לגדול על פני השטח הזה מאפשר זיהוי מהיר של התרכובת המיוצר. שיטה זו בוצעה בהצלחה לזיהוי יצרנים של אנטיביוטיקה ידועה וכאמצעי לזיהוי אלה המייצרים תרכובות הרומן.
Introduction
מאז גילוי של פניצילין ב 1928, מוצרים טבעיים נגזר מיקרואורגניזמים סביבתיים הוכיחו להיות מקור עשיר של תרכובות מיקרוביאלית1. כ 80% של אנטיביוטיקה המוצר הטבעי נגזרות חיידקים של סוג Streptomyces ואקטיטיטים אחרים, בעוד 20% הנותרים מופק על ידי מינים פטרייתי1. כמה מהפיגומים הנפוצים ביותר לאנטיביוטיקה המשמשים במרפאה כגון β-lactams, טטרציקווים, rifamycins, ו הקוגליניים, היו מבודדים במקור מחיידקים2. עם זאת, בשל עלייתה של עמיד בפני סמים (mdr) חיידקים, פאנל הנוכחי שלנו של אנטיביוטיקה הפך פחות יעיל בטיפול3,4. אלה כוללים את "ESKAPE" פתוגנים (כלומר, vancomycin עמידים בפני בידור ו β-lactam עמידים בפני לקטקוקוס, klebsiella דלקת ריאות, הפסאודומונס aeruginosa, acineטבק הביטוחהעצמי, ו Enterobacter sp.), המהווה תת-ערכה של חיידקים, הנחשבים לבעלי הסיכון הגבוה ביותר על-ידי מספר רשויות בריאות הציבור הגדולות כגון ארגון הבריאות העולמי3,4,5. הופעתה הגלובלית התפשטות של אלה mdr פתוגנים תוצאות הצורך קבוע עבור אנטיביוטיקה הרומן3,4,5. למרבה הצער, שני העשורים האחרונים הוכיחו כי גילוי של אנטיביוטיקה הרומן ממקורות מיקרוביאלית הוא קשה יותר ויותר6. הגישות הנוכחיות לגילוי הסמים כוללות הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות אקטיביים, כולל ספריות מוצר טבעי לחלץ, המאפשר אלפי תמציות להיבדק בזמן נתון2. עם זאת, לאחר מזוהה פעילות מיקרוביאלית, השלב הבא הוא לנתח את התוכן של התמצית גולמי כדי לזהות את הרכיב הפעיל ולסלק את אלה המכילים תרכובות ידועות או יתירים7,8. תהליך זה, המכונה dereplication, חיוני כדי למנוע ו/או להקטין באופן משמעותי את הזמן המושקע בגילוי מחדש של אנטיביוטיקה ידועה7,9. למרות שצעד הכרחי בגילוי הסמים הטבעי של המוצר, dereplication הוא מפרך לשמצה ואינטנסיבי משאבים10.
מאז beutler et al. לראשונה נטבע את המונח "dereplication", מאמצים נרחבים נעשו כדי לפתח אסטרטגיות חדשניות לזיהוי מהיר של אנטיביוטיקה ידועה11,12. כיום הכלים השכיחים ביותר המשמשים לdereplication כוללים מערכות כרומטוגרפיות אנליטיות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטר מסה, ושיטות זיהוי מבוססות תהודה מגנטית גרעינית11,13. למרבה הצער, כל אחת מהשיטות הללו מחייבת שימוש בציוד אנליטי יקר ובפרשנות נתונים מתוחכמת.
בניסיון לפתח שיטה dereplication שניתן לבצע במהירות ללא ציוד מיוחד, הקמנו פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP)10. ARP יכול לשמש לגילוי של שדון אנטיביוטי, הפרופיל של תרכובות אנטיביוטיות חדשות נגד מנגנוני ההתנגדות ידוע, ואת dereplication של אנטיביוטיקה ידועים בתמציות הנגזרות של אקאובקטריה וחיידקים אחרים. כאן, אנו מתמקדים ביישום שלה dereplication אנטיביוטי. ARP מנצל את הספריה של איזוגניים es, המאשכיה זנים המבטא גנים בודדים התנגדות כי הם יעילים נגד אנטיביוטיקה הנפוץ ביותר מחדש גילו14,15. כאשר הספרייה E. coli גדל בנוכחות של אורגניזם משני מייצר מטבוליזם, את הזהות של המתחם ניתן להסיק על ידי הצמיחה של החיידק של E. coli המבטאים הגן הקשור שלה התנגדות10. כאשר ה-ARP דווח לראשונה, הספריה כללה > 40 גנים הענקת עמידות ל -16 שיעורי אנטיביוטי. תבנית הdereplication המקורית תוכננה להקיף תת-ערכה של גנים ההתנגדות לכל מחלקה לאנטיביוטיקה כדי לספק מידע לגבי מחלקת משנה אנטיביוטי בתהליך dereplication. כיום, ה-ARP מורכב מ> 90 גנים המקנים עמידות ל -18 שיעורים אנטיביוטיים. באמצעות האוסף הנרחב שלנו של גנים ההתנגדות, תבנית dereplication משנית פותחה והוא ידוע כפלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה מינימלית (MARP). תבנית זו נוצרה כדי למנוע יתירות גנטית כדי פשוט לספק מידע לגבי המעמד האנטיביוטי הכללי כי מטבוליט dereplicated lite קשורה. בנוסף, התבנית MARP מחזיקה הן מסוג wildtype ואת המתח היתר/לקוי של E. coli BW25113 (e. Coli BW25113 ΔbambΔtolc), לעומת הגלגול המקורי של ה-ARP, אשר רק מנצל את המתח היפרחדיר. היבט ייחודי זה יוצר פנוטיפים נוספים במהלך dereplication, המציין את היכולת תרכובות לחצות את הקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק להיות שלאחר מכן כאשר מקבל הפחתה עם ה-ARP ו/או MARP, להדגיש את הצעדים הקריטיים ביותר לעקוב, ולדון בתוצאות אפשריות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הספריה E. coli מניות גליצרול (מאת אגר סלטס)
- פס החיידק ARP/MARP E. coli מציר lysogeny קימוט (LB) אגר הסלטים על מנות פטרי המכילות LB אגר ואת סמן לבחירה המתאים (שולחן 1).
- הכינו תרבויות עבור כל אחד מזני E. coli על ידי הנעם 3 מ ל של LB המכיל את סמן לבחירה המתאים עם מושבה אחת. לגדול לילה ב 37 ° צ' עם האוורור (250 rpm).
- לשלב 800 μL של התרבות ו 200 μL של שילוב של 80% גליצרול ב-mL 1.8 בהקפאה. מערבבים על ידי היפוך הצינורות 3-4 פעמים, ולאחסן ב-80 ° c.
2. ARP/MARP מלאי קפואים לוח הספרייה הכנה
- פס הזנים ARP/MARP מתוך מניות גלירול שהוכנו בסעיף 1 על קבוצה חדשה של מנות פטרי המכילות LB אגר ו סמן לבחירה המתאים. הגדלים בלילה ב 37 ° c.
- באמצעות טכניקה אספטי, פיפטה 500 μL של הקטיון מותאם מולר הינטון מרק (MHB) ממאגר סטרילי לתוך כל באר של הצלחת סטרילית 96 היטב בעומק.
- עם לוחיות המוכנות בשלב 2.1, השתמש המוליך מקל כדי לחסן את הצלחת 96 הבאר העמוקה בהתאם למפת ARP/MARP (משלים איור 1 ומשלים איור 2). ודא שסמן הבחירה המתאים נוסף לכל באר. מניחים ממברנה איטום לנשימה על פני השטח של צלחת הבאר העמוקה מודדת לילה ב 37 ° צ' (250 rpm).
- ודא שאין בארות מזוהמות על-ידי התייחסות למפת ARP/MARP. . אני חוזר אם מזוהם שימוש בצינורות מרובי ערוצים, העברת 100 μL מכל באר של צלחת הבאר העמוקה לצלחת סטרילית 96-היטב עגול התחתון. חזור על שלב זה כדי ליצור מספר לוחיות של ספריית מלאי קפואה.
הערה: מומלץ להכין לפחות 5 לוחות ספריה בכל פעם כדי לשמור על שלבים חוזרים 2.1-2.4 למקרה של זיהום לוחית של הספרייה מלאי קפוא. - סיים לעשות את הצלחות ARP/MARP קפואים הספרייה על ידי pipetting 100 μL של סטרילי 50% גליצרול לתוך כל טוב ולערבב על ידי בעדינות ללטף למעלה ולמטה.
- מכסים את הצלחות עם חותמות אלומיניום סטרילי ולהבטיח כי כל טוב הוא אטום בנפרד.
- מספר לוחיות ולהקדיש רק אחד המלאי קפוא לוחית הספרייה לצורך מחדש תבניות חדשות בזמן נתון. שמור את השארית כמו גיבוי במקרה של זיהום לוחית של ספריית מלאי קפוא.
- הניחו את מכסה הצלחת על גבי חותם האלומיניום והחנות ב-80 ° c.
3. תרבית זרעים וDereplication הכנה לצלחת
- באמצעות מקל המוליך, איחסן 3 מ ל של Streptomyces אנטיביוטי בינוני (SAM) (או בינוני מתאים אחרים עבור האורגניזם נבדק) במבחנה המכילה אחת חרוז זכוכית סטרילי (כדי לשבור את mycelium) עם זן לייצר כי הוא להיות dereplicated. בשביל Streptomyces, מגרדים בעדינות. נבגים מהמשטח של מושבה
- באמצעות אותו המוליך עץ מקל, רצף שליטה עקרות על צלחת פטרי המכילה אגר של בנט.
- מודקת את התרבות הזרעים ב 30 ° צ' עם אוורור עבור 6 ימים (250 rpm) ו מודקת צלחת בקרת עקרות ב 30 ° c עבור 6 ימים.
הערה: התייחס לטבלה 2 עבור מתכוני המדיה של סם ובנט. ההנחיות המפורטות לעיל מתאימות למרבית האקומיקטיטים. לשנות את מדיית הצמיחה לפי הצורך עבור חיידקים ופטריות אחרים. - הכינו לוחות dereplication על ידי מוחצות 23 מ ל של בנט חם אגר לתוך פיפטה סרוולוגית ומוותר 20 מ"ל באופן שווה על פני השטח של צלחת פטרי מלבנית (טבלה של חומרים), משאיר את שאר המדיום בפיפטה כדי למנוע היווצרות בועת אוויר.
הערה: ודא כי פני השטח משמש ליציקת צלחות היא רמה ולבצע את השלב הזה לפני אגר התקרר יותר מדי; משטח שטוח חיוני להצמדת ספריה בשלבים הבאים. - לסובב בעדינות את הצלחת עד המדיום מכסה את כל האזורים של הצלחת ולא להפריע זה עד אגר הוגדר לחלוטין.
- הכנת הממברנה ממברנה ניטרוגליצרין גיליונות (טבלה של חומרים) באמצעות מכסה צלחת פטרי מלבני כתבנית עקיבה כך הסדינים להתאים את פני השטח של צלחת dereplication. חותכים את הסדינים ומקלבים אותם בנרתיק סטרילי.
הערה: קרום זה מאפשר אורגניזמים לספורקה על פני השטח שלה, בעוד מטבוליטים משני עשוי להיות מופרש לתוך המדיום למטה. לאחר שגדלו, הקרום מוסר כדי לספק משטח נקי עבור dereplication. ההתאמה הקרובה ביותר של נייר הממברנה על פני השטח של האגר של בנט, המנקה את התוצאה הdereplication. - בדוק את צלחת בקרת עקרות כדי להבטיח כי לא קיימים מזהמים לאחר 6 ימים של דגירה. אם מזהמים ללא זיהום, להסיר את המכסה של צלחת פטרי מלבני ו פיפטה 200 μL של תרבות הזרעים על פני השטח של אגר של בנט.
- הפיצו באופן שווה את התרבות על פני המשטח של הצלחת כולה בעזרת משטח כותנה סטרילי.
- מניחים את קרום הניטרוצלולוזה מוכן בשלב 3.6 על גבי התרבות על פני צלחת פטרי. התחל על ידי יישור הקצה התחתון של הקרום לקצה התחתון של צלחת פטרי, ולאחר מכן להחיל את קרום מהקצה התחתון לקצה העליון של הצלחת.
- השתמש בספוגית כותנה סטרילי להחליק כל בועות אוויר שייתכן שנוצרו בין ממשק קרום-אגר, להבטיח כי הקרום הוא סומק אגר.
- הניחו את המכסה על צלחת פטרי מלבנית ומניחים אותו הפוך בשקית ניילון אטומה. מודטה ב -30 ° c במשך 6 ימים.
4. לוחית הDereplication של MHB כיסוי ו-ARP/מארפ הכנה לצלחת
- לאחר 6 ימים, הסירו את הצלחת הdereplication מהאינקובטור של 30 ° c. באמצעות מלקחיים סטרילית (autoclaved או מרוסז ביסודיות עם 70% אתנול), בזהירות להסיר את קרום הניטרוצלולוזה מפני השטח של באגר של בנט.
הערה: צעד זה יסיר את הנבגים של הידרופובי ומיסיליה גדלו על פני הקרום כדי לספק משטח נקי עבור dereplication, הקלה על שלב 4.2. - כפי שמתואר עבור שלב 3.4, להבטיח את משטח העבודה הוא ברמה ולהשתמש בצנרת סרולוגית לאספירין 23 מ ל של הקטיון חם מותאם mhb אגר. ליצור כיסוי על ידי חילוק 20 מ"ל באופן שווה על פני השטח של הצלחת dereplication, להשאיר את שאר המדיום בתוך הפיפטה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
- לסובב בעדינות את הצלחת עד המדיום מכסה את כל האזורים ולא להפריע לו עד אגר הוגדר לחלוטין. ברגע שהוא התקרר והתחזק, החזר את הצלחת הdereplication לשקית הפלסטיק האטומה ואחסן אותו הפוך ב -4 ° c בלילה.
הערה: שלב זה מאפשר דיפוזיה של מטבוליטים משניים מן המדיום של בנט מותסס לתוך כיסוי MHB אגר. אם הממברנה התאית לא היה מוכן כראוי יהיה גידול נבג סביב קצות הצלחת, אשר יש תכונות הידרופובי להדוף את MHB אגר. אל תשפוך את הכיסוי על גבי הנבגים האלה כי זה יכול לגרום לזיהום של כיסוי. - באותו יום שנשפך הכיסוי, הופך תבנית ARP/MARP טרייה על-ידי ליטוף 100 μL של הקטיון MHB לתוך כל טוב של צלחת 96-באר.
הערה: כדי להפחית את הסיכוי לפזר זיהום במהלך dereplication, להשתמש בלוח הספרייה ARP/MARP אחת רק כדי dereplicate 2-3 לוחות dereplication. לכן, החיסונים מספיק 96-טוב ARP/לוחות MARP מבוסס על מספר זנים שיהיו dereplicated. - קח את הלוח הקפוא ARP/MARP לוחית הספרייה מתוך-80 מקפיא ° c. הסר את חותם האלומיניום לפני העיבוי מתחיל להיווצר על הצד התחתון, ובכך להקטין את הסיכוי לזהם בארות השכנות בלוח הספרייה.
- באמצעות שימוש סטרילי 96-הצמדה כלים (או צורות אחרות של ציוד חיסונים), סיכה בזהירות מלוח המלאי הקפוא ARP/MARP הספרייה לחישוב החדש MHB-המכיל 96-טוב צלחות. כדי למזער את הזיהום במהלך dereplication, להכין כמו ARP רבים או לוחיות הספרייה MARP הדרושים רק dereplicate 2-3 לוחות dereplication לכל לוחית הספרייה. חטא כלים הצמדה בין מספר כל צלחת.
- שים חותם אלומיניום סטרילי חדש על התבנית הקפואה פעם אחת להשלים ולהחזיר אותו למקפיא-80 ° c. מניחים את 96 מחוסן-לוחות היטב בתוך שקית פלסטיק אטומה ו-דגירה ב 37 ° צ' עם אוורור (250 rpm) עבור 18 h.
הערה: חדש לוחיות הספרייה מלאי קפוא ניתן להכין משלב זה לאחר להבטיח כי אין זיהום קיים. הוסיפו גליצרול לצלחת לפני שאתם מאחסנים ב-80 ° צ' כמתואר בשלב 2.5.
5. מיקוד באמצעות ה-ARP/מארפ
- הסר את תבנית ARP/MARP מהאינקובטור וודא כי לא קיימים מזהמים. תמיד באמצעות תבנית שמוכנה טרי ולא ישירות מהמלאי הקפוא.
- הסירו את לוחות הdereplication מ -4 ° צ' והניחו לטמפרטורת החדר להיות מעורפלת. אם יש עיבוי, פתח את המכסים ואפשר להתייבש בסביבה סטרילית.
- שימוש בכלים הצמדה סטרילי (או ציוד חיסונים אחרים), פינים מלוח הספרייה ARP/MARP על פני השטח של כיסוי MHB אגר של לוחות dereplication. להיזהר לא לנקב את אגר. לחטא כלים הצמדה בין לאשר כל צלחת dereplication.
- לאחר הצמדת התבנית אל פני השטח של הלוחות הdereplication, הניחו לתבנית להתייבש במשך 3 עד 5 דקות. מניחים את הצלחות dereplication מחוסן הפוכה בשקית פלסטיק אטומה, ומטה לילה ב 37 ° c.
- Dereplication לנתח תוצאות למחרת על ידי השוואת הצמיחה על צלחת dereplication לבארות המתאימות למפת ARP/MARP (שולחן 3 ושולחן 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות הבאות הושגו כאשר אוסף של זנים של מdereplicated לאנטיביוטיקה הפקת הריבית היו באמצעות ה-ARP ו/או MARP.
דיאגרמה של זרימת העבודה dereplication ARP/MARP מתוארת באיור 1, ומפות לוחית הספרייה מוצגות באיור המשלים 1 ובאיור 2. איור 2 מדגים תוצאה חיובית dereplication שבו התמצית הסביבתית wac 8921 מזוהה כמו מפיק כלורמפאנרול. איור 3 מראה העדר הצמיחה ARP לחלוטין, אשר מציין את הנוכחות של אנטיביוטיקה לא ידוע או אנטיביוטי בדרך כלל פחות נמצא כי לא בחשבון ARP/marp לוחית הספרייה. איור 4 מדגים דפוס גדילה כי הוא ייחודי marp בגלל הניצול שלו של שניהם החיידק הBW25113 ו-hyperחדירות לקויה e. coli BW25113 ΔbambΔtolc. תוצאה זו מרמזת על נוכחות של תרכובת עם פעילות מיקרוביאלית כי הוא לא יכול לעלות על הקרום החיצוני שלם. איור 5 מראה דפוס הגדילה של E. coli המציעה עיקור לא תקין של כלים הצמדה איור 6 מראה דוגמה של ARP/מארפ מלאי קפוא לוחית הספרייה זיהום. איור 7 מדגים מה קורה אם כיסוי אגר הוא נדקר במהלך dereplication. לבסוף, איור 8 מראה זיהום שכבת-על של mhb הקשורים שיכול להתרחש במהלך תהליך dereplication.
איור 1: סכמטית של התהליך הdereplication. מאמץ לייצר להיות dereplicated הוא מתוח על צלחת פטרי מלבני כמו מדשאה וממברנה ניטרוצלולוזה מושם על גבי. הצלחת הוא לאחר מכן מודדת עבור 6 ימים שבו לייצר-זן ביומסה הקשורים גדל על פני השטח של קרום בעוד מטבוליטים משני המיוצר מופרש לתוך מדיה צלחת פטרי. לאחר תקופת תסיסה של 6 ימים, הקרום מוסר וכיסוי MHB מתווסף למשטח של המדיה המכילה אנטיביוטיקה כדי לספק משטח חלק עבור הצמדה. הספרייה ARP/MARP E. coli , אשר מסודרים בתבנית צלחת 96-באר בהתאם למפות ARP/marp, מוצמדת לאחר מכן אל פני השטח של הכיסוי. לאחר הדגירה של מגש לילה ב 37 ° c, הצמיחה של ה-coli זנים המבטא גנים ספציפיים התנגדות מציין את זהותו של התרכובת המיוצר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: Dereplication של אנטיביוטיקה ידועה. המתח הייצור WAC 8921 היה dereplicated באמצעות תבנית ARP. צמיחה של E. coli BW25113 ΔBambΔtolc pGDP1:חתול על פני השטח של כיסוי mhb אגר מציין כי wac 8921 הוא מפיק כלוראמאנקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: Dereplication של אנטיביוטיקה לא ידוע. המתח הייצור WAC 9941 היה dereplicated באמצעות תבנית ARP. חוסר של הצמיחה של הספרייה E. coli היה נראה על פני השטח של צלחת פטרי מלבנית, המציינת כי או wac 9441 מייצר מתחם מיקרוביאלית לא ידוע או אנטיביוטיקה נדירה שאינה מזוהה ב-ARP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי תרכובת מיקרוביאלית שאינה יכולה לחצות קרום חיצוני שאינו שלם. המתח לייצר WAC 4178 היה dereplicated באמצעות תבנית MARP. זנים של e. coli BW25113 מסוגלים לצמוח על פני השטח של התקשורת המשנית המכילים מטבוליזם, בעוד כל הזנים של e. Coli BW25113 ΔbambΔtolc לא יכול לצמוח. זה עולה כי WAC 4178 מייצר תרכובת מיקרוביאלית כי לא יכול לחצות קרום החיצוני שלמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: זיהום עקב כלים הצמדה לא סטרילי. המתח הייצור WAC 7094 היה dereplicated באמצעות תבנית ARP. הנוכחות של e. coli הצמיחה הספרייה באזורים שלא היה מוקצה מאמץ e. coli מציע כי כלי ההצמדה המשמשים לאיחסן את כיסוי Mhb אגר של צלחת פטרי מלבני לא היה מעוקר כראוי. התוצאה היא העברת זנים של E. coli לא ידוע על פני כיסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: זיהום בשל מזוהמים מזוהם מלאי ARP/תבנית MARP. המתח הייצור WAC 3683 היה dereplicated באמצעות תבנית ARP. שלושה ברורים E. coli מושבות גדלו על פני השטח מלבני פטרי: שני תואמים עם E. Coli BW25113 ΔbambΔtolc ביטוי STAT, אנזים התנגדות סטרפטו, והשני מתאים E. coli BW25113 ΔbambΔtolc ביטוי ועוד 2ss, אנזים התנגדות β lactam. בשל חוסר שכפול צמיחה blaVIM2ss המושבה, בנוסף העדר התנגדות חוצה ידוע להתרחש בין אלה שתי שיעורים אנטיביוטי, ניתן להניח כי זן אחר מאשר E. coli ΔbambΔ tolC pGDP1: בלהVIM2ss היא גוברת הצלחת ספרייה קפואה המתאימים היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: פירסינג כיסוי MHB באגר. המתח הייצור WAC 5106 היה dereplicated באמצעות תבנית ARP. זן זה נמצא להיות מפיק סטרפטומיצין, כפי שמצוין על ידי הצמיחה של E. coli BW25113 ΔBambΔtolc pGDP3:אסף (6)-Ia. חורים ניקוב ניתן לראות על פני השטח של כיסוי MHB אגר לאורך היקף הצלחת. למרות שזה לא משפיע על התוצאות dereplication, זה יכול להפוך את הנתונים קשה לפרש במבט ראשון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: זיהום של כיסוי MHB אגר. מזוהמים MHB אגר מייצרת דפוס גדילה חריגה על פני השטח של כיסוי זה הופך גלוי לאחר הדגירה של הצלחת לילה ב 37 ° c. אמנם הצמיחה של E. coli עדיין יכול להיות גלוי דרך הזיהום, מומלץ לחזור על הניסוי לפני העברת נתונים מהצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פלסמיד | סמן לבחירה |
| pGDP1 | קאנאמיצין 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | אמפיצילין 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| לא | - |
טבלה 1: סמנים לבחירה המשמשים בסדרת pGDP ג. פס החיידק ARP/MARP E. coli על ליברות אגר מנות פטרי המכיל את סמן לבחירה המתאים בריכוז הנכון עבור כל פלסאמצע.
| דיה | מרכיב | כמות |
| סאם | גלוקוז | מיכל ה, 15 גר' |
| פנימה סויה | מיכל ה, 15 גר' | |
| מיכל שלמה | 5 גר' | |
| תמצית שמרים | מיכל הג | |
| מיכלהג | מיכל הג | |
| גליצרול | 2.5 מ ל | |
| הנריהשני | עד 1 ליטר | |
| של בנט | עמילן תפוחי אדמה | משחק 10 |
| חומצות אמינו | 2 הוראות המשחק | |
| תמצית שמרים | 1.8 גרם | |
| שילוב מינרלי czapek | 2 מ ל | |
| אגר (אופציה) | מיכל ה, 15 גר' | |
| הנריהשני | עד 1 ליטר | |
| שילוב מינרלי czapek | אשלגן כלורי | משחק 10 |
| MgSO4∙ 7h2O | משחק 10 | |
| ננו3 | מיכל ה, 12 גר' | |
| כלהארבעה∙ 7h2O | 0.2 גרם | |
| מרוכז HCl | 200 מיקרומטר | |
| הנריהשני | עד 100 mL |
שולחן 2: מתכונים עבור התקשורת של סם ובנט, ו Czapek תערובת מינרלים. להתאים את SAM ובנט ל-pH 6.8 לפני אוטוקלינג, ולסנן לעקר את תערובת מינרלים Czapek.
| מחלקת אנטיביוטי | אנטיביוטיקה | גן ההתנגדות | אי החיידק זן | ובכן מיקום |
| עמינח גליפאות | סטרפטומיצין | אסף (3 ' ')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-Deoxystreptamine | הפקודה rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3, C10 | |
| אפרקמיצין | אפמה | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | |
| Spectinomycin | אסף (9)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | |
| β-לקטאמים | פניצילין | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| צפלוספורין | ||||
| קרבאפאם | ||||
| לינקוזדס | לינקוזדס | ארמק | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| Macrolides | Macrolides | ארמק | ||
| סוג B סטרפטוגרנס | סוג B סטרפטוגרנס | ארמק | ||
| הקלד סטרפטוגרנס | הקלד סטרפטוגרנס | ווטד | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 |
| סטרפטותריצין | סטרפטותריצין | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| טטרציקלינים | טטרציקלין | ט (א) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| כלורמפנניקול | כלורמפנניקול | חתול | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| הספקוקינים | הספקוקינים | פוסה | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| ריפיאלינים | ריפיאלינים | עיבוד | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| פולימיקסינים | פולימיקסינים | MCR-1 | פראי סוג BW25113 | C6, F7 |
| קיפוקוקינים | קיפוקוקינים | עובדה | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 |
| סידרומיקונים | אלבומיצין | מוטציה fhuB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| טובראקקוקינים | Viomycin | מיכל בונוביץ | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 |
| N/A | N/A | N/A | פראי סוג BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
טבלה 3: ובכן שולחן הייעוד עבור זנים ARP מינימלי. שולחן זה מציין באיזו מידה יש למצוא צלחת של 96-באר שכל אחד מזני ה-ARP המינימליים נמצאים בהתאם למפת הלוחית המינימלית של ספריית ARP. הטבלה גם מפרטת איזו מחלקה אנטיביוטית כל גן מגייס התנגדות. אנא שימו לב כי גנים מסוימים עשויים להעניק עמידות ליותר מאנטיביוטיקה אחת בתוך שיעור אנטיביוטי נתון.
| מחלקת אנטיביוטי | אנטיביוטיקה | גן ההתנגדות | אי החיידק זן | ובכן מיקום |
| עמינח גליפאות | סטרפטומיצין | אסף (3 ' ')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2, G11 |
| אסף (6)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6, F7 | ||
| Spectinomycin | אסף (9)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicin | aac (3)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| ant (2 ' ')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, H8 | ||
| אסף (2 ')-Id | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4, H9 | ||
| armA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6, H7 | ||
| aac (6 ')-אסף (2 ' ')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | ||
| קאנאמיצין | אסף (3 ')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| אסף (3 ')-גילה | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycin | אסף (4)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6, G7 | |
| β-לקטאמים | אמוקסיצילין | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| שטפיזידיים | סי. טי. אקס-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 | |
| אוקסעבלין | אוקא -10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | , B8 | |
| אוקא-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5, A8 | ||
| מרירופem | IMP-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6, A7 | ||
| ארורים | קווים-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 | |
| לינקוזדס | לינקוזדס | ארמק | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| lnu (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Macrolides | Macrolides | ארמק | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| ממפיס | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 | ||
| ממפיס | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2, F11 | ||
| סוג B סטרפטוגרנס | סוג B סטרפטוגרנס | ארמק | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| הקלד סטרפטוגרנס | הקלד סטרפטוגרנס | ווטד | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| סטרפטותריצין | סטרפטותריצין | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| טטרציקלינים | טטרציקלין | ט (ז) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5, D8 |
| כלורמפנניקול | כלורמפנניקול | חתול | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| הספקוקינים | הספקוקינים | פוסה | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| ריפיאלינים | ריפיאלינים | עיבוד | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
טבלה 4: ובכן שולחן הייעוד עבור זנים ARP. שולחן זה מציין באיזו מידה יש למצוא צלחת של 96-באר שכל אחד מזני ה-ARP נמצא בהתאם למפת הלוחית של ספריית ARP. הטבלה גם מפרטת איזו מחלקה אנטיביוטית כל גן מגייס התנגדות. אנא שימו לב כי גנים מסוימים עשויים להעניק עמידות ליותר מאנטיביוטיקה אחת בתוך שיעור אנטיביוטי נתון.
משלים איור 1: מפת לוחית הספריה המשמשת עבור תבנית הפלטפורמה המקורית לעמידות לאנטיביוטיקה (ARP). ארגן את הזנים המתאימים E. coli בצלחת 96-באר באמצעות תבנית זו כדי להבטיח כי כל הפקדים הדרושים וכפילויות נכללים. דמות זו שונתה מ-קוקס ואח '10. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.
איור משלים 2: לוחית הספרייה מפה לשימוש עבור הפלטפורמה המינימלית עמידות לאנטיביוטיקה (MARP) תבנית. ארגן את הזנים המתאימים E. coli בצלחת 96-באר באמצעות תבנית זו כדי להבטיח כי כל הפקדים הדרושים וכפילויות נכללים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להיות מיושם הן גילוי של תרכובות מיקרוביאלית הרומן ושדון שניתן להשתמש בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימים כדי להציל את פעילותם. פלטפורמת מנצל את הפלטפורמות הגבוהות של המצע של מנגנוני התנגדות ואנטיביוטיקה קנצוני שלהם, לתרכובות dereplicate בתוך תמציות טבעי גולמי מוצר. למרות הזמן הנדרש עבור צלחות dereplication להיות מוכנים הוא ארוך (~ 2 שבועות), תהליך dereplication עצמו הוא השלם לאחר תקופת דגירה אחת לילה, אשר מהירה בהשוואה לזמן זה יכול לקחת כדי לבודד ולאפיין תרכובת מתמציות גולמי. בנוסף, אין צורך בציוד יקר או מיוחד במיוחד, ההופך פלטפורמה זו לנגישה וחסכונית.
יתרון גדול נוסף של פלטפורמה זו הוא הגמישות שלה. את ה-ARP ניתן להרחיב כדי להכיל גנים התנגדות הכוללים שיעורים אנטיביוטיים יותר. זה מושגת על ידי ניטור ספרות להופעת אנזימים ההתנגדות הרומן ושימוש בטכניקות שיבוט בסיסי המולקולרי להוסיף את הגנים לספרייה E. coli . יתר על כן, התבנית dereplication ניתנת להתאמה אישית מבוסס על הרמה הרצויה של המצע רחב או צר טווח ספציפיות כי אדם רוצה להשתמש כאשר dereplicating. כל שילוב של גנים בספרייה E. coli ניתן להשתמש כדי ליצור לוחיות ספרייה הרומן עם היכולת לזהות תרכובות עם פרופילים שונים. לדוגמה, ניתן לפתח תבנית המבטאת β- E. coli כדי לאפשר את הdereplication הספציפיות ביותר של β-lactamase ומחלקות המחלקות השונות שלהן.
בעוד פלטפורמה זו תוכננה בתחילה כדי dereplicate תרכובות על מדיה מוצק, זה גם עובד במדיה נוזלית. זה שימושי כאשר עובדים עם תרכובות כי כבר מטוהרים שבו רק כמות מוגבלת זמין לבדיקה, או כאשר עובדים עם תרכובות שאינן מפוזר בקלות או בעקביות במדיה מוצק. לבסוף, בעוד פרוטוקול זה תוארה באמצעות ה -E. coli זנים BW25113 ו BW25113 ΔBambΔtolc, הפלטפורמה ניתן להשתמש עם הספרייה הגן ההתנגדות מתבטאת זנים שונים של E. coli (dereplication פנוטיפים עשוייםלהשתנות). בסופו של דבר, פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה היא גמישה, יש יישומים רבים, והוא יתרון על שיטות dereplication אחרות.
כדי להבטיח כי תוצאות שאינן מזוהמות ומזוהמים מתקבלים, זה קריטי כדי לעקוב אחר טכניקות עיקור וסירוס מתאים. כישלון לעשות זאת יגרום לזיהום של כלי ההצמדה, לוחית הספרייה, או לוחית dereplication עצמה. בעוד סמנים לבחירה נמצאים בספרייה E. coli , אשר יכול לעזור למנוע זיהום שנגרם על ידי חיידקים חסר את הסמן, זה לא מונע את הזיהום הצולב של זנים באמצעות אותו סמן. כדי להפחית את הסיכון של זה קורה זה חיוני כדי לעקר בזהירות את כלי ההצמדה חיידקים לפני הצמדת מלוח הספרייה. כל לוח ספריה צריך להיות מוצמד רק מ 3-4 פעמים לכל היותר לפני השלכת תבנית חדשה. זה מונע התפשטות של זיהום על פני כל הצלחות dereplication אם צלחת הספרייה הופך מזוהם במהלך תהליך ההצמדה. בנוסף, לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה כאשר מונעים את הצלחת הdereplication והטיפול הגדול צריך להילקח כדי למנוע זיהום לפני שהוא נותר להחמיץ במשך שישה ימים. מקור אפשרי נוסף של זיהום הוא בשכבת הכיסוי של MHB אגר של צלחת dereplication. אם מדיית הכיסוי מזוהמת, הצמיחה תופיע רק לאחר הדגירה של הלילה ב-37 ° c לאחר ההצמדה. זיהום שכבת-על יכול להקשות מאוד לנתח את התפתחותם של הספרייה E. coli על משטח הכיסוי. כדי להפחית את הסיכויים של זיהום שכבת-על, להכין את MHB אגר טרי לפני לשפוך את הכיסוי. מומלץ כי עד שאדם הוא נוח עם שיטה זו, לוחיות dereplication צריך תמיד להיות מוכן בשכפול או בטרילקאט כך שבמקרה של זיהום של צלחת אחת, ניתן עדיין לחלץ נתונים מן התקווה צלחות לא מזוהמות.
לבסוף, חשוב לציין כי ל-ARP/MARP יש מגבלות. פרוטוקול זה אינו מתאים לשכפול של זנים המייצרים יותר מתרכובת אקטיביים אחת. כל זן בספריית E. coli תוכנן לבטא גן התנגדות אחד. אם שני אנטיביוטיקה מיוצרים על ידי אורגניזם, גן התנגדות לא מעניקה עמידות לאנטיביוטיקה השני, ובכך וכתוצאה מכך מוות התאים של שני זנים. כך, אפשרות זו חייבת להיחשב כאשר dereplication תוצאות מרמזות על נוכחות של אנטיביוטיקה הרומן, כי הייצור של אנטיביוטיקה מרובים לא ניתן לזהות על ידי הנוכחי היחיד E. coli ספרייה. גישה אחת שניתן לנקוט כדי להילחם את האתגר של זנים dereplicating המייצרים יותר מאשר אנטיביוטיקה אחת כרוכה באמצעות הליך אגר-plug המתואר בנייר ARP המקורי על ידי קוקס ואח '10. בשיטה זו, חלק של בינוני מוצק מותסס מוסר מתוך מפיק אנטיביוטי המכיל צלחת והניח על מדשאה של זן מחוון של ARP. זן המחוון יכול להיות כל אחד מזני E. coli עמידים בספריית ה-ARP. באזורים של עיכוב משמשים אז כדי להשוות את ביו פעילות של הפקת-זן נגד הזנים ARP ומתח סוג פראי. זני ARP כי טופס אזור מעכבות של גודל ירידה לעומת זן סוג פראי יכול להתנגד לתרכובת להיות מיוצר. שיטה זו הוכיחה להיות יעיל בזיהוי זנים המסוגלים לייצר אנטיביוטיקה מרובים10.
לסיכום, לקבלת התוצאות הטובות ביותר כאשר dereplicating עם ARP/MARP מומלץ לוחיות dereplication מוכנות בשכפול או בטרילקאט. שלבים קריטיים אחרים בפרוטוקול כוללים הצמדה של לוח ספרייה טרייה (לעולם לא קפואים) והסרת כמו ביומסה הרבה ככל האפשר מן הפקת-זן במהלך הסרת הקרום בשלב. אם מעקב אחר כל הצעדים הנחוצים, האדם צריך לקבל תוצאות dereplication מוצלחות להפקת-זן של עניין בתוך מסגרת זמן של שבועיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר במעבדת רייט בנוגע ל-ARP/MARP נתמך על ידי קרן מחקר אונטריו ומכונים קנדיים של מלגת מחקר בריאות (FRN-148463). אנו רוצים להכיר בסומר צ'ו על הסיוע בהרחבת ובארגון של ספריית ה-ARP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
