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Immunology and Infection

एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच का उपयोग एंटीबायोटिक Dereplication

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60536
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, M.G. DeGroote Institute for Infectious Disease Research, McMaster University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

Summary

हम एक मंच है कि एंटीबायोटिक दवाओं के dereplication के लिए isogenic एंटीबायोटिक प्रतिरोधी Escherichia कोलाई के एक पुस्तकालय का इस्तेमाल का वर्णन. बैक्टीरिया या कवक द्वारा उत्पादित एंटीबायोटिक की पहचान ई. कोलाई के विकास से कम हो सकती है जो अपने संबंधित प्रतिरोध जीन को व्यक्त करती है। यह मंच आर्थिक रूप से प्रभावी और समय-कुशल है।

Abstract

प्राकृतिक उत्पाद के अर्क से नए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए खोज में मुख्य चुनौतियों में से एक आम यौगिकों की फिर से खोज है. इस चुनौती से निपटने के लिए, dereplication, जो ज्ञात यौगिकों की पहचान करने की प्रक्रिया है, ब्याज के नमूने पर किया जाता है. इस तरह के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद विश्लेषणात्मक जुदाई के रूप में dereplication के लिए तरीके समय लेने वाली और संसाधन गहन हैं। dereplication प्रक्रिया में सुधार करने के लिए, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (एआरपी) विकसित किया है. एआरपी लगभग 100 एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन है कि व्यक्तिगत रूप से Escherichia कोलाई में क्लोन किया गया है की एक पुस्तकालय है. इस तनाव संग्रह एंटीबायोटिक dereplication के लिए एक लागत प्रभावी और सुगम विधि सहित कई आवेदन किया है. इस प्रक्रिया में ठोस माध्यम से युक्त आयताकार पेट्री व्यंजनों की सतह पर एंटीबायोटिक उत्पादक रोगाणुओं का किण्वन शामिल है, जिससे माध्यम के माध्यम से माध्यमिक चयापचयों के स्राव और प्रसार के लिए अनुमति दी जाती है। एक 6 दिन किण्वन अवधि के बाद, माइक्रोबियल बायोमास हटा दिया जाता है, और एक पतली agar-ओवरले एक चिकनी सतह बनाने के लिए और ई. कोलाई सूचक उपभेदों के विकास को सक्षम करने के लिए पेट्री डिश में जोड़ा जाता है। एआरपी उपभेदों के हमारे संग्रह तो एंटीबायोटिक युक्त पेट्री पकवान की सतह पर टिकी है. प्लेट अगले रात incubated है ओवरले की सतह पर ई कोलाई विकास के लिए अनुमति देने के लिए. केवल एक विशिष्ट एंटीबायोटिक (या वर्ग) के लिए प्रतिरोध युक्त उपभेदों इस सतह पर विकसित उत्पादन यौगिक की तेजी से पहचान को सक्षम करने. इस विधि को सफलतापूर्वक ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के उत्पादकों की पहचान के लिए और एक साधन के रूप में उपन्यास यौगिकों का उत्पादन उन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है.

Introduction

सन् 1928 में पेनिसिलिन की खोज के बाद से पर्यावरणीय सूक्ष्मजीवों से प्राप्त प्राकृतिक उत्पाद एंटीमाइक्रोबियल यौगिकोंकासमृद्ध स्रोत सिद्ध हुए हैं। लगभग 80% प्राकृतिक उत्पाद एंटीबायोटिक ्सीट्स स्ट्रेप्टोमाइसेस और अन्य एक्टिनोमाइसेट्स के बैक्टीरिया से प्राप्त होते हैं, जबकि शेष 20% कवक प्रजातियों1द्वारा उत्पादित होता है। क्लिनिक में इस्तेमाल किए जाने वाले सबसे आम एंटीबायोटिक पाड़ों में से कुछ जैसे कि जेड-लैक्टम्स, टेट्रासाइक्लिन, रिफामाइसिन, और एमिनोग्लीकोसाइड, मूल रूप से रोगाणुओं से अलग किए गए थे2। तथापि, बहुऔषध प्रतिरोधी (एमडीआर) बैक्टीरिया की वृद्धि के कारण, एंटीबायोटिक दवाओं का हमारा वर्तमान पैनल उपचार3,4में कम प्रभावी हो गया है। इनमें "ESKAPE" रोगजनक (यानी, वैन्कोमीसिन-प्रतिरोधी आंत्रकि और जेड-लैक्टम-प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस, क्लेब्सिएला न्यूमोनिया, स्यूडोमोनास एरुजिनोसा, ऐसिन्टोबैक्टर बाउमैनी, और Enterobacter sp.), जो बैक्टीरिया का एक सबसेट है जो विश्व स्वास्थ्य संगठन3,4,5जैसे कई प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों द्वारा सबसे अधिक जोखिम के साथ जुड़ा हुआ माना जाता है. इन एमडीआर रोगजनकों के उद्भव और वैश्विक प्रसार के परिणामस्वरूप उपन्यासएंटीबायोटिक3,4,5की निरंतर आवश्यकता होती है . अफसोस की बात है, पिछले दो दशकों से पता चला है कि माइक्रोबियल स्रोतों से उपन्यास एंटीबायोटिक दवाओं की खोज तेजी से मुश्किल6है . दवा की खोज के लिए वर्तमान दृष्टिकोण bioactive यौगिकों के उच्च throughput स्क्रीनिंग शामिल हैं, प्राकृतिक उत्पाद निकालने पुस्तकालयों सहित, अर्क के हजारों के लिए एक दिए गए समय में परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति2. तथापि, एक बार एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि का पता लगने के बाद, अगला चरण सक्रिय घटक की पहचान करने के लिए कच्चे तेल के अर्क की सामग्री का विश्लेषण करना और ज्ञात या अनावश्यक यौगिकों वाले यौगिकों को समाप्त करनाहै। इस प्रक्रिया, dereplication के रूप में जाना जाता है, को रोकने के लिए महत्वपूर्णहै और / हालांकि प्राकृतिक उत्पाद दवा की खोज में एक आवश्यक कदम, dereplication कुख्यात परिश्रमी और संसाधन गहन10है.

जब से Beutler एट अल पहली बार शब्द "dereplication" गढ़ा, व्यापक प्रयास ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं की तेजी से पहचान के लिए अभिनव रणनीति विकसित करने के लिए किए गए हैं11,12. आज dereplication के लिए इस्तेमाल किया सबसे आम उपकरण इस तरह के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, और परमाणु चुंबकीय अनुनाद आधारित पता लगाने के तरीकों11,13के रूप में विश्लेषणात्मक क्रोमैटोग्राफी प्रणाली शामिल हैं। दुर्भाग्य से, इन तरीकों में से प्रत्येक महंगी विश्लेषणात्मक उपकरण और परिष्कृत डेटा व्याख्या के उपयोग की आवश्यकता है.

एक dereplication विधि है कि तेजी से विशेष उपकरणों के बिना किया जा सकता है विकसित करने के प्रयास में, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (एआरपी)10की स्थापना की. एआरपी एंटीबायोटिक सहायकों की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ज्ञात प्रतिरोध तंत्र के खिलाफ नए एंटीबायोटिक यौगिकों की रूपरेखा, और actinobacteria और अन्य रोगाणुओं से व्युत्पन्न अर्क में ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के dereplication. यहाँ, हम एंटीबायोटिक dereplication में अपने आवेदन पर ध्यान केंद्रित. एआरपी आइसोजेनिक एस्चेरीचिया कोली के एक पुस्तकालय का उपयोग करता है जो व्यक्तिगत प्रतिरोध जीनों को व्यक्त करता है जो सबसे अधिक पुनः खोजे गए एंटीबायोटिक दवाओं14,15 केखिलाफ प्रभावी होते हैं . जब ई. कोलाई पुस्तकालय एक द्वितीयक मेटाबोलाइट उत्पादक जीव की उपस्थिति में उगाया जाता है, यौगिक की पहचान ई. कोलाई उपभेदों है कि अपने संबद्ध प्रतिरोध जीन10व्यक्त के विकास से deduced किया जा सकता है. जब एआरपी पहली बार रिपोर्ट किया गया था, पुस्तकालय में शामिल थे और 40 जीन 16 एंटीबायोटिक वर्गों के लिए प्रतिरोध प्रदान. मूल dereplication टेम्पलेट dereplication प्रक्रिया के दौरान एंटीबायोटिक उपवर्ग के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए एंटीबायोटिक वर्ग प्रति प्रतिरोध जीन का एक सबसेट शामिल करने के लिए डिजाइन किया गया था. आज, एआरपी के शामिल है और 90 जीन है कि 18 एंटीबायोटिक वर्गों के लिए प्रतिरोध प्रदान. प्रतिरोध जीन के हमारे व्यापक संग्रह का उपयोग करना, एक माध्यमिक dereplication टेम्पलेट विकसित किया गया है और कम से कम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (MARP) के रूप में जाना जाता है. इस टेम्पलेट जीन अतिरेक को खत्म करने के लिए और बस सामान्य एंटीबायोटिक वर्ग है कि एक dereplicated चयापचय से संबंधित है के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए बनाया गया था. इसके अतिरिक्त, एमआरपी टेम्पलेट के पास एआरपी के मूल अवतार की तुलना में वाइल्डटाइप और हाइपरपरमेबल/efflux की कमी तनाव ई. कोलाई BW25113(ई. कोलाई BW25113 ]bamB[tolC)दोनों के पास है, जो केवल अति पारगम्य तनाव का इस्तेमाल करता है. इस अनूठी पहलू dereplication के दौरान अतिरिक्त phenotypes बनाता है, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली को पार करने के लिए एक यौगिकों की क्षमता का संकेत. यहाँ, हम एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए जब या तो एआरपी और /

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Protocol

1. ई. कोलाई लाइब्रेरी ग्लिसरोल स्टॉक्स की तैयारी (आगर Slants से)

  1. lysogeny शोरबा (एलबी) agar से एआरपी / एमआरपी ई. कोलाई उपभेदों LB agar और उपयुक्त चयन मार्कर युक्त पेट्री व्यंजन पर slants (तालिका 1).
  2. एक एकल कॉलोनी के साथ उपयुक्त चयन मार्कर युक्त एलबी के 3 एमएल inoculating द्वारा ई. कोलाई उपभेदों में से प्रत्येक के लिए संस्कृतियों को तैयार करें। वातन (250 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ें।
  3. एक 1.8 एमएल क्रायोविएल में 800 डिग्री सेल्सियस संस्कृति और बाँझ 80% ग्लिसरोल के 200 डिग्री एल का मिश्रण। ट्यूब 3 डिग्री 4 बार उलटा करके मिक्स, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

2. ARP/MARP जमे हुए स्टॉक लाइब्रेरी प्लेट तैयारी

  1. LB agar और उपयुक्त चयन मार्कर युक्त पेट्री व्यंजनों का एक नया सेट पर अनुभाग 1 में तैयार ग्लिसरॉल स्टॉक से एआरपी / 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ो।
  2. aseptic तकनीक का उपयोग करना, pipette 500 $L cation समायोजित Mueller Hinton शोरबा (MHB) एक बाँझ जलाशय से एक बाँझ 96 गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में.
  3. चरण 2-1 में तैयार की गई प्लेटों के साथ, एआरपी/एमआरपी मानचित्र के अनुसार 96 गहरी अच्छी प्लेट को टीका लगाने के लिए एक applicator स्टिक का उपयोग करें(पूरक चित्र 1 और पूरक चित्र 2)। सुनिश्चित करें कि उपयुक्त चयन मार्कर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है. गहरी अच्छी तरह से थाली की सतह पर एक सांस सील झिल्ली प्लेस और 37 डिग्री सेल्सियस (250 आरपीएम) पर रात भर इनक्यूबेट।
  4. सुनिश्चित करें कि एआरपी/एमआरपी मानचित्र का उल्लेख करके कोई दूषित कुएं नहीं हैं। यदि दूषित हो तो दोहराएँ. एक मल्टी चैनल pipettor का उपयोग करना, एक बाँझ 96 अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट के लिए गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 100 जेडएल हस्तांतरण. एकाधिक जमे हुए स्टॉक लायब्रेरी प्लेट बनाने के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    नोट: जमे हुए स्टॉक लाइब्रेरी प्लेट संदूषण की स्थिति में 2.1 डिग्री 2.4 को दोहराने से रखने के लिए एक समय में कम से कम 5 पुस्तकालय प्लेटें तैयार करना सबसे अच्छा है।
  5. प्रत्येक कुएं में बाँझ 50% ग्लिसरॉल के 100 डिग्री सेल्सियस पाइप द्वारा एआरपी/एमआरपी जमे हुए स्टॉक लाइब्रेरी प्लेट्स को बंद करें और धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिश्रण करें।
  6. बाँझ एल्यूमीनियम जवानों के साथ प्लेटों को कवर और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से बंद है.
  7. प्लेटों को नंबर और एक दिए गए समय पर नए टेम्पलेट्स टीका के लिए केवल एक जमे हुए स्टॉक पुस्तकालय प्लेट समर्पित. जमे हुए स्टॉक लाइब्रेरी प्लेट संदूषण की स्थिति में शेष को बैक-अप के रूप में रखें।
  8. प्लेट ढक्कन एल्यूमीनियम सील के शीर्ष पर रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

3. बीज संस्कृति और Dereplication प्लेट तैयारी

  1. एक applicator छड़ी का उपयोग करना, Streptomyces एंटीबायोटिक माध्यम (SAM) के 3 एमएल टीका (या जीव के लिए अन्य उपयुक्त माध्यम का परीक्षण किया जा रहा है) एक बाँझ ग्लास मनका युक्त एक परीक्षण ट्यूब में (को तोड़ने के लिए mycelium) उत्पादन तनाव है कि होना है के साथ प्रतिरूपित. स्ट्रेप्टोमाइसेस के लिए, एक कॉलोनी की सतह से बीजाणुओं को धीरे से स्क्रैप करें।
  2. एक ही लकड़ी applicator छड़ी का उपयोग करना, एक पेट्री डिश पर एक बाँझपन नियंत्रण लकीर है बेनेट के agar युक्त.
  3. बीज संस्कृति को 30 डिग्री सेल्सियस पर 6 दिनों (250 आरपीएम) के लिए वातन के साथ इनक्यूबेट करें और 6 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बाँझपन नियंत्रण प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: SAM और बेनेट के मीडिया व्यंजनों के लिए तालिका 2 को देखें. उपरोक्त निर्देश सबसे actinomycetes के लिए उपयुक्त हैं. अन्य बैक्टीरिया और कवक के लिए आवश्यक के रूप में विकास मीडिया को बदल दें।
  4. एक आयताकार पेट्री डिश (सामग्री कीतालिका)की सतह पर समान रूप से 20 एमएल गर्म बेनेट के agar के 23 एमएल aspirating द्वारा dereplication प्लेटें तैयार करें , पाइपेट में मध्यम के शेष छोड़ने को रोकने के लिए हवा बुलबुला गठन.
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेटों डालकरने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा सतह स्तर है और इस कदम से पहले agar बहुत ठंडा हो गया है प्रदर्शन; एक फ्लैट सतह अगले चरणों में पुस्तकालय pinning के लिए आवश्यक है.
  5. प्लेट को तब तक घुमाएं जब तक कि माध्यम प्लेट के सभी क्षेत्रों को कवर न कर े हो जाए और जब तक कि आगर पूरी तरह से सेट न हो जाए तब तक इसे परेशान न करें।
  6. एक अनुरेखण टेम्पलेट के रूप में एक आयताकार पेट्री डिश ढक्कन का उपयोग करके नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली शीट (सामग्री की तालिका) तैयार करें ताकि शीट dereplication प्लेट की सतह फिट हो। चादरों को काटें और उन्हें एक बाँझ थैली में ऑटोक्लेव करें।
    नोट: यह झिल्ली जीवों को इसकी सतह पर sporulate करने के लिए अनुमति देता है, जबकि माध्यमिक चयापचयों नीचे मध्यम में उत्सर्जित किया जा सकता है. एक बार बड़ा हो जाने के बाद, झिल्ली dereplication के लिए एक साफ सतह प्रदान करने के लिए हटा दिया जाता है। करीब फिट है कि झिल्ली कागज बेनेट के agar की सतह पर है, क्लीनर dereplication परिणाम.
  7. बंध्यता नियंत्रण प्लेट की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि 6 दिनों के ऊष्मायन के बाद कोई संदूषक मौजूद न हो। यदि संदूषण मुक्त, आयताकार पेट्री डिश और पिपेट 200 डिग्री बीज संस्कृति के ढक्कन को बेनेट के आगर की सतह पर हटा दें।
  8. यहां तक कि एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर पूरी थाली की सतह भर में संस्कृति का प्रसार.
  9. पेट्री डिश की सतह पर संस्कृति के शीर्ष पर चरण 3.6 में तैयार नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली रखें। पेट्री डिश के नीचे किनारे करने के लिए झिल्ली के नीचे किनारे संरेखित करके शुरू, और धीरे धीरे प्लेट के ऊपरी किनारे करने के लिए नीचे किनारे से झिल्ली लागू होते हैं।
  10. झिल्ली-आगर इंटरफ़ेस के बीच बनने वाले किसी भी वायु बुलबुले को चिकना करने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करना कि झिल्ली आगर में फ्लश है।
  11. ढक्कन को आयताकार पेट्री डिश पर वापस रखें और इसे एक सील प्लास्टिक बैग में उल्टा रखें। 6 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

4. Dereplication प्लेट MHB ओवरले और एआरपी /

  1. 6 दिनों के बाद, 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से डेरिप्लिकेशन प्लेट को हटा दें। बाँझ चम्मियों का उपयोग करना (स्वत: 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से छिड़काव या छिड़काव), ध्यान से बेनेट के आगर की सतह से नाइट्रोसेलूलोस झिल्ली को हटा दें।
    नोट: यह कदम झिल्ली की सतह पर हो हाइड्रोफोबिक बीजाणुओं और माइकेलिया को हटा देगा ताकि विरिप्लिकेशन के लिए एक साफ सतह प्रदान की जा सके, चरण 4.2 की सुविधा हो।
  2. चरण 3.4 के लिए वर्णित के रूप में, सुनिश्चित करें कि काम की सतह स्तर है और गर्म cation समायोजित MHB agar के 23 एमएल aspirate करने के लिए एक serological pipette का उपयोग करें. dereplication प्लेट की सतह भर में समान रूप से 20 एमएल वितरण द्वारा एक ओवरले बनाएँ, पाइपेट में माध्यम के शेष छोड़ने के लिए हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए.
  3. धीरे से प्लेट बारी बारी से जब तक मध्यम सभी क्षेत्रों को शामिल किया गया है और यह परेशान नहीं जब तक agar पूरी तरह से निर्धारित किया है. ठंडा और जम जाने के बाद, डिरिप्लिकेशन प्लेट को सील किए गए प्लास्टिक बैग में वापस कर दें और इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा रखें।
    नोट: यह कदम एमएच बी गार ओवरले में किण्वित बेनेट के माध्यम से माध्यमिक चयापचयों के प्रसार के लिए अनुमति देता है। यदि नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली ठीक से तैयार नहीं की गई थी तो प्लेट के किनारों के चारों ओर बीजाणु वृद्धि होगी, जिसमें हाइड्रोफोबिक गुण होते हैं जो एमएच बी आगर को पीछे हटा देते हैं। इन बीजाणुओं के शीर्ष पर ओवरले न डालें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप ओवरले का संदूषण हो सकता है।
  4. जिस दिन ओवरले डाला जाता है, उसी दिन 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस की मात्रा में पाइप करके एक ताजा एआरपी/
    नोट: dereplication के दौरान संदूषण फैलाने की संभावना को कम करने के लिए, केवल प्रतिरेप्लिकेशन 2$3 dereplication प्लेट्स के लिए किसी एकल ARP/MARP लायब्रेरी प्लेट का उपयोग करें। इसलिए, पर्याप्त 96-वेल एआरपी/एमआरपी प्लेट्स को प्रतिरेपियकिए जाने वाले उपभेदों की संख्या के आधार पर टीका लगाएं।
  5. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए स्टॉक एआरपी/एमआरपी लाइब्रेरी प्लेट को बाहर निकालें। संघनन के नीचे पर फार्म शुरू होने से पहले एल्यूमीनियम सील निकालें, जिससे पुस्तकालय की थाली में पड़ोसी कुओं को दूषित करने की संभावना कम हो जाती है।
  6. बाँझ 96-अच्छी तरह से pinning उपकरण (या टीका उपकरण के अन्य रूपों) का उपयोग करना, ध्यान से जमे हुए स्टॉक ARP/MARP पुस्तकालय प्लेट से पिन और ताजा MHB युक्त 96 अच्छी तरह से प्लेटें टीका. dereplication के दौरान संदूषण को कम करने के लिए, के रूप में कई एआरपी या MARP पुस्तकालय प्लेटें केवल प्रति पुस्तकालय प्लेट प्रति dereplicate 2 "3 dereplication प्लेटें करने के लिए आवश्यक तैयार करें। प्रत्येक प्लेट टीका के बीच पिनिंग उपकरण स्टरलाइज़ करें।
  7. जमे हुए टेम्पलेट पर एक नया बाँझ एल्यूमीनियम सील रखो एक बार पूरा हो और यह -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए वापस. एक सील प्लास्टिक बैग के अंदर inoculated 96 अच्छी प्लेटें प्लेस और हवा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (250 आरपीएम) 18 एच के लिए.
    नोट: नई जमे हुए स्टॉक पुस्तकालय प्लेटें कोई संदूषण मौजूद है कि यह सुनिश्चित करने के बाद इस कदम से तैयार किया जा सकता है. चरण 2.5 में वर्णित -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले प्लेट में ग्लिसरॉल जोड़ें।

5. ARP/MARP का उपयोग करके नकल करना

  1. इनक्यूबेटर से ARP/MARP टेम्पलेट निकालें और यह सुनिश्चित करें कि कोई संदूषक मौजूद नहीं हैं। हमेशा एक टेम्पलेट है कि ताजा तैयार है और जमे हुए स्टॉक से सीधे नहीं का उपयोग कर dereplicate.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस से dereplication प्लेटें निकालें और कमरे के तापमान के लिए समतुल्य करने के लिए अनुमति देते हैं। यदि संघनन है, तो ढक्कन खोलें और बाँझ वातावरण में सूखने दें।
  3. बाँझ pinning उपकरण (या अन्य टीका उपकरण) का उपयोग करना, dereplication प्लेटों के MHB agar ओवरले की सतह पर ARP/MARP पुस्तकालय प्लेट से पिन. आगर छेद करने के लिए नहीं सावधान रहें। प्रत्येक dereplication प्लेट टीका के बीच में पिनिंग उपकरण स्टरलाइज़ करें।
  4. डेरिप्लिकेशन प्लेट्स की सतह पर टेम्पलेट को पिन करने के बाद, टेम्पलेट इनोकुलम को 3 $5 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें। टीका लगाए गए डेरिप्लिकेशन प्लेटको एक सीलबंद प्लास्टिक बैग में उल्टा रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. Dereplication परिणाम ों का विश्लेषण अगले दिन Dereplication प्लेट पर वृद्धि की तुलना कुओं कि ARP/MARP मानचित्र के अनुरूप करने के लिए (तालिका 3 और तालिका 4)।

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Representative Results

निम्नलिखित परिणाम प्राप्त हुए जब ब्याज की एंटीबायोटिक उत्पादक उपभेदों का एक संग्रह एआरपी और /

ARP/MARP dereplication कार्यप्रवाह का आरेख चित्र 1में दर्शाया गया है और पुस्तकालय प्लेट मानचित्रों को पूरक चित्र 1 और पूरक चित्र 2 में दर्शाया गया है। चित्रा 2 एक सकारात्मक dereplication परिणाम जिसमें पर्यावरण निकालने WAC 8921 एक chloramphenicol निर्माता के रूप में पहचान की है दर्शाता है. चित्रा 3 एआरपी विकास की कमी पूरी तरह से पता चलता है, जो या तो एक अज्ञात एंटीबायोटिक या एक कम आमतौर पर पाया एंटीबायोटिक है कि एआरपी / चित्रा 4 एक वृद्धि पैटर्न है कि दोनों wildtype ई. कोलाई BW25113 और एक hyperpermeable और efflux कमी उत्परिवर्ती ई. कोलाई BW25113bamBtolC के उपयोग के कारण MARP के लिए अद्वितीय है दर्शाता है. यह परिणाम एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि के साथ एक यौगिक की उपस्थिति का सुझाव देता है जो एक बरकरार बाहरी झिल्ली को पार करने में असमर्थ है। चित्र 5 एक ई कोलाई विकास पैटर्न से पता चलता है कि pinning उपकरण के अनुचित नसबंदी पता चलता है और चित्रा 6 एआरपी / चित्र 7 दर्शाता है कि क्या होता है अगर agar ओवरले dereplication के दौरान छेदा है. अंत में, चित्र 8 एमएचबी ओवरले संबंधित संदूषण दिखाता है जो dereplication प्रक्रिया के दौरान हो सकता है।

Figure 1
चित्र 1: dereplication प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध. उत्पादन तनाव dereplicated किया जा करने के लिए एक लॉन के रूप में एक आयताकार पेट्री डिश पर लकीर है और एक नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली शीर्ष पर रखा गया है। प्लेट तो 6 दिनों के लिए incubated है जिसमें उत्पादन तनाव से संबंधित बायोमास झिल्ली की सतह पर बढ़ता है, जबकि और माध्यमिक चयापचयों का उत्पादन पेट्री डिश मीडिया में स्रावित कर रहे हैं. 6 दिन की किण्वन अवधि के बाद, झिल्ली को हटा दिया जाता है और एक एमएचबी ओवरले को पिनिंग के लिए एक चिकनी सतह प्रदान करने के लिए एंटीबायोटिक युक्त मीडिया की सतह में जोड़ा जाता है। ARP/MARP ई. कोलाई लायब्रेरी, जो ARP/MARP मानचित्र के अनुसार 96-वेल प्लेट स्वरूप में व्यवस्थित है, फिर ओवरले की सतह पर पिन किया जाता है. ट्रे को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करने के बाद, विशिष्ट प्रतिरोध जीनों को व्यक्त करने वाले ई. कोलाई उपभेदों का विकास उत्पादित यौगिक की पहचान को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक ज्ञात एंटीबायोटिक का वर्णन। उत्पादन तनाव WAC 8921 एआरपी टेम्पलेट का उपयोग कर प्रतिप्रतिकृति था. ई. कोलाई BW25113 की वृद्धि -bamB]tolC pGDP1:एमएचबी ऐगार ओवरले की सतह पर कैट इंगित करता है कि WAC 8921 एक chloramphenicol निर्माता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक अज्ञात एंटीबायोटिक का वर्णन। उत्पादन तनाव WAC 9941 एआरपी टेम्पलेट का उपयोग कर प्रतिप्रतिकृति था. ई. कोलाई पुस्तकालय विकास की कमी आयताकार पेट्री डिश की सतह पर देखा गया था, यह दर्शाता है कि या तो WAC 9441 एक अज्ञात एंटीमाइक्रोबियल यौगिक या एक दुर्लभ एंटीबायोटिक है कि एआरपी में के लिए जिम्मेदार नहीं है उत्पादन कर रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक एंटीमाइक्रोबियल यौगिक की पहचान जो एक बरकरार बाहरी झिल्ली को पार नहीं कर सकती। उत्पादन तनाव WAC 4178 MARP टेम्पलेट का उपयोग कर प्रतिप्रतिकृति था. ई. कोलाई BW25113 के उपभेदों माध्यमिक मेटाबोलाइट युक्त मीडिया की सतह पर बढ़ने में सक्षम हैं, जबकि ई. कोलाई BW25113 के सभी उपभेदों विकसितनहीं कर सकतेहैं. यह पता चलता है कि WAC 4178 एक एंटीमाइक्रोबियल यौगिक है कि एक बरकरार बाहरी झिल्ली पार नहीं कर सकता उत्पादन कर रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: गैर बाँझ पिनिंग उपकरण के कारण संदूषण। उत्पादन तनाव WAC 7094 एआरपी टेम्पलेट का उपयोग कर प्रतिप्रतिकृति था. ई. कोलाई पुस्तकालय विकास के क्षेत्रों में है कि एक सौंपा ई कोलाई तनाव नहीं था की उपस्थिति से पता चलता है कि आयताकार पेट्री डिश के MHB agar ओवरले टीका करने के लिए इस्तेमाल किया pinning उपकरण ठीक से बाँझ नहीं थे. यह ओवरले भर में अज्ञात ई. कोलाई उपभेदों के हस्तांतरण में परिणाम है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: दूषित जमे हुए स्टॉक एआरपी/एमआरपी टेम्पलेट के कारण संदूषण। उत्पादन तनाव WAC 3683 एआरपी टेम्पलेट का उपयोग कर प्रतिप्रतिकृति था. तीन अलग ई. कोलाई कालोनियों आयताकार पेट्री डिश सतह पर वृद्धि हुई: दो ई. कोलाई BW25113 के साथ मेल खाते हैं -bamB]TolC STAT व्यक्त, एक स्ट्रेप्टोथ्रिसिन प्रतिरोध एंजाइम, और अन्य ई कोलाई से मेल खाती है BW25113 ]bamB]tolC VIM-2ss,एक $-lactam प्रतिरोध एंजाइम व्यक्त. ब्ला VIM2s s कॉलोनी विकास नकल की कमी के कारण, पार प्रतिरोध की कमी के अलावा इन दो एंटीबायोटिक वर्गों के बीच होने के लिए जाना जाता है, यह माना जा सकता है कि ई. कोलाई बाम के अलावा अन्य तनाव[B] tolC pGDP1: blaVIM2s s संबंधित जमे हुए पुस्तकालय प्लेट में अच्छी तरह से बढ़ रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: छेदा MHB agar ओवरले. उत्पादन तनाव WAC 5106 एआरपी टेम्पलेट का उपयोग कर प्रतिप्रतिकृति था. इस विकृति को स्ट्रेप्टोमाइसिन उत्पादक पाया गया, जैसा कि ई. कोलाई BW25113 के विकास द्वारा दर्शाया गया है,बम्बे]टॉलसी pGDP3:aph(6)-Ia. पंचर छेद प्लेट की परिधि के साथ एमएचबी गार ओवरले की सतह पर देखा जा सकता है। यह dereplication परिणाम को प्रभावित नहीं करता है, हालांकि यह डेटा पहली नज़र में व्याख्या करने के लिए कठिन बना सकते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: एमएचबी आगर अधिव्यापन का संदूषण। दूषित एमएचबी आगर ओवरले की सतह पर एक अनियमित वृद्धि पैटर्न पैदा करता है जो प्लेट को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के बाद दिखाई देता है। हालांकि ई. कोलाई वृद्धि अभी भी संदूषण के माध्यम से दिखाई दे सकता है, यह थाली से डेटा extrapolating से पहले प्रयोग दोहराने की सलाह दी है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्लास्मिड चयन मार्कर
पीजीडीपी1 कानामाइसिन 50 डिग्री/
पीजीडीपी2
पीजीडीपी3 एम्पसिलिन 100 ग्राम/
पीजीडीपी4
कोई नहीं -

तालिका 1: pGDP प्लाज्मिड श्रृंखला में उपयोग किए जाने वाले चयन मार्कर. LB agar Petri व्यंजन पर ARP/MARP ई. कोलाई उपभेदों प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए सही एकाग्रता पर उपयुक्त चयन मार्कर युक्त स्ट्रीक.

मीडिया घटक राशि
सैम ग्लूकोज 15 ग्राम
सोया पेपटोन 15 ग्राम
Nacl 5 ग्राम
खमीर निकालने 1 ग्राम
CaCO3 1 ग्राम
ग्लिसरोल 2.5 एमएल
डीडीएच2हे करने के लिए 1 L
बेनेट की आलू स्टार्च 10 ग्राम
कासमिनो अम्ल 2 ग्राम
खमीर निकालने 1.8 ग्राम
Czapek खनिज मिश्रण 2 एमएल
आगर (वैकल्पिक) 15 ग्राम
डीडीएच2हे करने के लिए 1 L
Czapek खनिज मिश्रण केसीएल 10 ग्राम
MgSO4$7H2हे 10 ग्राम
नानो3 12 ग्राम
FeSO4$7H2हे 0.2 ग्राम
केंद्रित एचसीएल 200 $L
डीडीएच2हे 100 एमएल करने के लिए

तालिका 2: सैम और बेनेट मीडिया के लिए व्यंजनों, और Czapek खनिज मिश्रण. autoclaving से पहले 6.8 पीएच करने के लिए सैम और बेनेट समायोजित करें, और Czapek खनिज मिश्रण बाँझ फिल्टर.

एंटीबायोटिक कक्षा एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ई. कोलाई तनाव अच्छी तरह से स्थिति
अमीन्ग्लीकोसाइड्स स्ट्रेप्टोमाइसिन ए.एच.(3'')-Ia $bamB]tolC BW25113 बी 3, जी 10
2- डिऑक्सीस्ट्रेप्टामाइन आर.एम.टी.बी. $bamB]tolC BW25113 एफ 3, सी 10
Apramycin एपीएमए $bamB]tolC BW25113 C5, F8
स्पेक्टिनोमाइसिन ए.एच.(9)-आईए $bamB]tolC BW25113 बी 5, जी 8
$-लैक्टम्स पेनिसिलिन एनडीएम-1 $bamB]tolC BW25113 बी 4, जी 9
सेफेलोस्पोरिन
कार्बेपेनम
लिंकोसैमाइड्स लिंकोसैमाइड्स एर्मसी $bamB]tolC BW25113 D4, E9
मैक्रोलाइड्स मैक्रोलाइड्स एर्मसी
प्रकार बी स्ट्रेप्टोग्रामिन प्रकार बी स्ट्रेप्टोग्रामिन एर्मसी
प्रकार एक स्ट्रेप्टोग्रामिन प्रकार एक स्ट्रेप्टोग्रामिन वैटडी $bamB]tolC BW25113 C3, F10
स्ट्रेप्टोथ्रिसिन स्ट्रेप्टोथ्रिसिन स्टेट $bamB]tolC BW25113 D3, E10
टेट्रासाइक्लिन टेट्रासाइक्लिन टीईटी (ए) $bamB]tolC BW25113 D5, E8
क्लोरैम्फीनिकॉल्स क्लोरैम्फीनिकॉल्स बिल्ली $bamB]tolC BW25113 E4, D9
फॉस्फोमीसिन फॉस्फोमीसिन खात $bamB]tolC BW25113 एफ 6, सी 7
रिफामाइसिन्स रिफामाइसिन्स Arr $bamB]tolC BW25113 E3, D10
Polymyxins Polymyxins एमसीआर-1 जंगली प्रकार BW25113 C6, F7
Echinomycins Echinomycins यूवीआरए $bamB]tolC BW25113 एफ 4, सी 9
साइडरोमिकसिन्स एल्बोमाइसिन फुब उत्परिवर्ती $bamB]tolC BW25113 C4, F9
ट्यूबरैक्टिनोमाइसिन्स विओमाइसिन वी.पी.एच. $bamB]tolC BW25113 F5, C8
एन/ए एन/ए एन/ए जंगली प्रकार BW25113 C1, C12, F1, F12, E5, D8
एन/ए एन/ए एन/ए $bamB]tolC BW25113 A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12

तालिका 3: कम से कम एआरपी उपभेदों के लिए अच्छी तरह से पदनाम तालिका. इस तालिका को इंगित करता है जो अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट है कि कम से कम एआरपी उपभेदों में से प्रत्येक में कम से कम एआरपी पुस्तकालय प्लेट मानचित्र के अनुसार पाया जा सकता है. तालिका में यह भी सूचीबद्ध किया गया है कि प्रत्येक जीन किस एंटीबायोटिक वर्ग को प्रतिरोध प्रदान करता है। कृपया ध्यान दें कि कुछ जीन दिए गए एंटीबायोटिक वर्ग के भीतर एक से अधिक एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं.

एंटीबायोटिक कक्षा एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ई. कोलाई तनाव अच्छी तरह से स्थिति
अमीन्ग्लीकोसाइड्स स्ट्रेप्टोमाइसिन ए.एच.(3'')-Ia $bamB]tolC BW25113 बी 2, जी 11
ए.एच.(6)-आईए $bamB]tolC BW25113 C6, एफ 7
स्पेक्टिनोमाइसिन ए.एच.(9)-आईए $bamB]tolC BW25113 A2, H11
Gentamicin aac(3)-Ia $bamB]tolC BW25113 A3, H10
चींटी(2'')-Ia $bamB]tolC BW25113 A5, H8
ए.पी.एच.(2'')-आईडी $bamB]tolC BW25113 A4, H9
Arma $bamB]tolC BW25113 A6, H7
aac(6')-aph(2'')-Ia $bamB]tolC BW25113 बी 5, जी 8
कानामाइसिन ए.एच.(3')-आईए $bamB]tolC BW25113 बी 4, जी 9
एफ़(3')-इला $bamB]tolC BW25113 बी 3, जी 10
हाइग्रोमाइसिन ए.एच.(4)-आईए $bamB]tolC BW25113 बी 6, जी 7
$-लैक्टम्स एमोन्सिसिलिन टीईएम-1 $bamB]tolC BW25113 एफ 6, सी 7
सेफ्टाज़िडिम सीटीएक्स-एम-15 $bamB]tolC BW25113 F5, C8
ऑक्सैसिलिन ओएक्सए-10 $bamB]tolC BW25113 जी 5, बी 8
ओएक्सए-48 $bamB]tolC BW25113 H5, A8
मेरोपेनेम आईएमपी-7एस $bamB]tolC BW25113 जी 4, बी 9
केपीसी-2 $bamB]tolC BW25113 जी 6, बी 7
एनडीएम-1 $bamB]tolC BW25113 H6, A7
इमिपेनेम VIM-2 $bamB]tolC BW25113 एफ 4, सी 9
लिंकोसैमाइड्स लिंकोसैमाइड्स एर्मसी $bamB]tolC BW25113 C4, F9
lnu(ए) $bamB]tolC BW25113 C5, F8
मैक्रोलाइड्स मैक्रोलाइड्स एर्मसी $bamB]tolC BW25113 C4, F9
एम.ए. $bamB]tolC BW25113 C3, F10
mphB $bamB]tolC BW25113 C2, F11
प्रकार बी स्ट्रेप्टोग्रामिन प्रकार बी स्ट्रेप्टोग्रामिन एर्मसी $bamB]tolC BW25113 C4, F9
वीजीबी $bamB]tolC BW25113 D4, E9
प्रकार एक स्ट्रेप्टोग्रामिन प्रकार एक स्ट्रेप्टोग्रामिन वैटडी $bamB]tolC BW25113 D5, E8
स्ट्रेप्टोथ्रिसिन स्ट्रेप्टोथ्रिसिन स्टेट $bamB]tolC BW25113 D3, E10
टेट्रासाइक्लिन टेट्रासाइक्लिन टीईटी (एम) $bamB]tolC BW25113 E5, D8
क्लोरैम्फीनिकॉल्स क्लोरैम्फीनिकॉल्स बिल्ली $bamB]tolC BW25113 E4, D9
फॉस्फोमीसिन फॉस्फोमीसिन खात $bamB]tolC BW25113 H4, A9
रिफामाइसिन्स रिफामाइसिन्स Arr $bamB]tolC BW25113 E3, D10
एन/ए एन/ए एन/ए $bamB]tolC BW25113 A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12

तालिका 4: एआरपी उपभेदों के लिए अच्छी तरह से पदनाम तालिका. इस तालिका को इंगित करता है जो अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट है कि एआरपी उपभेदों में से प्रत्येक में ARP पुस्तकालय प्लेट मानचित्र के अनुसार पाया जा सकता है. तालिका में यह भी सूचीबद्ध किया गया है कि प्रत्येक जीन किस एंटीबायोटिक वर्ग को प्रतिरोध प्रदान करता है। कृपया ध्यान दें कि कुछ जीन दिए गए एंटीबायोटिक वर्ग के भीतर एक से अधिक एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं.

पूरक चित्रा 1: मूल एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (एआरपी) टेम्पलेट के लिए इस्तेमाल किया पुस्तकालय प्लेट नक्शा। सभी आवश्यक नियंत्रण और डुप्लिकेट शामिल हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस प्रारूप का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में संबंधित ई. कोलाई उपभेदों व्यवस्थित करें। यह आंकड़ा कॉक्स एट अल10से संशोधित किया गया है। कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्रा 2: पुस्तकालय प्लेट मानचित्र न्यूनतम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (एमआरपी) टेम्पलेट के लिए इस्तेमाल किया। सभी आवश्यक नियंत्रण और डुप्लिकेट शामिल हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस प्रारूप का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में संबंधित ई. कोलाई उपभेदों व्यवस्थित करें। कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

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Discussion

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल यौगिकों और सहायकों की खोज दोनों पर लागू किया जा सकता है जिनका उपयोग मौजूदा एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उनकी गतिविधि को बचाने के लिए किया जा सकता है। मंच प्रतिरोध तंत्र और उनके cognate एंटीबायोटिक दवाओं के उच्च सब्सट्रेट विशिष्टता का लाभ लेता है, कच्चे प्राकृतिक उत्पाद के अर्क के भीतर यौगिकों dereplicate. हालांकि dereplication प्लेटों के लिए आवश्यक समय लंबा है ($2 सप्ताह), dereplication प्रक्रिया ही एक रात भर ऊष्मायन अवधि के बाद पूरा हो गया है, जो समय यह अलग करने के लिए ले जा सकते हैं की तुलना में तेजी से है और एक विशेषता कच्चे तेल के अर्क से यौगिक. इसके अतिरिक्त, कोई महंगा या अत्यधिक विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, इस मंच सुलभ और लागत प्रभावी बनाने.

इस मंच का एक अन्य प्रमुख लाभ इसका लचीलापन है। एआरपी प्रतिरोध जीन है कि अधिक एंटीबायोटिक वर्गों को शामिल शामिल करने के लिए विस्तार किया जा सकता है. यह उपन्यास प्रतिरोध एंजाइमों के उद्भव के लिए साहित्य की निगरानी और ई. कोलाई पुस्तकालय में जीन जोड़ने के लिए बुनियादी आणविक क्लोनिंग तकनीक का उपयोग करके हासिल की है. इसके अलावा, dereplication टेम्पलेट व्यापक या संकीर्ण रेंज सब्सट्रेट विशिष्टता है कि एक व्यक्ति जब dereplicating का उपयोग करना चाहता है के वांछित स्तर के आधार पर अनुकूलन योग्य है. ई. कोलाई पुस्तकालय में जीन के किसी भी संयोजन के लिए विभिन्न प्रोफाइल के साथ यौगिकों का पता लगाने की क्षमता के साथ उपन्यास पुस्तकालय प्लेटें बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ई. कोलाई को व्यक्त करने वाला एक $-लैक्टाम्स और उनके विभिन्न उपवर्गों के अत्यधिक विशिष्ट विप्रतिकृति के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया जा सकता है।

हालांकि इस मंच शुरू में ठोस मीडिया पर यौगिकों dereplicate डिजाइन किया गया था, यह भी तरल मीडिया में काम करता है. यह उपयोगी है जब यौगिकों कि पहले से ही शुद्ध किया गया है जिसमें केवल एक सीमित मात्रा में परीक्षण के लिए उपलब्ध है के साथ काम कर रहा है, या जब यौगिकों कि आसानी से या लगातार ठोस मीडिया में फैलाना नहीं है के साथ काम कर रहे. अंत में, जबकि इस प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया था ई. कोलाई उपभेदों BW25113 और BW25113 का उपयोग कर -bamB]tolC, मंच प्रतिरोध जीन पुस्तकालय ई. कोलाई के विभिन्न उपभेदों में व्यक्त के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है (dereplication फीनोटाइप भिन्न हो सकतेहैं) | अंततः, एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच लचीला है, कई आवेदन किया है, और अन्य dereplication तरीकों पर फायदेमंद है.

यह सुनिश्चित करने के लिए कि पुन: उत्पादन योग्य और गैर-संदूषित परिणाम प्राप्त किए जाते हैं, उपयुक्त नसबंदी और एसेप्टिक तकनीकों का पालन करना महत्वपूर्ण है। ऐसा करने में विफलता पिनिंग उपकरण, पुस्तकालय प्लेट, या dereplication प्लेट ही के संदूषण में परिणाम होगा। जबकि चयन मार्करई ई कोलाई पुस्तकालय में मौजूद हैं, जो मार्कर लापता बैक्टीरिया की वजह से संदूषण को रोकने में मदद कर सकते हैं, यह एक ही मार्कर का उपयोग कर उपभेदों के पार संदूषण को नहीं रोकता है। यह हो रहा है के जोखिम को कम करने के लिए यह ध्यान से पुस्तकालय की थाली से pinning से पहले जीवाणु pinning उपकरण बाँझ करने के लिए आवश्यक है. प्रत्येक लायब्रेरी प्लेट केवल 3 से पिन किया जाना चाहिए अधिकतम एक नया टेम्पलेट के लिए discarding से पहले। यह सभी dereplication प्लेटों में संदूषण के प्रसार को रोकता है अगर एक पुस्तकालय प्लेट pinning प्रक्रिया के दौरान दूषित हो जाता है. इसके अतिरिक्त, कोई एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया जाता है जब dereplication प्लेट inoculating और इतना महान देखभाल प्रदूषण को रोकने के लिए इससे पहले कि यह छह दिनों के लिए खमीर छोड़ दिया जाता है लिया जाना चाहिए. संदूषण का एक अन्य संभावित स्रोत dereplication प्लेट के MHB agar ओवरले में है. यदि ओवरले मीडिया दूषित है, विकास केवल 37 डिग्री सेल्सियस के बाद पिनिंग पर रात भर ऊष्मायन के बाद दिखाई देगा। ओवरले संदूषण ओवरले सतह पर ई कोलाई पुस्तकालय के विकास का विश्लेषण करने के लिए बेहद मुश्किल बना सकते हैं। ओवरले संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, ओवरले डालने से पहले एमएचबी आगर को ताजा तैयार करें। यह अनुशंसा की जाती है कि जब तक एक व्यक्ति इस विधि के साथ सहज नहीं होता है, dereplication प्लेटें हमेशा डुप्लिकेट में तैयार किया जाना चाहिए या इस तरह से है कि एक थाली के संदूषण की स्थिति में, डेटा अभी भी उम्मीद से निकाला जा सकता है गैर-संदूषित प्लेटें।

अंत में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि ARP/MARP की सीमाएँ हैं। यह प्रोटोकॉल एक से अधिक बायोएक्टिव यौगिक का उत्पादन करने वाले उत्पादक-विकृतिों के वि-प्रतिकृति के लिए उपयुक्त नहीं है. ई. कोलाई पुस्तकालय में प्रत्येक तनाव के लिए एक ही प्रतिरोध जीन व्यक्त डिजाइन किया गया है. यदि किसी जीव द्वारा दो एंटीबायोटिक दवाओं का उत्पादन किया जा रहा है, तो न तो प्रतिरोध जीन दूसरे एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध प्रदान करेगा, जिसके परिणामस्वरूप दोनों उपभेदों की कोशिका मृत्यु हो जाएगी। इस प्रकार, इस संभावना पर विचार किया जाना चाहिए जब dereplication परिणाम एक उपन्यास एंटीबायोटिक की उपस्थिति का सुझाव है क्योंकि कई एंटीबायोटिक दवाओं के उत्पादन वर्तमान एकल निर्माण ई. कोलाई पुस्तकालय द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है. एक दृष्टिकोण है कि तनाव dereplicating कि एक से अधिक एंटीबायोटिक उत्पादन की चुनौती का मुकाबला करने के लिए लिया जा सकता है कॉक्स एट अल द्वारा मूल एआरपी कागज में वर्णित agar प्लग प्रक्रिया का उपयोग शामिल है10. इस विधि में, किण्वित ठोस माध्यम का एक हिस्सा एंटीबायोटिक-निर्माता से हटा दिया जाता है जिसमें प्लेट होती है और सूचक एआरपी तनाव के लॉन पर रखा जाता है। सूचक तनाव एआरपी पुस्तकालय में प्रतिरोधी ई. कोलाई उपभेदों के किसी भी हो सकता है. निषेध के क्षेत्र तो एआरपी उपभेदों और एक जंगली प्रकार तनाव के खिलाफ एक उत्पादन तनाव की bioactivity की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है. एआरपी उपभेदों कि जंगली प्रकार तनाव की तुलना में कम आकार का एक निरोधात्मक क्षेत्र फार्म का उत्पादन किया जा रहा यौगिक का विरोध कर सकते हैं. इस विधि ने अनेक एंटीबायोटिक दवाओं के उत्पादन में सक्षम प्रभेदों की पहचान करने में प्रभावी सिद्ध कियाहै.

संक्षेप में, ARP/MARP के साथ dereplicating जब सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए यह अनुशंसा की जाती है कि dereplication प्लेटें डुप्लिकेट या trilicate में तैयार कर रहे हैं. प्रोटोकॉल में अन्य महत्वपूर्ण कदम एक ताजा पुस्तकालय प्लेट से pinning शामिल (कभी नहीं जमे हुए) और झिल्ली हटाने के चरण के दौरान उत्पादन तनाव से संभव के रूप में ज्यादा बायोमास हटाने. यदि सभी आवश्यक चरणों का पालन कर रहे हैं, एक एक दो सप्ताह की समय सीमा के भीतर ब्याज की एक उत्पादन तनाव के लिए सफल dereplication परिणाम होना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

ARP/MARP से संबंधित राइट प्रयोगशाला में अनुसंधान ओंटारियो अनुसंधान कोष और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान के संस्थानों (FRN-148463) द्वारा समर्थित किया गया था. हम विस्तार और एआरपी पुस्तकालय के संगठन में सहायता के लिए Sommer Chou स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich - Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

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References

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