Summary
抗生物質の脱複製に対する同種抗生物質耐性エシェリヒア大腸菌のライブラリーを利用するプラットフォームについて述べる。細菌または真菌によって産生される抗生物質の同一性は、それぞれの耐性遺伝子を発現する大腸菌の増殖によって推定することができる。このプラットホームは経済的に有効で、時間効率が良い。
Abstract
天然物抽出物からの新しい抗生物質の探索における主な課題の1つは、一般的な化合物の再発見です。この課題に対処するために、既知の化合物を同定するプロセスである脱複製が目的のサンプルに対して行われます。分析分離、質量分析などの脱複製の方法は、時間とリソースを大量に消費します。脱複製プロセスを改善するために、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)を開発しました。ARPは、エシェリヒア大腸菌に個別にクローニングされた約100の抗生物質耐性遺伝子のライブラリーです。この株のコレクションは、抗生物質の脱複製のための費用対効果の高い、顔の良い方法を含む多くのアプリケーションを持っています。このプロセスは、固体媒体を含む長方形ペトリ皿の表面に抗生物質産生微生物を発酵させ、それによって培地を介した二次代謝産物の分泌および拡散を可能にする。6日間の発酵期間の後、微生物バイオマスを除去し、薄い寒天オーバーレイをペトリ皿に加えて滑らかな表面を作成し、大腸菌指標株の成長を可能にします。ARP株の私たちのコレクションは、抗生物質含有ペトリ皿の表面に固定されます。プレートは、オーバーレイの表面に大腸菌の成長を可能にするために、次に一晩インキュベートされます。特定の抗生物質(またはクラス)に対する耐性を含む株のみがこの表面上で成長し、生成された化合物の迅速な同定を可能にする。この方法は、既知の抗生物質の生産者の同定と、新しい化合物を産生するものを同定する手段として正常に使用されている。
Introduction
1928年にペニシリンが発見されて以来、環境微生物由来の天然物は、抗菌化合物1の豊富な供給源であることが証明されている。天然物系抗生物質の約80%はストレプトマイセス属および他の多発性菌の細菌に由来し、残りの20%は真菌種1によって産生される。β-ラクタム、テトラサイクリン、リファマイシン、アミノグリコシドなどの診療所で使用される最も一般的な抗生物質足場のいくつかは、もともと微生物2から単離された。しかし、多剤耐性(MDR)細菌の増加により、現在の抗生物質のパネルは治療3、4であまり効果がなくなってきています。これらには、「ESKAPE」病原体(すなわち、バンコマイシン耐性腸球菌およびβ-ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、クレブシエラ肺炎、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、およびエンテロバクターsp.)は、世界保健機関(WHO)3、4、5などの多くの主要な公衆衛生当局によって最も高いリスクに関連していると考えられる細菌のサブセットである。これらのMDR病原体の出現とグローバルな広がりは、新しい抗生物質3、4、5の絶え間ない必要性をもたらす。残念ながら、過去20年間で、微生物源からの新しい抗生物質の発見はますます困難であることを実証している6.創薬に対する現在のアプローチには、天然物抽出ライブラリーを含む生理活性化合物のハイスループットスクリーニングが含まれており、所定の時間2で何千もの抽出物を試験することができる。しかし、抗菌活性が検出されると、次のステップは、原油抽出物の内容物を分析して活性成分を同定し、既知または冗長化合物7、8を含むものを排除する。このプロセスは、脱複製と呼ばれ、既知の抗生物質7、9の再発見に費やされる時間を防止および/または大幅に短縮するために不可欠である。天然物創薬の必要なステップですが、脱複製は、非常に手間がかかり、リソース集約的な10.
Beutlerらは、最初に「脱複製」という用語を造語して以来、既知の抗生物質11、12の迅速な同定のための革新的な戦略を開発するための広範な努力がなされてきた。今日、脱複製に使用される最も一般的なツールには、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析、および核磁気共鳴ベースの検出方法11、13などの分析クロマトグラフィーシステムが含まれる。残念ながら、これらの方法のそれぞれは、高価な分析機器と高度なデータ解釈の使用を必要とします。
特殊な装置なしで迅速に行うことができる脱複製法を開発する試みとして、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)10を確立した。ARPは、抗生物質アジュバントの発見、既知の耐性機構に対する新しい抗生物質化合物のプロファイリング、およびアクチノバクテリアおよび他の微生物由来の抽出物における既知の抗生物質の脱複製に使用することができる。ここでは、抗生物質の脱複製におけるその応用に焦点を当てる。ARPは、最も一般的に再発見された抗生物質14,15に対して有効である個々の抵抗遺伝子を発現する等方性エシェリヒア大腸菌株のライブラリーを利用する。大腸菌ライブラリーが二次代謝産物産生生物の存在下で成長すると、化合物の同一性は、関連する耐性遺伝子10を発現する大腸菌株の増殖によって推測されうる。ARPが最初に報告されたとき、ライブラリーは16の抗生物質クラスに対する耐性を与える>40遺伝子で構成されていました。元の脱複製テンプレートは、脱複製プロセス中に抗生物質サブクラスに関する情報を提供するために、抗生物質クラスごとの耐性遺伝子のサブセットを包含するように設計されました。今日、ARPは18の抗生物質クラスに対する抵抗性を与える>90遺伝子で構成されている。耐性遺伝子の広範なコレクションを使用して、二次脱複製テンプレートが開発され、最小抗生物質耐性プラットフォーム(MARP)として知られています。このテンプレートは、遺伝子の冗長性を排除し、単に脱複製された代謝産物が関連する一般的な抗生物質クラスに関する情報を提供するために作成されました。さらに、MARPテンプレートは、野生型と大腸菌BW25113(大腸菌BW25113ΔbamBΔtolC)の両方の肥一性/流出欠損株の両方を有し、ARPの元の化身と比較して、唯一の過透過性株を利用する。このユニークな側面は、脱複製中に追加の型を作成し、グラム陰性細菌の外膜を横断する化合物能力を示す。ここでは、ARP または MARP を使用して複製を解除する際に従うべき堅牢なプロトコルについて説明し、従うべき最も重要な手順を強調し、さまざまな可能な結果について説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.大腸菌ライブラリーグリセロールストックの調製(寒天スラントから)
- ARP/MARP大腸菌株を、LB寒天と適切な選択マーカーを含むペトリ皿にリソジェニーブロス(LB)寒天のスラングからストリークします(表1)。
- 1つのコロニーで適切な選択可能なマーカーを含むLBの3 mLを接種することにより、大腸菌株の各培養物を調記する。通気(250 rpm)で37°Cで一晩成長します。
- 800 μL の培養と 200 μL の無菌 80% グリセロールを 1.8 mL の凍結で組み合わせます。チューブを3~4回反転して混ぜ、-80°Cに保存します。
2. ARP/MARP冷凍ストックライブラリプレート準備
- セクション1で調製したグリセロールストックから、LB寒天と適切な選択可能なマーカーを含むペトリ皿の新しいセットにARP/MARP株をストリークします。37 °Cで一晩成長します。
- 無菌技術を用いて、カチオンのピペット500μLは、無菌貯留槽から無菌96深井戸プレートの各井戸にミューラー・ヒントン・ブロス(MHB)を調整した。
- ステップ2.1で用意したプレートでは、アプリケータスティックを使用して、ARP/MARPマップ(補足図1および補足図2)に従って96の深い井戸板を接種します。適切な選択可能なマーカーが各ウェルに追加されていることを確認します。深い井戸板の表面に通気性シール膜を置き、37°C(250 rpm)で一晩インキュベートします。
- ARP/MARP マップを参照して、汚染された井戸がないことを確認します。汚染された場合は繰り返します。マルチチャンネルピペッタを使用して、深い井戸プレートの各ウェルから100μLを無菌96ウェル丸底板に移します。この手順を繰り返して、複数の凍結ストック ライブラリ プレートを作成します。
注:凍結ストックライブラリプレートが汚染された場合にステップ2.1−2.4を繰り返さないように、一度に少なくとも5枚のライブラリプレートを準備することをお知りください。 - 無菌50%グリセロールの100μLを各ウェルにピペッティングし、上下にゆっくりとピペッティングして混ぜ合わせ、ARP/MARP冷凍ストックライブラリプレートを作り終えます。
- 滅菌アルミニウムシールでプレートを覆い、各井戸が個別に密封されていることを確認してください。
- プレートに番号を付け、特定の時間に新しいテンプレートを接種するための冷凍ストックライブラリプレートを1つだけ専用します。凍結ストックライブラリプレートの汚染が発生した場合は、残りをバックアップとして保管してください。
- プレート蓋をアルミシールの上に置き、-80°Cに保管します。
3. 種子培養・脱複製プレート調製
- アプリケータースティックを使用して、1つの滅菌ガラスビーズを含む試験管内のストレプトマイセス系抗生物質培地(SAM)(または試験対象の他の適切な培地)の3mLを接種し、産生株を有する。デレプリケートされます。ストレプトマイセスの場合は、コロニーの表面から胞子をそっと掻き取ります。
- 同じ木製のアプリケータースティックを使用して、ベネットの寒天を含むペトリ皿に無菌制御をストリーク。
- 種子培養を30°Cで6日間(250rpm)通気でインキュベートし、無菌制御プレートを30°Cで6日間インキュベートします。
注:SAM とベネットのメディアレシピについては、表 2を参照してください。上記の指示は、ほとんどのアクティノマイセトに適しています。他の細菌や真菌のために必要に応じて成長培温を変更します。 - 23 mLの暖かいベネットの寒天を血清的なピペットに吸引して脱複製プレートを準備し、長方形のペトリ皿(材料のテーブル)の表面を均等に20 mL分配し、メディアの残りの部分をピペットに残して防ぎます。気泡形成。
注:プレートを注ぐために使用される表面が水平であることを確認し、寒天があまりにも冷却する前に、この手順を実行します。平らなサーフェスは、次の段階でライブラリを固定するために不可欠です。 - 媒体がプレートのすべての領域を覆うまでプレートをゆっくりと回転させ、寒天が完全に設定されるまで、プレートを邪魔しません。
- シートが脱複製プレートの表面に収まるように、長方形のペトリ皿蓋をトレーステンプレートとして使用して、ニトロセルロース膜シート(材料の表)を準備します。シーツを切り、無菌パウチでオートクレーブします。
注:この膜は、生物がその表面に胞子を可能にし、二次代謝物は、以下の媒体に排泄することができる。一度成長すると、膜が除去のためのきれいな表面を提供するために除去されます。膜紙がベネットの寒天の表面に近いほど、脱複製の結果はクリーンになります。 - 無菌制御プレートをチェックして、インキュベーションの6日後に汚染物質が存在しないことを確認してください。汚染のない場合は、長方形のペトリ皿の蓋を取り外し、種子培養物のピペット200 μLをベネットの寒天の表面に取り外します。
- 無菌綿棒を使用して、プレート全体の表面全体に均等に培養物を広げます。
- ペトリ皿の表面に培養の上にステップ3.6で調製したニトロセルロース膜を置きます。ペトリ皿の下端に膜の下端を合わせることから始め、ゆっくりとプレートの上端に膜を適用します。
- 無菌綿棒を使用して、膜寒天界面の間に形成された気泡を滑らかにし、膜が寒天にフラッシュされることを保証します。
- 長方形のペトリ皿に蓋を戻し、密閉されたビニール袋に逆さまに置きます。30°Cで6日間インキュベートします。
4. 復位プレートMHBオーバーレイとARP/MARPライブラリプレート準備
- 6日後、30°Cインキュベーターから脱複製プレートを取り出します。滅菌ピンセット(70%エタノールでオートクレーブまたはスプレー)を使用して、ベネットの寒天の表面からニトロセルロース膜を慎重に取り除きます。
注:このステップは、脱複製のためのきれいな表面を提供するために、膜の表面に成長した疎水性胞子とmyceliaを除去し、ステップ4.2を容易にします。 - ステップ3.4で説明したように、作業面が水平であることを確認し、血清ピペットを使用して23 mLの暖かい陽イオン調整MHB寒天を吸引する。脱複製プレートの表面に20mLを均等に分配し、空気の泡の形成を防ぐためにピペットに媒体の残りの部分を残すことによってオーバーレイを作成します。
- 媒体がすべての領域を覆うまでプレートを穏やかに回転させ、寒天が完全に設定されるまでそれを邪魔しません。冷却して固化したら、脱複製プレートを密閉されたビニール袋に戻し、一晩4°Cで逆さまに保管します。
注:このステップは、発酵ベネットの媒体からMHB寒天オーバーレイへの二次代謝産物の拡散を可能にする。ニトロセルロース膜が適切に調製されなかった場合、MHB寒天を撃退する疎水性特性を有するプレートの縁の周りに胞スが生育します。オーバーレイが汚染される可能性があるため、これらの胞子の上にオーバーレイを注ぎ込まないようにしてください。 - オーバーレイが注がれた同じ日に、100 μLの陽イオン調整MHBを96ウェルプレートの各ウェルにピペッティングして、新鮮なARP/MARPテンプレートを接種します。
注:脱複製中に汚染が広がる可能性を減らすには、単一のARP/MARPライブラリプレートを使用して、2-3脱複製プレートのみをデレプリケートします。したがって、脱複製される株の数に基づいて、十分な96ウェルARP/MARPプレートを接種します。 - 冷凍ストックARP/MARPライブラリプレートを-80 °C冷凍庫から取り出します。結露が下側に形成され始める前にアルミニウムシールを取り除き、それによって図書館の板の近隣の井戸を汚染する可能性を減らす。
- 無菌の96ウェルピン留めツール(または他の形態の接種装置)を使用して、冷凍ストックARP/MARPライブラリプレートから慎重にピン留めし、新鮮なMHB含有96ウェルプレートを接種します。脱複製時の汚染を最小限に抑えるには、ライブラリプレートごとに2−3のデレプリケーションプレートのみをデプリケートするために必要なARPまたはMARPライブラリプレートをいくつでも準備します。各プレートを接種する間にピン留めツールを殺菌します。
- 冷凍テンプレートに新しい無菌アルミニウムシールを貼り、-80°C冷凍庫に戻します。密封されたビニール袋の中に接種された96ウェルプレートを入れ、18時間通気(250 rpm)で37°Cでインキュベートします。
注:新しい冷凍ストックライブラリプレートは、汚染が存在しないことを確認した後、この手順から準備することができます。ステップ2.5に記載されているように-80 °Cで保存する前にプレートにグリセロールを追加します。
5. ARP/MARP を使用したリプリケートの再現
- インキュベーターから ARP/MARP テンプレートを取り外し、汚染物質が存在しないことを確認します。常に、冷凍在庫から直接ではなく、新たに準備されたテンプレートを使用して複製を削除します。
- 4°Cから脱複製プレートを取り出し、室温まで平衡化します。結露がある場合は、蓋を開け、無菌環境で乾燥させます。
- 無菌ピンニングツール(またはその他の接種装置)を使用して、ARP/MARPライブラリプレートから脱複製プレートのMHB寒天オーバーレイの表面にピンをピン留めします。寒天に突き刺さらないのは注意が必要だ。各脱複製プレートを接種する間にピン留めツールを殺菌します。
- テンプレートを脱複製プレートの表面に固定した後、テンプレートの接種を3-5分間乾燥させます。
- 次の日の脱複製結果を分析し、脱複製プレート上の成長を ARP/MARP マップに対応するウェルと比較します (表 3および表 4)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以下の結果は、ARPおよび/またはMARPを使用して抗生物質産生株のコレクションが非複製された場合に得られた。
ARP/MARP 脱複製ワークフローの図を図 1に示し、ライブラリ プレート マップを補足図 1および補足図 2 に示します。図2は、環境抽出物WAC 8921がクロラムフェニコール生産者として同定される陽性脱複製結果を示す。図3は、ARPの成長の欠如を完全に示し、これは、未知の抗生物質またはARP/MARPライブラリープレートに考慮されていないあまり一般的に見つからない抗生物質の存在を示す。図4は、野生型大腸菌BW25113と、過透過性および流出不十分な変異体大腸菌BW25113 ΔbamBΔtolCの両方の利用により、MARPに特有の成長パターンを示す。この結果は、無傷の外膜を上回ることができない抗菌活性を有する化合物の存在を示唆している。図5は、ピン留めツールの不適切な殺菌を示唆する大腸菌成長パターンを示し、図6はARP/MARP凍結ストックライブラリプレート汚染の例を示す。図 7は、複製の複製中に寒天オーバーレイがピアスされた場合の動作を示しています。最後に、図 8は、脱複製プロセス中に発生する可能性のある MHB オーバーレイ関連の汚染を示しています。
図 1: デプリケーション プロセスの概略図。複製される生産株は、芝生として長方形のペトリ皿に縞状にされ、ニトロセルロース膜が上に置かれる。プレートは6日間インキュベートされ、生産株関連バイオマスが膜の表面に成長し、生成された二次代謝物がペトリ皿媒体に分泌される。6日間の発酵期間の後、膜を除去し、MHBオーバーレイを抗生物質含有培地の表面に添加し、ピン留めのための滑らかな表面を提供する。ARP/MARP E. Coliライブラリは、ARP/MARP マップに従って 96 ウェル プレート形式で配置され、オーバーレイのサーフェスに固定されます。トレイを37°Cで一晩インキュベートした後、特異的耐性遺伝子を発現する大腸菌株の増殖は、産生される化合物の同一性を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:既知の抗生物質の脱複製。産生株WAC 8921は、ARPテンプレートを用いて脱複製された。大腸菌BW25113 ΔbamBμC pGDP1の成長:MHB寒天オーバーレイの表面上のCATは、WAC 8921がクロラムフェニコール生産者であることを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:未知の抗生物質の脱複製。産生株WAC 9941は、ARPテンプレートを用いて脱複製された。大腸菌ライブラリーの成長の欠如は、長方形のペトリ皿の表面に見られ、WAC 9441が未知の抗菌化合物またはARPで考慮されていない希少な抗生物質を産生していることを示した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:無傷の外膜を横断できない抗菌化合物の同定。産生株WAC 4178は、MARPテンプレートを用いて脱複製した。大腸菌BW25113の株は二次代謝物含有培地の表面上で成長することができるが、大腸菌BW25113ΔbamBΔtolCのすべての株は成長できない。これは、WAC 4178が無傷の外膜を横断できない抗菌化合物を産生していることを示唆している。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:非滅菌ピン留め工具による汚染。産生株WAC 7094は、ARPテンプレートを用いて脱複製した。割り当てられた大腸菌株を持たない領域における大腸菌ライブラリーの成長の存在は、長方形ペトリ皿のMHB寒天オーバーレイを接種するために使用されるピン留めツールが適切に殺菌されなかったことを示唆している。これにより、オーバーレイ間で未知の大腸菌株が転移します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:汚染された凍結ストックARP/MARPテンプレートによる汚染。産生株WAC 3683は、ARPテンプレートを用いて脱複製された。長方形のペトリ皿表面に成長した3つの異なる大腸菌コロニー:2つは大腸菌BW25113 ΔbamBμCを発現するSTAT、ストレプトリスリン耐性酵素、もう1つは大腸菌に対応BW25113 ΔbamBΜCを発現するVIM-2ss、β-ラクタム耐性酵素である。blaVIM2ssコロニーの増殖を複製する欠如のために、これら2つの抗生物質クラス間で生じることが知られているクロス抵抗性の欠如に加えて、大腸菌Δ bamBΔ以外の株を仮定することができる。tolC pGDP1: blaVIM2ssは、それぞれの冷凍ライブラリープレートでよく成長しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ピアスされたMHB寒天オーバーレイ。産生株WAC 5106は、ARPテンプレートを用いて脱複製した。この株は、大腸菌BW25113 ΔbamBtolC pGDP3:aph(6)-Iaの成長によって示されるように、連鎖マイシンの生産者であることが判明した。穿刺穴は、プレートの周囲に沿ってMHB寒天オーバーレイの表面に見ることができます。これはデレプリケーションの結果には影響しませんが、データを一見すると解釈しにくくなります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:MHB寒天オーバーレイの汚染汚染されたMHB寒天は、37°Cでプレートを一晩インキュベートした後に見えるオーバーレイの表面に不規則な成長パターンを生成します。大腸菌の成長は汚染によってまだ見えるかもしれませんが、プレートからデータを外挿する前に実験を繰り返すことをお勧めします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プラスミッド | 選択可能なマーカー |
| pGDP1 | カナマイシン 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | アンピシリン 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| なし | - |
表1:pGDPプラスミド系列で使用される選択可能なマーカー。ARP/MARP大腸菌株をLB寒天ペトリ皿にストリークし、各プラスミドに対して適切な濃度で適切な選択可能なマーカーを含む。
| メディア | 成分 | 量 |
| サム | グルコース | 15グラム |
| 宗谷ペプトン | 15グラム | |
| 塩化 ナトリウム | 5グラム | |
| 酵母エキス | 1 グラム | |
| カコ3 | 1 グラム | |
| グリセロール | 2.5 mL | |
| ddH2O | 1 L まで | |
| ベネットの | 片栗粉 | 10グラム |
| カサミノ酸 | 2グラム | |
| 酵母エキス | 1.8グラム | |
| チャペックミネラルミックス | 2 mL | |
| 寒天(オプション) | 15グラム | |
| ddH2O | 1 L まで | |
| チャペックミネラルミックス | Kcl | 10グラム |
| MgSO4∙7H2O | 10グラム | |
| ナノ3 | 12グラム | |
| フェソ4∙7H2O | 0.2グラム | |
| 濃縮HCl | 200 μL | |
| ddH2O | 100 mL まで |
表2:SAMとベネットのメディア、およびCzapekミネラルミックスのレシピ。AUTOclavingの前にSAMとベネットをpH 6.8に調整し、Capekミネラルミックスを殺菌します。
| 抗生物質クラス | 抗生物質 | 抵抗遺伝子 | 大腸菌株 | ウェルポジション |
| アミノグリコシド | ストレプトマイシン | aph(3'')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3、G10 |
| 2- デオキシストレプタミン | rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3、C10 | |
| アプラマイシン | apmA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5、F8 | |
| スペクチノマイシン | aph(9)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5、G8 | |
| β-ラクタム | ペニシリン | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4、G9 |
| セファロスポリン | ||||
| カルバペナム | ||||
| リンコサミド | リンコサミド | エルムC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4、E9 |
| マクロライド | マクロライド | エルムC | ||
| タイプ B ストレプトグラミン | タイプ B ストレプトグラミン | エルムC | ||
| タイプ A ストレプトグラミン | タイプ A ストレプトグラミン | バットD | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3、F10 |
| ストレプトスリチン | ストレプトスリチン | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3、E10 |
| テトラサイクリン | テトラサイクリン | テット(A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5、E8 |
| クロラムフェニコルス | クロラムフェニコルス | 猫 | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4、D9 |
| フォスフォマイシン | フォスフォマイシン | フォサ | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6、C7 |
| リファマイシン | リファマイシン | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3、D10 |
| ポリミキシン | ポリミキシン | MCR-1 | ワイルドタイプ BW25113 | C6、F7 |
| エキノマイシン | エキノマイシン | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4、C9 |
| サイドロマイシン | アルボマイシン | fhuB変異体 | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4、F9 |
| ツベルクノマイシン | ビオマイシン | vph | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5、C8 |
| N/a | N/a | N/a | ワイルドタイプ BW25113 | C1、C12、F1、F12、E5、D8 |
| N/a | N/a | N/a | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
表3:最小ARP株のウェル指定表。この表は、最小ARPライブラリプレートマップに従って、最小ARP株のそれぞれが見つけることができる96ウェルプレートの井戸を示しています。この表には、各遺伝子がどの抗生物質クラスに耐性を付与するのも一覧表示されます。一部の遺伝子は、与えられた抗生物質クラス内の複数の抗生物質に対する耐性を付与することがあります。
| 抗生物質クラス | 抗生物質 | 抵抗遺伝子 | 大腸菌株 | ウェルポジション |
| アミノグリコシド | ストレプトマイシン | aph(3'')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2、G11 |
| aph(6)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6、F7 | ||
| スペクチノマイシン | aph(9)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2、H11 | |
| ゲンタマイシン | aac(3)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3,H10 | |
| アリ(2'''-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5、H8 | ||
| aph(2'')-Id | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4、H9 | ||
| アルマ | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6、H7 | ||
| aac(6')-aph(2''')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5,G8 | ||
| カナマイシン | aph(3')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4、G9 | |
| aph(3')-イラ | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3、G10 | ||
| ヒグロマイシン | aph(4)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6,G7 | |
| β-ラクタム | アモキシシリン | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6、C7 |
| セフタジジム | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5、C8 | |
| オキサシリン | オキサ-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5、B8 | |
| オキサ-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5、A8 | ||
| メロペネム | IMP-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4、B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6、B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6、A7 | ||
| イミペネム | VIM-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4、C9 | |
| リンコサミド | リンコサミド | エルムC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4、F9 |
| lnu(A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5、F8 | ||
| マクロライド | マクロライド | エルムC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4、F9 |
| mphA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3、F10 | ||
| mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2、F11 | ||
| タイプ B ストレプトグラミン | タイプ B ストレプトグラミン | エルムC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4、F9 |
| Vgb | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4、E9 | ||
| タイプ A ストレプトグラミン | タイプ A ストレプトグラミン | バットD | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5、E8 |
| ストレプトスリチン | ストレプトスリチン | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3、E10 |
| テトラサイクリン | テトラサイクリン | テット(M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5、D8 |
| クロラムフェニコルス | クロラムフェニコルス | 猫 | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4、D9 |
| フォスフォマイシン | フォスフォマイシン | フォサ | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4、A9 |
| リファマイシン | リファマイシン | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3、D10 |
| N/a | N/a | N/a | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
表 4: ARP 株のウェル指定表。この表は、ARP ライブラリ プレート マップに従って、各 ARP 株が見つかる 96 ウェル プレートのウェルを示します。この表には、各遺伝子がどの抗生物質クラスに耐性を付与するのも一覧表示されます。一部の遺伝子は、与えられた抗生物質クラス内の複数の抗生物質に対する耐性を付与することがあります。
補足図1:元の抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)テンプレートに使用されるライブラリプレートマップ。この形式を使用して、それぞれの大腸菌株を96ウェルプレートに整理し、必要なコントロールと複製がすべて含まれていることを確認します。この数値は Cox et al.10から変更されています。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:最小抗生物質耐性プラットフォーム(MARP)テンプレートに使用されるライブラリプレートマップ。この形式を使用して、それぞれの大腸菌株を96ウェルプレートに整理し、必要なコントロールと複製がすべて含まれていることを確認します。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上記のプロトコルは、その活性を救出するために既存の抗生物質と組み合わせて使用することができる新しい抗菌化合物およびアジュバントの両方の発見に適用することができる。プラットフォームは、耐薬品抽出物内の化合物を脱複製するために、抵抗機構とその認知抗生物質の高い基質特異性を利用します。脱複製プレートの調製に要する時間は長い(~2週間)が、一晩のインキュベーション期間を経て脱複製プロセス自体が完了し、分離および特徴付けにかかる時間に比べて速い。粗抽出物からの化合物。さらに、高価な機器や高度に専門性の高い機器は不要で、このプラットフォームはアクセスしやすく、費用対効果が高くなります。
このプラットフォームのもう一つの大きな利点は、その柔軟性です。ARPは、より多くの抗生物質クラスを包含する耐性遺伝子を含むために拡張することができる。これは、新規耐性酵素の出現に関する文献をモニタリングし、基本的な分子クローニング技術を使用して大腸菌ライブラリーに遺伝子を追加することによって達成されます。さらに、デレプリケーションテンプレートは、個人が非複製時に使用する範囲または狭い範囲基板特異性の所望のレベルに基づいてカスタマイズ可能です。大腸菌ライブラリー内の遺伝子の任意の組み合わせは、異なるプロファイルを有する化合物を検出する能力を持つ新しいライブラリープレートを作るために使用することができます。例えば、大腸菌を発現するβ-ラクタマーゼを開発し、βラクタムとその異なるサブクラスの高度に特異的な脱複製を可能にすることができる。
このプラットフォームは、当初、固体媒体上の化合物を複製するように設計されましたが、液体媒体でも動作していました。これは、既に精製された化合物で、テストに使用できる量が限られている場合や、固体媒体で容易または一貫して拡散しない化合物を使用する場合に便利です。最後に、このプロトコルは大腸菌株BW25113およびBW25113 ΔbamBΔtolCを用いて説明したが、プラットフォームは大腸菌の異なる株で発現した耐性遺伝子ライブラリー(脱複製)で使用することができる。型が異なる場合があります)最終的に、抗生物質耐性プラットフォームは柔軟性があり、多くのアプリケーションを持ち、他の脱複製方法よりも有利です。
再現性と非汚染の結果が得られるようにするには、適切な殺菌および無菌技術に従う必要があります。これを行わないと、ピン留めツール、ライブラリプレート、または脱複製プレート自体が汚染されます。選択可能なマーカーは大腸菌ライブラリーに存在しますが、これはマーカーを欠損した細菌による汚染を防ぐのに役立ちますが、同じマーカーを使用して株のクロスコンタミネーションを防ぐものではありません。このようなことが起こるリスクを減らすためには、ライブラリプレートからピン留めする前に、細菌のピン留めツールを慎重に殺菌することが不可欠です。各ライブラリ プレートは、新しいテンプレートを破棄する前に、最大 3~4 回だけピン留めする必要があります。これにより、ピラリープレートがピン留めプロセス中に汚染された場合、すべての脱複製プレートに汚染が広がるのを防ぐことができます。また、脱複製プレートを接種する際には抗生物質は使用されないため、6日間発酵させる前に汚染を防ぐには細心の注意が必要です。汚染のもう一つの可能な源は、脱複製プレートのMHB寒天オーバーレイにある。オーバーレイ媒体が汚染されている場合、成長は37°Cポストピンニングで一晩インキュベーションの後にのみ現れる。オーバーレイ汚染は、オーバーレイ表面上の大腸菌ライブラリの成長を分析することが非常に困難になる可能性があります。オーバーレイ汚染の可能性を減らすには、オーバーレイを注ぐ前にMHB寒天を新鮮に準備してください。個人がこの方法に慣れるまで、脱複製プレートは常に複製または三量化して準備し、1つのプレートが汚染された場合には、うまくいけばからデータを抽出できることをお勧めします。非汚染プレート。
最後に、ARP/MARP には制限があることに注意してください。このプロトコルは、複数の生理活性化合物を産生する産生株の脱複製には適していない。大腸菌ライブラリー内の各株は、単一の耐性遺伝子を発現するように設計されている。2つの抗生物質が生物によって産生される場合、どちらの抵抗遺伝子も第2の抗生物質に対する耐性を与えられず、それによって両方の株の細胞死をもたらす。したがって、この可能性は、複数の抗生物質の産生が現在の単一構成大腸菌ライブラリーでは検出できないため、新しい抗生物質の存在を示唆する場合に考慮する必要があります。複数の抗生物質を産生する株を複製する課題に対抗するために取ることができる1つのアプローチは、Cox etal.al.al.al.によって元のARP論文に記載されている寒天プラグ手順を使用することを含む。この方法では、発酵固体培地の一部をプレートを含む抗生物質生産者から除去し、指標ARP株の芝生上に置く。指標株は、ARPライブラリー内の耐性大腸菌株のいずれかでありうちでありうちです。阻害のゾーンは、ARP株と野生型株に対する産生株の生能を比較するために使用されます。野生型株と比較して減少したサイズの阻害ゾーンを形成するARP株は、産生される化合物に抵抗することができる。この方法は、複数の抗生物質を産生することができる株を同定するのに有効であることが証明されている10.
要約すると、ARP/MARPで複製を解除する際に最良の結果を得るために、複製プレートを複製または三極化して準備することをお勧めします。プロトコルの他の重要なステップは、新鮮なライブラリープレートからのピン留め(決して凍結しない)と膜除去段階の間に生産株からできるだけ多くのバイオマスを除去することです。必要な手順がすべて実行される場合は、2 週間の時間枠内で関心のある生産株のデプリケーション結果が正常に実行される必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
ARP/MARPに関するライトラボの研究は、オンタリオ州研究基金とカナダ保健研究所助成金(FRN-148463)によって支援されました。我々は、ARPライブラリの拡張と組織を支援したソマー・チョウを認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
