A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Мы описываем платформу, которая использует библиотеку изогенных устойчивых к антибиотикам Escherichia coli для дерепликации антибиотиков. Идентичность антибиотика, вырабатываемого бактериями или грибами, может быть выведена ростом кишечной палочки, выражающей свой ген резистентности. Эта платформа является экономически эффективной и действенной по времени.

Abstract

Одной из основных проблем в поиске новых антибиотиков из экстрактов натуральных продуктов является повторное открытие общих соединений. Для решения этой проблемы, dereplication, который является процесс идентификации известных соединений, осуществляется на образцах, представляющих интерес. Методы дерепликации, такие как аналитическое разделение с последующей масс-спектрометрией, отнимают много времени и ресурсоемки. Для улучшения процесса дерепликации мы разработали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP). ARP представляет собой библиотеку из примерно 100 генов устойчивости к антибиотикам, которые были индивидуально клонированы в кишечную палочку. Эта коллекция штаммов имеет много применений, в том числе экономически эффективный и поверхностный метод для антибиотиков dereplication. Этот процесс включает в себя брожение антибиотикопроизводящих микробов на поверхности прямоугольных блюд Петри, содержащих твердую среду, тем самым позволяя секрецию и диффузию вторичных метаболитов через среду. После 6-дневного периода брожения микробная биомасса удаляется, а в блюдо Петри добавляется тонкая агар-накладка, чтобы создать гладкую поверхность и обеспечить рост штаммов индикатора кишечной палочки. Наша коллекция штаммов ARP затем прикрепляется на поверхность антибиотикосодержащей чашки Петри. Пластина следующий инкубируется на ночь, чтобы обеспечить рост кишечной палочки на поверхности наложения. Только штаммы, содержащие устойчивость к конкретному антибиотику (или классу), растут на этой поверхности, что позволяет быстро идентифицировать произведенное соединение. Этот метод успешно используется для выявления производителей известных антибиотиков и в качестве средства для выявления лиц, производящих новые соединения.

Introduction

С момента открытия пенициллина в 1928 году натуральные продукты, полученные из экологических микроорганизмов, оказались богатым источником противомикробных соединений¹. Приблизительно 80% антибиотиков натурального продукта получены из бактерий рода Streptomyces и других актиномицетов, в то время как остальные 20% производится грибковых видов¹. Некоторые из наиболее распространенных антибиотиков леса, используемые в клинике, такие как к-лактамы, тетрациклины, рифамицины, и аминогликозиды, были первоначально изолированы от микробов². Однако, в связи с ростом бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наша текущая панель антибиотиков стала менее эффективной в лечении^3,4. К ним относятся патогенные микроорганизмы “ESKAPE” (т.е. ванкомицин-устойчивые энтерококки и лактам-резистентный золотистый стафилококк, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter sp.), которые являются подмножеством бактерий, которые считаются связанными с самым высоким риском ряда крупных органов общественного здравоохранения, таких как Всемирная организация здравоохранения^3,4,5. Появление и глобальное распространение этих патогенов МЛУ приводит к постоянной потребности в новых антибиотиках^3,4,5. К сожалению, последние два десятилетия показали, что открытие новых антибиотиков из микробных источников становится все труднее⁶. Текущие подходы к открытию наркотиков включают высокопроизводительный скрининг биологически активных соединений, включая библиотеки экстракта природного продукта, что позволяет проверить тысячи экстрактов в данный момент^2. Однако, как только антимикробная активность обнаружена, следующим шагом является анализ содержимого сырого экстракта для выявления активного компонента и устранения тех, которые содержат известные или избыточные соединения^7,8. Этот процесс, называемый дерепликцией, имеет жизненно важное значение для предотвращения и / или значительно сократить время, затрачиваемые на повторное открытие известных антибиотиков^7,9. Хотя необходимый шаг в открытии натуральных продуктов наркотиков, dereplication, как известно, трудоемким и ресурсоемким¹⁰.

С тех пор как Beutler et al. впервые придумалтермин “дерепликация”, были предприняты активные усилия по разработке инновационных стратегий для быстрого выявления известных антибиотиков^11,12. Сегодня наиболее распространенными инструментами, используемыми для дерепликации, являются аналитические хроматографические системы, такие как высокопроизводительная жидкая хроматография, масс-спектрометрия и методы обнаружения ядерного магнитного резонанса^11,13. К сожалению, каждый из этих методов требует использования дорогостоящего аналитического оборудования и сложной интерпретации данных.

В попытке разработать метод дерепликации, который может быть быстро выполнен без специализированного оборудования, мы создали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP)¹⁰. ARP может быть использован для открытия антибиотиков адъювантов, профилирование новых соединений антибиотиков против известных механизмов устойчивости, и dereplication известных антибиотиков в экстрактах, полученных из актинобактерий и других микробов. Здесь мы сосредоточимся на его применении в антибиотико-дерепликации. ARP использует библиотеку изогенных штаммов Escherichia coli, выражающих индивидуальные гены резистентности, которые эффективны против наиболее часто открываемых антибиотиков^14,15. Когда библиотека кишечной палочки выращивается в присутствии вторичного метаболита-производящего организма, идентичность соединения может быть выведена ростом штаммов кишечной палочки, которые выражают связанный с ним ген резистентности¹⁰. Когда ARP впервые было сообщено, библиотека состояла из генов, придающих устойчивость к 16 классам антибиотиков. Оригинальный шаблон дерепликации был разработан, чтобы охватить подмножество генов устойчивости в классе антибиотиков, чтобы предоставить информацию о подклассе антибиотиков в процессе дерепликации. Сегодня, ARP состоит из генов, которые дают устойчивость к 18 классам антибиотиков. Используя нашу обширную коллекцию генов резистентности, был разработан вторичный шаблон дерепликации, который известен как платформа минимальной устойчивости к антибиотикам (MARP). Этот шаблон был создан для устранения избыточности генов и просто предоставить информацию об общем классе антибиотиков, с которым связан дереплицированный метаболит. Кроме того, шаблон MARP обладает как диким типом, так и гиперпроницаемым/дефицитным штаммом E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ,bamB использует гиперпроницаемый штамм. Этот уникальный аспект создает дополнительные фенотипы во время дерепликации, указывая на способность соединений пересекать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий. Здесь мы описываем надежный протокол, которым следует следовать при дерепликации либо с ARP и/или MARP, очерчив наиболее важные шаги, которым следует следовать, и обсудим различные возможные результаты.

Protocol

1. Подготовка E. coli Библиотека Глицерол запасов (от Агар Сланц) Полоса ARP / MARP E. coli штаммов из лисогенного бульона (LB) агар наклоняется на Петри блюда, содержащие LB агар и соответствующий выбираемый маркер (Таблица 1). Подготовка культур для каждого из штаммов кишечной палочки путем прививки 3 мл LB, содержащий соответствующий выбираемый маркер с одной колонией. Выращивайте на ночь при 37 градусах Цельсия с аэрацией (250 об/мин). Смешайте 800 л культуры и 200 л стерильного 80% глицерола в кривиальной 1,8 мл. Смешайте, инвертируя трубки 3-4 раза, и храните при -80 градусов по Цельсию. 2. ARP/MARP Замороженные фондовые библиотеки плиты Подготовка Полоса штаммов ARP/MARP из запасов глицерола, приготовленного в разделе 1, на новый набор блюд Петри, содержащих агар LB и соответствующий выбираемый маркер. Расти на ночь при 37 градусах Цельсия. Используя асептический метод, пипетка 500 кл. катиона отрегулировала бульон Мюллера Хинтона (MHB) из стерильного резервуара в каждую скважину стерильной пластины 96 глубоких колодцев. С пластинами, подготовленными в шаге 2.1, используйте приклеить прививать 96 глубоких скважин пластины в соответствии с картой ARP / MARP (Дополнительная рисунок 1 и дополнительная рисунок 2). Убедитесь, что к каждой скважине добавляется соответствующий выбираемый маркер. Поместите дышащей уплотнительной мембраны над поверхностью глубокой пластины скважины и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию (250 об/мин). Убедитесь, что загрязненных скважин нет, ссылаясь на карту ARP/MARP. Повторите, если загрязнены. Используя многоканальный пипетктор, перенесите 100 л из каждой скважины глубокой пластины скважины в стерильную 96-хорошую круглую нижнюю пластину. Повторите этот шаг, чтобы создать несколько замороженных пластин библиотеки акций.ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего готовить не менее 5 библиотечных пластин одновременно, чтобы не повторять шаги 2.1-2.4 в случае загрязнения замороженными столами фондовой библиотеки. Закончите сделать ARP/MARP замороженные пластины фондовой библиотеки путем pipetting 100 злител стерильных 50% глицерола в каждый колодец и смешивать, мягко пипетки вверх и вниз. Накройте пластины стерильными алюминиевыми уплотнениями и убедитесь, что каждая скважина индивидуально запечатана. Номер пластин и посвятить только один замороженный фондовый библиотека пластины для прививки новых шаблонов в данный момент времени. Храните остаток в качестве резервных в случае загрязнения замороженных пластин библиотеки. Поместите крышку пластины на верхней части алюминиевой уплотнения и хранить при -80 градусах Цельсия. 3. Культура семян и подготовка плиты dereplication Использование аппликатора палку, прививать 3 мл streptomyces антибиотика среды (SAM) (или другой подходящей среды для организма тестируется) в пробирке, содержащей один стерильный стеклянный бусинка (для распада мицелия) с производством штамма, который должен быть дереплицируется. Для Streptomyces, аккуратно соскребать споры с поверхности колонии. Используя ту же деревянную палку аппликатора, полоса стерильности контроля на чашку Петри, содержащую агар Беннетта. Инкубировать семенную культуру при 30 градусах Цельсия с аэрацией в течение 6 дней (250 об/мин) и инкубировать плиту управления стерильностью при 30 градусах По Цельсию в течение 6 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице 2 для SAM и Беннетт СМИ рецепты. Вышеуказанные инструкции подходят для большинства актиномицетов. Изменяйте средства роста по мере необходимости для других бактерий и грибков. Подготовка дерепликации пластин, задавая 23 мл теплого агара Беннетта в серологический пипетка и распределять 20 мл равномерно по всей поверхности прямоугольной чашке Петри (Таблица материалов), оставляя остаток среды в пипетке, чтобы предотвратить образование воздушного пузыря.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что поверхность, используемая для заливки пластин, является ровной и выполните этот шаг до того, как агар остынет слишком сильно; плоская поверхность необходима для закрепления библиотеки на следующих этапах. Аккуратно поверните тарелку до тех пор, пока среда не покроет все участки пластины и не потревожьтесь ею до тех пор, пока агар не установит полностью. Подготовка нитроцеллюлозы мембранных листов (Таблица материалов) с помощью прямоугольной крышкой чашки Петри в качестве шаблона трассировки, так что листы соответствуют поверхности дерепликации пластины. Вырезать листы и автоклав их в стерильной сумке.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта мембрана позволяет организмам sporulate на своей поверхности, в то время как вторичные метаболиты могут быть выделены в среду ниже. После того, как выросли, мембрана удаляется, чтобы обеспечить чистую поверхность для дерепликации. Чем ближе мембранная бумага на поверхности агара Беннетта, тем чище результат дерепликации. Проверьте пластину контроля стерильности, чтобы убедиться, что никаких загрязняющих веществ не присутствуют после 6 дней инкубации. Если не заразиться, снимите крышку прямоугольной чашки Петри и пипетку 200 л культуры семян на поверхность агара Беннетта. Равномерно распределите культуру по всей пластине с помощью стерильного ватного тампона. Поместите мембрану нитроцеллюлозы, приготовленную в шаге 3.6 поверх культуры, на поверхность блюда Петри. Начните с выравнивания нижнего края мембраны к нижней кромке чашки Петри, и медленно нанесите мембрану от нижнего края к верхнему краю пластины. Используйте стерильный ватный тампон, чтобы сгладить любые пузырьки воздуха, которые могут образовываться между мембранно-агаринтерфейс, гарантируя, что мембрана заподлицо в агар. Положите крышку обратно на прямоугольную чашку Петри и поместите его вверх дном в запечатанный полиэтиленовый пакет. Инкубировать при 30 градусах По цельсию в течение 6 дней. 4. Dereplication плита MHB Наложение и ARP / MARP Библиотека плита Подготовка Через 6 дней снимите пластину дерепликации из инкубатора 30 градусов по Цельсию. Используя стерильные пинцеты (автоматически ежектизированные или тщательно распыляемые с 70% этанолом), тщательно удалите мембрану нитроцеллюлозы с поверхности агара Беннетта.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволит удалить гидрофобные споры и мицелии, выращенные на поверхности мембраны, чтобы обеспечить чистую поверхность для дерепликации, облегчая шаг 4.2. Как описано для шага 3.4, убедитесь, что рабочая поверхность является ровной и использовать серологический пипетка, чтобы аспирировать 23 мл теплого катиона скорректированного агара MHB. Создайте наложение, равномерно распределяя 20 мл по всей поверхности пластины дерепликации, оставляя остаток среды в пипетке, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Аккуратно поверните пластину до тех пор, пока среда не покроет все области и не потревожите ее до тех пор, пока агар не установит полностью. После охлаждения и затвердевания, вернуть дерепликционную пластину в запечатанный полиэтиленовый пакет и хранить его вверх по цене 4 градусов по Цельсию на ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет диффузии вторичных метаболитов из ферментированной среды Беннетта в НАкладку агара MHB. Если мембрана нитроцеллюлозы не была подготовлена должным образом будет спор роста по краям пластины, которые имеют гидрофобные свойства, которые отталкивают агар MHB. Не залить наложение на верхней части этих спор, поскольку это может привести к загрязнению наложения. В тот же день, когда накладывается накладка, привить свежий шаблон ARP/MARP путем пайпетации 100 зл.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить вероятность распространения загрязнения во время дерепликации, используйте одну библиотечную пластину ARP/MARP, чтобы девоцитировать только пластины дерепликации 2х3. Таким образом, привить достаточно 96-хорошо ARP / MARP пластин на основе количества штаммов, которые будут дереплицированы. Возьмите замороженные акции ARP / MARP библиотечной пластины из -80 qC морозильник. Удалите алюминиевую уплотнение до того, как конденсация начнет формироваться на его нижней стороне, тем самым уменьшая вероятность загрязнения соседних колодцев в библиотечной плите. Используя стерильные 96-колодство инструменты (или другие формы прививочного оборудования), тщательно прикрепите с замороженной пластины библиотеки ARP/MARP и прививите свежие пластины, содержащие MHB 96-колотые пластины. Чтобы свести к минимуму загрязнение во время дерепликации, подготовьте как можно больше библиотечных пластин ARP или MARP, чтобы девоцитировать только 2-3 пластины дерепликации на библиотечную пластину. Стерилизовать инструменты прикрепления между прививки каждой пластины. Положите новый стерильный алюминиевый уплотнение на замороженный шаблон после завершения и вернуть его в морозильную камеру -80 градусов. Поместите привитые 96-колодчатые пластины внутри запечатанного полиэтиленового пакета и инкубировать при 37 градусах Цельсия с аэрацией (250 об/мин) на 18 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Новые замороженные пластины фондовой библиотеки могут быть подготовлены с этого шага после обеспечения того, чтобы отсутствие загрязнения присутствует. Добавьте глицерол в тарелку перед хранением при -80 градусов по Цельсию, как описано в шаге 2.5. 5. Дерепликация с использованием ARP/MARP Удалите шаблон ARP/MARP из инкубатора и убедитесь, что загрязняющих веществ нет. Всегда dereplicate использованием шаблона, который недавно подготовлен, а не непосредственно из замороженных запасов. Удалите пластины дерепликации от 4 кв и дайте уравновесить до комнатной температуры. Если есть конденсация, откройте крышки и дайте высохнуть в стерильной среде. Используя стерильные инструменты крепления (или другое прививольное оборудование), прикрепите библиотечную пластину ARP/MARP на поверхность агара MHB, наложенную на пластины дерепликации. Будьте осторожны, чтобы не пробить агар. Стерилизовать прикрепляющие инструменты между прививками каждой пластины дерепликации. После прикрепления шаблона на поверхности пластин дерепликации, дайте шаблону инокулум высохнуть в течение 3-5 мин. Поместите привитые пластины дерепликации вверх дном в запечатанный полиэтиленовый пакет и инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия. Проанализируйте результаты дерепликации на следующий день, сравнив рост на пластине дерепликации с скважинами, которые соответствуют карте ARP/MARP(таблица 3 и таблица 4).

Representative Results

Следующие результаты были получены, когда коллекция антибиотикообразующих штаммов, представляющих интерес, была дереплицирована с помощью ARP и/или MARP. Диаграмма рабочего процесса dereplication ARP/MARP изображена на рисунке 1,а библиотечные карты пластины показан…

Discussion

Описанный выше протокол может применяться как к открытию новых противомикробных соединений, так и к адъювантам, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками для спасения их деятельности. Платформа использует высокую специфичность субстрата механизмов р?…

Materials

Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	–	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2