Summary
우리는 항생제의 복제를 위한 이소제닉 항생제 저항하는 대장균의 도서관을 이용하는 플랫폼을 기술합니다. 박테리아 또는 곰팡이에 의해 생성된 항생제의 정체성은 각각의 내성 유전자를 발현하는 대장균의 성장에 의해 추론될 수 있다. 이 플랫폼은 경제적으로 효과적이고 시간 효율적입니다.
Abstract
천연 물 추출물에서 새로운 항생제에 대 한 검색에 주요 과제 중 하나는 일반적인 화합물의 재발견. 이 문제를 해결하기 위해 알려진 화합물을 식별하는 프로세스인 복제 해제가 관심 있는 샘플에서 수행됩니다. 분석 분리와 질량 분석과 같은 복제 를 위한 방법은 시간이 많이 걸리고 리소스집약적입니다. 복제 를 개선하기 위해 항생제 내성 플랫폼 (ARP)을 개발했습니다. ARP는 대장균에 개별적으로 복제된 약 100개의 항생제 내성 유전자의 라이브러리입니다. 이 균주 수집은 항생제 복제를 위한 비용 효과적이고 허구적인 방법을 포함하여 많은 응용을 가지고 있습니다. 이 과정은 고체 배지를 포함하는 직사각형 페트리 접시의 표면에 항생제 생산 미생물의 발효를 수반하여 매체를 통해 이차 대사 산물의 분비 및 확산을 허용합니다. 6일 발효 기간 이후에 미생물 바이오매스를 제거하고, 얇은 한천 오버레이를 페트리 접시에 첨가하여 매끄러운 표면을 만들고 대장균 표시기 균주의 성장을 가능하게 한다. ARP 균주의 우리의 컬렉션은 다음 항생제 함유 페트리 접시의 표면에 고정된다. 플레이트는 오버레이의 표면에 대장균 성장을 허용하기 위해 밤새 배양된다. 특정 항생제 (또는 클래스)에 대한 내성을 포함하는 균주만이 이 표면에서 성장하여 생성된 화합물을 신속하게 식별할 수 있습니다. 이 방법은 알려진 항생제의 생산자의 식별및 새로운 화합물을 생산하는 사람들을 식별하는 수단으로 성공적으로 사용되었습니다.
Introduction
1928년 페니실린이 발견된 이래, 환경 미생물에서 유래한 천연물은 항균 화합물의 풍부한 공급원인 것으로 입증되었다1. 천연물 항생제의 약 80%는 연쇄상 구균 과 다른 액티노마이세테 속의 박테리아에서 유래하며, 나머지 20%는 곰팡이 종1에의해 생성됩니다. β-락탐, 테트라사이클린, 리파마이신 및 아미노글리코시드와 같은 클리닉에서 사용되는 가장 일반적인 항생제 스캐폴드 중 일부는 원래 미생물2로부터분리되었다. 그러나, 다중 약 저항하는 (MDR) 박테리아의 상승 때문에, 항생제의 우리의 현재 패널은 처리에 있는 보다 적게 효과적이되었습니다3,4. 이들은 "ESKAPE" 병원체 (즉, 반코마이신 내성 장구균 및 β-락탐 내성 황색포도상구균, Klebsiella pneumoniae, 슈도모나스 aeruginosa, 아신토박터 보만니,및 Enterobacter sp.), 이는 세계보건기구(WHO)3,4,5와같은 다수의 주요 공중 보건 당국에 의해 가장 높은 위험과 연관된 것으로 간주되는 박테리아의 하위 집합이다. 이 MDR 병원체의 출현 그리고 세계적인 퍼짐은 새로운 항생제3,4,5를위한 지속적인 필요 귀착됩니다. 유감스럽게도, 지난 2 년간은 미생물 근원에서 새로운 항생제의 발견이 점점 더 어렵다는 것을 보여주었습니다6. 약물 발견에 대한 현재의 접근법에는 천연물 추출물 라이브러리를 포함한 생리 활성 화합물의 높은 처리량 스크리닝이 포함되며, 주어진 시간에 수천 개의 추출물을 테스트 할 수 있습니다2. 그러나, 일단 항균 활성이 검출되면, 다음 단계는 활성 성분을 식별하고 공지된 또는 중복화합물을함유하는 것을 제거하기 위해 원유 추출물의 함량을 분석하는7,8이다. 복제를 복제라고 하는 이 프로세스는 알려진항생제7,9의재발견에 소요되는 시간을 방지 및/또는 현저하게 줄이는 데 필수적입니다. 천연물 신약 발견에 필요한 단계이지만, 복제 는 악명 높고 자원 집약적인 10입니다.
Beutler 등은 "복제"라는 용어를 처음 만든 이래로 알려진 항생제11,12의신속한 식별을 위한 혁신적인 전략을 개발하기 위한 광범위한 노력이 이루어졌습니다. 오늘날 복제에 사용되는 가장 일반적인 도구는 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 핵 자기 공명 기반 검출 방법11,13과같은 분석 크로마토그래피 시스템을 포함한다. 안타깝게도 이러한 각 방법은 값비싼 분석 장비와 정교한 데이터 해석을 사용해야 합니다.
전문장비 없이 도신속하게 수행할 수 있는 복제방법을 개발하기 위해 항생제 내성 플랫폼(ARP)10을구축하였다. ARP는 항생제 보조제의 발견, 알려진 내성 메커니즘에 대한 새로운 항생제 화합물의 프로파일링 및 액티노박테리아 및 기타 미생물에서 유래한 추출물에서 알려진 항생제의 복제에 사용될 수 있다. 여기에서는 항생제 복제에 대한 적용에 중점을 둡니다. ARP는 가장 일반적으로 재발견된 항생제14,15에대하여 효과적인 개별 저항 유전자를 발현하는 이소제닉 대장균 균주의 라이브러리를 이용한다. 대장균 라이브러리가 이차 대사산물 생산 유기체의 존재 내에서 성장될 때, 화합물의 정체성은 관련 저항 유전자10을발현하는 대장균 균주의 성장에 의해 추론될 수 있다. ARP가 처음 보고되었을 때, 도서관은 16개의 항생제 클래스에 저항성을 부여하는 >40 유전자로 구성되었습니다. 본래의 복제 템플릿은 복제 과정 동안 항생제 하위 클래스에 관한 정보를 제공하기 위해 항생제 클래스당 저항 유전자의 하위 집합을 포괄하도록 설계되었습니다. 오늘, ARP는 18개의 항생제 클래스에 저항을 부여하는 >90 유전자로 이루어져 있습니다. 저항 유전자의 우리의 광대한 컬렉션을 사용하여, 이차 복제 템플릿은 개발되고 최소한의 항생 저항 플랫폼으로 알려져 있다 (MARP). 이 템플릿은 유전자 중복성을 제거하고 단순히 복제 된 대사 산물과 관련된 일반적인 항생제 클래스에 관한 정보를 제공하기 위해 만들어졌습니다. 또한 MARP 템플릿은 ARP의 원래 화신과 비교하여 대장균 BW25113(대장균 BW25113 ΔbamBΔtolC)의야생 유형 및 과다 투과성 /유출 성 균주를 모두 보유하고 있습니다. 과다 투과성 변형을 활용합니다. 이 독특한 양상은 그람 음성 박테리아의 외부 막을 교차하는 화합물 능력을 나타내는, 복제 를 하는 동안 추가 표현형을 만듭니다. 여기서는 ARP 및/또는 MARP로 복제할 때 따라야 할 강력한 프로토콜을 설명하고 따라야 할 가장 중요한 단계를 강조 표시하고 다양한 가능한 결과를 논의합니다.
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Protocol
1. 대장균 도서관 글리세롤 주식 준비 (한천 슬랜트에서)
- ARP/MARP 대장균 균주를 리소제니 국물(LB)에서 LB 한천과 적절한 선택 가능한 마커를 함유하는 페트리 접시에 비스듬히 기울게한다(표 1).
- 단일 콜로니와 함께 적절한 선택 가능한 마커를 함유하는 LB의 3 mL을 접종하여 각 대장균 균주에 대한 배양을 준비한다. 폭기 (250 rpm)로 37 °C에서 하룻밤 성장.
- 배양 800 μL과 멸균 80% 글리세롤 200 μL을 1.8 mL 극저온으로 결합합니다. 튜브를 3-4회 반전시켜 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.
2. ARP / MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트 준비
- 섹션 1에서 제조된 글리세롤 스톡에서 LB 한천과 적절한 선택 가능한 마커를 포함하는 새로운 페트리 접시 세트에 ARP/MARP 균주를 줄무늬. 37 °C에서 하룻밤 성장.
- 무균 기술을 사용하여, 양이온의 피펫 500 μL은 멸균 저수지로부터 뮬러 힌튼 국물(MHB)을 멸균 된 96 개의 깊은 웰 플레이트의 각 우물로 조정하였다.
- 2.1단계에서 제조된 플레이트를 사용하여, ARP/MARP 맵에 따라 96개의 딥 웰 플레이트를 접종하기 위해 어플리케이터 스틱을 사용한다(보충도 1 및 보충 도 2). 각 웰에 적절한 선택 가능한 마커가 추가되었는지 확인합니다. 통기성이 좋은 밀봉 막을 깊은 웰 플레이트의 표면에 놓고 37°C(250 rpm)에서 밤새 배양합니다.
- ARP/MARP 맵을 참조하여 오염된 우물이 없는지 확인합니다. 오염된 경우 반복합니다. 멀티 채널 파이펫터를 사용하여, 깊은 웰 플레이트의 각 웰로부터 100 μL을 멸균 된 96 웰 라운드 바닥 판으로 옮김. 이 단계를 반복하여 고정된 스톡 라이브러리 플레이트를 여러 개 작성합니다.
참고: 냉동 재고 라이브러리 플레이트 오염의 경우 2.1-2.4 단계를 반복하지 않도록 한 번에 적어도 5 개의 라이브러리 플레이트를 준비하는 것이 가장 좋습니다. - 멸균 50% 글리세롤 100 μL을 각 우물에 파이펫팅하여 ARP/MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트를 만들고 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다.
- 멸균 알루미늄 씰로 플레이트를 덮고 각 우물이 개별적으로 밀봉되었는지 확인하십시오.
- 플레이트번호와 지정된 시간에 새 템플릿을 접종하기 위해 하나의 냉동 재고 라이브러리 플레이트만 바칩니다. 냉동 재고 라이브러리 플레이트 오염시 나머지를 백업으로 보관하십시오.
- 플레이트 뚜껑을 알루미늄 씰 위에 놓고 -80°C에 보관하십시오.
3. 종자 문화 및 복제 플레이트 준비
- 어플리케이터 스틱을 사용하여, 제조 균주와 함께 1개의 멸균 유리 비드(균사체를 분해하기 위해)를 포함하는 시험관에서 연쇄상 구균 항생제 배지(SAM) (또는 시험중인 유기체에 대한 다른 적절한 배지)의 3 mL을 접종합니다. 복제되지 않습니다. 연쇄상 구균의 경우 식민지 표면에서 포자를 부드럽게 긁어 냅니다.
- 동일한 나무 어플리케이터 스틱을 사용하여 베넷의 한천이 들어있는 페트리 접시에 멸균 컨트롤을 적용합니다.
- 종자 배양을 30°C에서 6일(250 rpm) 동안 배양하고 6일 동안 30°C에서 멸균 대조판을 배양한다.
참고: SAM 및 베넷의 미디어 레시피는 표 2를 참조하십시오. 위의 지침은 대부분의 actinomycetes에 적합합니다. 다른 박테리아와 곰 팡이에 대 한 필요에 따라 성장 매체를 변경. - 따뜻한 베넷의 한천 23mL를 세레큘러 피펫에 흡인하여 복제 플레이트를 준비하고 직사각형 페트리접시(재료 표)의표면을 가로질러 20 mL을 고르게 분배하고 나머지 배지를 파이펫에 남겨두는 것을 방지합니다. 기포 형성.
참고: 접시를 붓는 데 사용되는 표면이 수평인지 확인하고 한천이 너무 많이 냉각되기 전에이 단계를 수행해야합니다. 평평한 표면은 다음 단계에서 라이브러리 고정에 필수적입니다. - 중간 부분이 플레이트의 모든 영역을 덮을 때까지 플레이트를 부드럽게 돌리고 한천이 완전히 설정될 때까지 접시를 방해하지 마십시오.
- 시트가 복제플레이트의표면에 맞도록 직사각형 페트리 접시 뚜껑을 추적 템플릿으로 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 시트(재료 표)를 준비한다. 시트를 자르고 멸균 파우치에 오토 클레이브.
참고: 이 막은 유기체가 그것의 표면에 sporulated 수 있습니다., 보조 대사 산물 아래 매체로 배설 될 수 있습니다 하는 동안. 일단 성장하면, 멤브레인은 복제를 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위하여 제거됩니다. 멤브레인 용지가 베넷 의 한천 표면에 있는 것과 더 가까울수록 복제 를 더 깨끗하게 합니다. - 멸균 제어 판을 확인하여 6일 간의 배양 후 오염물질이 없는지 확인하십시오. 오염이 없는 경우, 직사각형 페트리 접시의 뚜껑을 제거하고 200 μL의 종자 배양체를 베넷의 한천 표면에 제거한다.
- 멸균 면봉을 사용하여 전체 플레이트의 표면에 균일하게 배양을 확산시다.
- 3.6단계에서 제조된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 페트리 접시의 표면에 배양 위에 놓는다. 멤브레인의 아래쪽 가장자리를 페트리 접시의 하단 가장자리에 정렬하여 시작하고 아래쪽 가장자리에서 플레이트의 위쪽 가장자리까지 멤브레인을 천천히 적용합니다.
- 멸균 면봉을 사용하여 멤브레인-한천 인터페이스 사이에 형성되었을 수 있는 기포를 매끄럽게 하여 막이 한천에 플러시되도록 합니다.
- 뚜껑을 다시 직사각형 페트리 접시에 올려 놓고 밀봉된 비닐 봉지에 거꾸로 놓습니다. 6 일 동안 30 °C에서 배양하십시오.
4. 복제 플레이트 MHB 오버레이 및 ARP / MARP 라이브러리 플레이트 준비
- 6일 후, 30°C 인큐베이터로부터 복제 플레이트를 제거한다. 멸균 핀셋(70% 에탄올로 철저히 토클라브 또는 분무)을 사용하여 베넷 의 한천 표면에서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다.
참고: 이 단계는 4.2 단계를 용이하게 하는 복제를 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 멤브레인의 표면상에서 자란 소수성 포자 및 균수를 제거할 것이다. - 3.4 단계에 대해 설명된 바와 같이, 작업 표면이 수평인지 확인하고 23 mL의 따뜻한 양이온 조정 MHB 한천을 흡인하기 위해 혈청학적 파이펫을 사용한다. 복제 플레이트 의 표면을 균일하게 분배하여 오버레이를 만들고, 나머지 배지를 파이펫에 남겨 두어 기포 형성을 방지합니다.
- 중간 부분이 모든 영역을 덮을 때까지 접시를 부드럽게 돌리고 한천이 완전히 설정될 때까지 접시를 방해하지 마십시오. 일단 냉각되고 고화되면, 복제 판을 밀봉된 비닐 봉지에 반납하고 밤새 4°C에서 거꾸로 보관하십시오.
참고: 이 단계는 발효 된 베넷의 배지에서 MHB 한천 오버레이로 이차 대사 산물의 확산을 허용합니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인이 제대로 제조되지 않은 경우 MHB 한천을 격퇴하는 소수성 특성을 가지는 플레이트의 가장자리 주위의 포자 성장이 있을 것이다. 오버레이의 오염을 초래할 수 있으므로 이러한 포자의 상단에 오버레이를 붓지 마십시오. - 오버레이가 부어지는 당일, 100 μL의 양이온을 피펫팅하여 96웰 플레이트의 각 웰에 MHB를 주입하여 신선한 ARP/MARP 템플릿을 접종합니다.
참고: 복제 중에 오염이 확산될 가능성을 줄이려면 단일 ARP/MARP 라이브러리 플레이트를 사용하여 2−3 복제 플레이트만 복제합니다. 따라서, 복제될 균주의 수에 따라 충분한 96웰 ARP/MARP 플레이트를 접종한다. - -80°C 냉동고에서 냉동 재고 ARP/MARP 라이브러리 플레이트를 꺼낸다. 응축이 시작되기 전에 알루미늄 씰을 제거하여 밑면에 형성되어 라이브러리 플레이트의 주변 우물을 오염시킬 가능성을 줄입니다.
- 멸균 96웰 고정 도구(또는 다른 형태의 접종 장비)를 사용하여 냉동 재고 ARP/MARP 라이브러리 플레이트에서 조심스럽게 고정하고 96웰이 함유된 신선한 MHB 함유 플레이트를 접종합니다. 복제 중 오염을 최소화하려면 라이브러리 플레이트당 2−3 복제 플레이트만 복제하는 데 필요한 ARP 또는 MARP 라이브러리 플레이트를 최대한 준비합니다. 각 플레이트를 접종하는 사이에 고정 도구를 살균합니다.
- 새로운 멸균 알루미늄 씰을 냉동 템플릿에 놓고 -80°C 냉동고로 되돌려 놓습니다. 밀봉된 비닐 봉지 내부에 접종된 96웰 플레이트를 넣고 37°C에서 폭기(250 rpm)를 18시간 동안 배양합니다.
참고: 오염이 없는지 확인한 후 이 단계에서 새로운 냉동 스톡 라이브러리 플레이트를 제조할 수 있습니다. 2.5단계에서 설명한 대로 -80°C에서 보관하기 전에 플레이트에 글리세롤을 첨가합니다.
5. ARP/MARP를 사용하여 복제 복제
- 인큐베이터에서 ARP/MARP 템플릿을 제거하고 오염 물질이 없는지 확인합니다. 냉동 된 스톡에서 직접 준비되지 않고 새로 준비된 템플릿을 사용하여 항상 복제를 제거합니다.
- 4°C에서 복제 플레이트를 제거하고 실온에 평형화하십시오. 결로가 있는 경우 뚜껑을 열고 멸균 된 환경에서 건조시키십시오.
- 멸균 고정 도구(또는 기타 접종 장비)를 사용하여 ARP/MARP 라이브러리 플레이트의 핀을 복제 플레이트의 MHB 한천 오버레이 표면에 고정합니다. 한천을 관통하지 않도록 주의하십시오. 각 복제 플레이트를 접종하는 사이에 고정 도구를 살균합니다.
- 복제 플레이트의 표면에 템플릿을 고정한 후 템플릿 접종을 3-5 분 동안 건조시키십시오. 접종 된 복제 판을 밀봉 된 비닐 봉지에 거꾸로 놓고 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
- 복제 플레이트의 성장을 ARP/MARP 맵에 해당하는 웰과 비교하여 다음 날 의 복제 결과를 분석합니다(표3 및 표 4).
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Representative Results
다음 결과는 관심의 항생제 생산 긴장의 집합이 ARP 및/또는 MARP를 사용하여 복제될 때 장악되었습니다.
ARP/MARP 복제 워크플로의 다이어그램은 그림 1에나와 있으며 라이브러리 플레이트 맵은 추가 그림 1 및 보충 그림 2에표시됩니다. 도 2는 환경 추출물 WAC 8921이 클로람페니콜 생산자로 확인되는 것을 통해 양성 복제 결과를 나타낸다. 도 3은 ARP 성장의 부족을 전적으로 나타내며, 이는 ARP/MARP 라이브러리 플레이트에서 고려되지 않은 알려지지 않은 항생제 또는 덜 일반적으로 발견되는 항생제의 존재를 나타낸다. 도 4는 야생형 대장균 BW25113 및 과다 투과성 및 유출성 돌연변이체 대장균 BW25113 ΔbamBΔ tolC의 활용으로 인해 MARP에 고유한 성장 패턴을 나타내고 있다. 이 결과는 그대로 외부 막을 능가 할 수없는 항균 활성화합물의 존재를 시사한다. 도 5는 고정 도구의 부적절한 살균을 암시하는 대장균 성장 패턴을 나타내고 도 6은 ARP/MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트 오염의 예를 나타낸다. 그림 7은 한천 오버레이가 복제 를 하는 동안 피어싱되는 경우 어떤 일이 발생하는지 보여 줍니다. 마지막으로, 도 8은 복제 프로세스 중에 발생할 수 있는 MHB 오버레이 관련 오염을 보여줍니다.
그림 1: 복제 해제 프로세스의 회로도입니다. 복제되는 생산 균주는 잔디로 직사각형 페트리 접시상에 줄무늬가 있고 니트로셀룰로오스 멤브레인이 상부에 배치된다. 플레이트는 6일 동안 배양되어 생산 균주 관련 바이오매스가 멤브레인 표면에서 자라면서 생산된 이차 대사산물이 페트리 접시 매체로 분비되는 것을 방지한다. 6일 발효 기간 후, 멤브레인이 제거되고 MHB 오버레이가 항생제 함유 매체의 표면에 첨가되어 고정을 위한 매끄러운 표면을 제공한다. ARP/MARP 맵에 따라 96웰 플레이트 형식으로 배열되는 ARP/MARP 대장균 라이브러리는 오버레이 표면에 고정됩니다. 트레이를 37°C에서 밤새 배양한 후, 특정 저항 유전자를 발현하는 대장균 균주의 성장은 생성된 화합물의 정체성을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 공지된 항생제의 복제. 제조 균주 WAC 8921은 ARP 템플릿을 사용하여 복제하였다. 대장균 BW25113 ΔbamBΔtolC pGDP1의 성장: MHB 한천 오버레이의 표면에CAT는 WAC 8921이 클로람페니콜 생산자임을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 알 수 없는 항생제의 복제. 제조 균주 WAC 9941은 ARP 템플릿을 사용하여 복제하였다. 대장균 라이브러리 성장의 부족은 직사각형 페트리 접시의 표면에서 보였으며, 이는 WAC 9441이 ARP에서 고려되지 않은 알려지지 않은 항균 화합물 또는 희귀 항생제를 생산하고 있음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 손상되지 않은 외부 막을 통과할 수 없는 항균 화합물의 식별. 제조 균주 WAC 4178은 MARP 템플릿을 사용하여 복제하였다. 대장균 BW25113의 균주는 이차 대사 산물 함유 매체의 표면에서 성장할 수 있는 반면, 대장균 BW25113 ΔbamBΔ톨C의 모든 균주는 성장할 수 없다. 이것은 WAC 4178이 손상되지 않은 외부 막을 통과할 수 없는 항균 화합물을 생산하고 있음을 시사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비멸균 고정 도구로 인한 오염. 제조 균주 WAC 7094는 ARP 템플릿을 사용하여 복제하였다. 할당된 대장균 균주가 없는 영역에서 대장균 라이브러리 성장의 존재는 직사각형 페트리 접시의 MHB 한천 오버레이를 접종하는 데 사용되는 고정 도구가 제대로 살균되지 않았음을 시사한다. 이것은 오버레이를 통해 알려지지 않은 대장균 균주의 전송을 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 오염된 냉동 재고 ARP/MARP 템플릿으로 인한 오염. 제조 균주 WAC 3683은 ARP 템플릿을 사용하여 복제하였다. 직사각형 페트리 접시 표면에서 성장한 세 가지 뚜렷한 대장균 식민지: 대장균 BW25113 ΔbamBΔtolC 발현 STAT, 스트렙토트리신 저항 효소, 대장균에 해당하는 다른 두 가지 BW25113 ΔbamBΔTOlC 발현 VIM-2ss,β-락탐 저항성 효소. 이러한 두 항생제 클래스 사이에 발생하는 것으로 알려진 교차 저항성의 부족 이외에, 복제 블라VIM2ss 식민지 성장의 부족으로 인해, 그것은 대장균 ΔbamBΔ 이외의 변형을 가정 할 수있다 tolC pGDP1: 블라VIM2ss는 각 냉동 라이브러리 플레이트에서 잘 성장하고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 피어싱 된 MHB 한천 오버레이. 제조 균주 WAC 5106은 ARP 템플릿을 사용하여 복제하였다. 이러한 균주는 대장균 BW25113 ΔbamBΔtolC pGDP3:aph(6)-Ia의 성장에 의해 지시된 바와 같이 스트렙토마이신 생산자인 것으로나타났다. 구멍은 플레이트의 둘레를 따라 MHB 한천 오버레이의 표면에서 볼 수 있습니다. 이는 복제 해제 결과에 영향을 주지 않지만 데이터를 언뜻 보기에 해석하기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: MHB 한천 오버레이의 오염. 오염된 MHB 한천은 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한 후 볼 수 있게 되는 오버레이의 표면에 불규칙한 성장 패턴을 생성한다. 대장균 성장은 여전히 오염을 통해 볼 수 있지만, 플레이트에서 데이터를 추정하기 전에 실험을 반복하는 것이 좋습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라스 미드 | 선택 가능한 마커 |
| pGDP1 | 카나마이신 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | 암피실린 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| 없음 | - |
표 1: pGDP 플라스미드 계열에 사용되는 선택 가능한 마커. ARP/MARP 대장균 균주를 LB 한천 페트리 접시에 줄무늬를 각 플라스미드에 적합한 농도로 적절한 선택 가능한 마커를 함유합니다.
| 미디어 | 성분 | 금액 |
| 샘 | 포도 당 | 15 g |
| 소야 펩톤 | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| 효모 추출물 | 1 g | |
| 카코3 | 1 g | |
| 글리세롤 | 2.5 mL | |
| ddH2O | 1L까지 | |
| 베넷의 | 감자 전분 | 10g |
| 카사미노산 | 2 g | |
| 효모 추출물 | 1.8 g | |
| 차펙 미네랄 믹스 | 2 mL | |
| 한천(선택 사항) | 15 g | |
| ddH2O | 1L까지 | |
| 차펙 미네랄 믹스 | KCl | 10g |
| MgSO4∙7H2O | 10g | |
| 나노3 | 12 g | |
| FeSO4∙7H2O | 0.2 g | |
| 농축 HCl | 200 μL | |
| ddH2O | 100 mL까지 |
표 2: SAM과 베넷의 미디어에 대한 조리법, 그리고 Czapek 미네랄 믹스. 오토클레이브 전에 SAM과 Bennett의 pH 를 pH 6.8로 조정하고 Czapek 미네랄 믹스를 살균하는 필터를 걸으세요.
| 항생제 클래스 | 항생제 | 저항 유전자 | 대장균 균주 | 웰 포지션 |
| 아미노글리코시드 | 연쇄상 구균 | 아프(3'')-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B3, G10 |
| 2- 데옥시스트렙타민 | rmtB | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F3, C10 | |
| 아프라마이신 | apmA | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C5, F8 | |
| 스펙티노마이신 | 아프(9)-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B5, G8 | |
| β 락탐 | 페니실린 | NDM-1 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B4, G9 |
| 세팔로스포린 | ||||
| 카르바페남 | ||||
| 린코사미드 | 린코사미드 | ermC | Δ밤BΔ톨C BW25113 | D4, E9 |
| 매크로 라이드 | 매크로 라이드 | ermC | ||
| B형 연쇄상 구균 | B형 연쇄상 구균 | ermC | ||
| 연쇄상 구균 A형 | 연쇄상 구균 A형 | vatD | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C3, F10 |
| 스트렙토트리신 | 스트렙토트리신 | 합계 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | D3, E10 |
| 테트라사이클린 | 테트라 사이클린 | 테트(A) | Δ밤BΔ톨C BW25113 | D5, E8 |
| 클로람페니콜스 | 클로람페니콜스 | 고양이 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | E4, D9 |
| 포스포마이신 | 포스포마이신 | fosA | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F6, C7 |
| 리파마이신스 | 리파마이신스 | 도착 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | E3, D10 |
| 폴리민신 | 폴리민신 | MCR-1 | 와일드 타입 BW25113 | C6, F7 |
| 에키노마이신 | 에키노마이신 | 우브라 (우브라 주) | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F4, C9 |
| 사이드로마이신 | 알보마이신 | 푸B 돌연변이 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C4, F9 |
| 결핵마이신 | 비오마이신 | vph | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F5, C8 |
| 해당/A | 해당/A | 해당/A | 와일드 타입 BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| 해당/A | 해당/A | 해당/A | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
표 3: 최소한의 ARP 균주에 대한 지정 테이블. 이 표는 최소 ARP 라이브러리 플레이트 맵에 따라 각각의 최소 ARP 균주를 찾을 수 있는 96웰 플레이트의 어느 웰을 나타냅니다. 표는 또한 각 유전자가 저항을 부여하는 항생제 클래스를 열거합니다. 몇몇 유전자는 주어진 항생제 부류 내의 하나 이상의 항생제에 저항을 부여할 수 있다는 것을 유의하십시오.
| 항생제 클래스 | 항생제 | 저항 유전자 | 대장균 균주 | 웰 포지션 |
| 아미노글리코시드 | 연쇄상 구균 | 아프(3'')-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B2, G11 |
| aph(6)-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C6, F7 | ||
| 스펙티노마이신 | 아프(9)-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A2, H11 | |
| 겐타미신 | aac(3)-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A3,H10 | |
| 개미 (2'')-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A5, H8 | ||
| aph(2'')-Id | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A6, H7 | ||
| aac(6')-아프(2'')-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B5, G8 | ||
| 카나마이신 | 아프(3')-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B4, G9 | |
| 아프(3')-일라 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B3, G10 | ||
| 히그로마이신 | 아프(4)-이아 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | B6, G7 | |
| β 락탐 | 아목시실린 | TEM-1 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F6, C7 |
| 세프타지디메 | CTX-M-15 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F5, C8 | |
| 옥사실린 (주) | 옥사-10 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | G5, B8 | |
| 옥사-48 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | H5, A8 | ||
| 메로페넴 | IMP-7ss | Δ밤BΔ톨C BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | H6, A7 | ||
| 이미페넴 | VIM-2 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | F4, C9 | |
| 린코사미드 | 린코사미드 | ermC | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C4, F9 |
| lnu(A) | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C5, F8 | ||
| 매크로 라이드 | 매크로 라이드 | ermC | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C4, F9 |
| mphA | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C2, F11 | ||
| B형 연쇄상 구균 | B형 연쇄상 구균 | ermC | Δ밤BΔ톨C BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | Δ밤BΔ톨C BW25113 | D4, E9 | ||
| 연쇄상 구균 A형 | 연쇄상 구균 A형 | vatD | Δ밤BΔ톨C BW25113 | D5, E8 |
| 스트렙토트리신 | 스트렙토트리신 | 합계 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | D3, E10 |
| 테트라사이클린 | 테트라 사이클린 | 테트(M) | Δ밤BΔ톨C BW25113 | E5, D8 |
| 클로람페니콜스 | 클로람페니콜스 | 고양이 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | E4, D9 |
| 포스포마이신 | 포스포마이신 | fosA | Δ밤BΔ톨C BW25113 | H4, A9 |
| 리파마이신스 | 리파마이신스 | 도착 | Δ밤BΔ톨C BW25113 | E3, D10 |
| 해당/A | 해당/A | 해당/A | Δ밤BΔ톨C BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
표 4: ARP 균주에 대한 지정 테이블. 이 표는 각 ARP 균주가 ARP 라이브러리 플레이트 맵에 따라 찾을 수 있는 96웰 플레이트의 어느 웰을 나타냅니다. 표는 또한 각 유전자가 저항을 부여하는 항생제 클래스를 열거합니다. 몇몇 유전자는 주어진 항생제 부류 내의 하나 이상의 항생제에 저항을 부여할 수 있다는 것을 유의하십시오.
보조 도 1: 원래 항생제 내성 플랫폼(ARP) 템플릿에 사용되는 라이브러리 플레이트 맵. 필요한 모든 컨트롤과 중복이 포함되어 있는지 확인하기 위해이 형식을 사용하여 96 웰 플레이트에서 각각의 대장균 균주를 구성합니다. 이 그림은 콕스 외10에서수정되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 2: 최소한의 항생제 내성 플랫폼(MARP) 템플릿에 사용되는 라이브러리 플레이트 맵. 필요한 모든 컨트롤과 중복이 포함되어 있는지 확인하기 위해이 형식을 사용하여 96 웰 플레이트에서 각각의 대장균 균주를 구성합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전술한 프로토콜은 그들의 활성을 구출하기 위해 기존 항생제와 함께 사용될 수 있는 신규한 항균 화합물 및 보조제의 발견 모두에 적용될 수 있다. 이 플랫폼은 내성 메커니즘과 동종 항생제의 높은 기질 특이성을 활용하여 원유 천연 물추출물 내에서 화합물을 복제합니다. 복제 플레이트를 준비하는 데 필요한 시간이 길지만(~2주), 복제 프로세스 자체는 단일 하룻밤 잠복기 후에 완료되며, 이는 분리및 특성화하는 데 걸리는 시간과 비교하여 빠를 수 있습니다. 원유 추출물에서 화합물. 또한 고가이거나 고도로 전문화된 장비가 필요하지 않으며, 이 플랫폼에 접근가능하고 비용 효율적입니다.
이 플랫폼의 또 다른 주요 이점은 유연성입니다. ARP는 더 많은 항생제 클래스를 포괄하는 저항 유전자를 포함하도록 확장될 수 있다. 이것은 새로운 저항 효소의 출현을 위한 문헌을 감시하고 대장균 도서관에 유전자를 추가하는 기본적인 분자 복제 기술을 사용하여 달성됩니다. 또한 복제 해제 템플릿은 복제 를 복제할 때 개인이 사용하려는 광범위하거나 좁은 범위기판 특이성의 원하는 수준에 따라 사용자 정의할 수 있습니다. 대장균 라이브러리에 있는 유전자의 어떤 조합든지 다른 단면도를 가진 화합물을 검출하는 기능을 가진 새로운 라이브러리 플레이트를 만들기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 대장균 템플릿을 발현하는 β-락타마제는 β-락탐및 그들의 상이한 서브클래스의 고도로 특이적인 분해를 허용하도록 개발될 수 있었다.
이 플랫폼은 처음에 고체 매체에 화합물을 복제하도록 설계되었지만 액체 매체에서도 작동합니다. 이 방법은 이미 정제된 화합물로 작업할 때 유용하며, 제한된 양만 테스트할 수 있으며, 고체 매체에서 쉽게 또는 일관되게 확산되지 않는 화합물로 작업할 때 유용합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 대장균 균주 BW25113 및 BW25113 ΔbamBΔtolC를 사용하여 기술되었지만, 플랫폼은 대장균의 상이한 균주에서 발현된 저항 유전자 라이브러리와 함께 사용될 수 있다(복제 표현형은 다를 수 있습니다). 궁극적으로, 항생 저항 플랫폼은 유연하고, 많은 응용을 가지고 있으며, 다른 복제 방법에 비해 유리하다.
재현 가능하고 오염되지 않은 결과를 얻으려면 적절한 살균 및 무균 기술을 따르는 것이 중요합니다. 이렇게 하지 않으면 고정 도구, 라이브러리 플레이트 또는 복제 플레이트 자체가 오염됩니다. 선택 가능한 마커는 대장균 라이브러리에 존재하지만, 이는 마커를 누락 된 박테리아에 의한 오염을 방지 할 수 있습니다, 그것은 동일한 마커를 사용하여 균주의 교차 오염을 방지하지 않습니다. 이러한 발생 의 위험을 줄이기 위해 라이브러리 플레이트에서 고정 하기 전에 세균 성 고정 도구를 신중 하 게 살 균 하는 것이 필수적이다. 각 라이브러리 플레이트는 새 템플릿을 버리기 전에 최대 3-4배에서만 고정해야 합니다. 이렇게 하면 고정 공정 중에 라이브러리 플레이트가 오염되는 경우 모든 복제 플레이트에 오염이 확산되는 것을 방지할 수 있습니다. 또한, 어떤 항생제는 복제 판을 접종 할 때 사용되지 않으며 그래서 6 일 동안 발효남아 있기 전에 오염을 방지하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 오염의 또 다른 가능한 근원은 복제 플레이트의 MHB 한천 오버레이에 있습니다. 오버레이 매체가 오염된 경우, 성장은 37°C 포스트 핀닝에서 하룻밤 배양 후에만 나타납니다. 오버레이 오염은 오버레이 표면에 있는 대장균 라이브러리의 성장을 분석하기가 매우 어려울 수 있습니다. 오버레이 오염가능성을 줄이려면 오버레이를 붓기 전에 MHB 한천을 신선하게 준비하십시오. 개인이이 방법에 익숙해질 때까지 복제 플레이트는 항상 중복 또는 삼중판으로 준비하여 한 판의 오염시 데이터를 여전히 희망에서 추출 할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 오염되지 않은 플레이트.
마지막으로 ARP/MARP에는 제한이 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 프로토콜은 하나 이상의 생리 활성 화합물을 생산하는 생산 균주의 탈복제에 적합하지 않습니다. 대장균 라이브러리의 각 균주는 단일 내성 유전자를 발현하도록 설계되었습니다. 2개의 항생제가 유기체에 의해 생성되는 경우에, 어느 저항 유전자도 두 번째 항생제에 저항을 부여하지 않을 것입니다, 그로 인하여 두 긴장의 세포 사멸의 결과로. 따라서, 이러한 가능성은 다중 항생제의 생산이 현재 단일 구조 인 대장균 라이브러리에 의해 검출될 수 없기 때문에 복제 결과가 새로운 항생제의 존재를 시사할 때 고려되어야 한다. 하나 이상의 항생제를 생산하는 변종 제거 균주의 도전에 대처하기 위해 취할 수있는 한 가지 방법은 Cox et al.10에의해 원래 ARP 논문에 기재된 한천 플러그 절차를 사용하는 것을 포함한다. 이 방법에서, 발효 된 고체 배지의 일부가 플레이트를 포함하는 항생제 생산자로부터 제거되고 지표 ARP 변형의 잔디상에 놓입니다. 표시기 변형은 ARP 라이브러리에서 내성 대장균 균주 중 어느 일 수 있습니다. 억제의 영역은 다음 ARP 균주 및 야생 형 변형에 대한 생산 균주의 생체 활성을 비교하는 데 사용됩니다. 야생형 균주에 비해 감소된 크기의 억제 영역을 형성하는 ARP 균주는 제조되는 화합물에 저항할 수 있다. 이 방법은 다중 항생제10를생성할 수 있는 긴장을 확인하는 데 효과적임이 입증되었습니다.
요약하자면, ARP/MARP로 복제를 복제할 때 최상의 결과를 얻으려면 복제 플레이트를 복제 또는 삼중으로 준비하는 것이 좋습니다. 프로토콜의 다른 중요한 단계는 신선한 라이브러리 플레이트에서 고정 (결코 동결) 멤브레인 제거 단계 동안 생산 균주에서 가능한 한 많은 바이오 매스를 제거. 필요한 모든 단계를 따르는 경우 2주 기간 내에 관심 있는 생산 변형에 대한 성공적인 복제 해제 결과가 있어야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
ARP/MARP에 관련 된 라이트 실험실에서 연구 온타리오 연구 기금 및 건강 연구 보조금의 캐나다 연구소에 의해 지원 되었다 (FRN-148463). 우리는 ARP 라이브러리의 확장 및 구성을 지원 한 Sommer Chou를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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