Summary
Мы описываем платформу, которая использует библиотеку изогенных устойчивых к антибиотикам Escherichia coli для дерепликации антибиотиков. Идентичность антибиотика, вырабатываемого бактериями или грибами, может быть выведена ростом кишечной палочки, выражающей свой ген резистентности. Эта платформа является экономически эффективной и действенной по времени.
Abstract
Одной из основных проблем в поиске новых антибиотиков из экстрактов натуральных продуктов является повторное открытие общих соединений. Для решения этой проблемы, dereplication, который является процесс идентификации известных соединений, осуществляется на образцах, представляющих интерес. Методы дерепликации, такие как аналитическое разделение с последующей масс-спектрометрией, отнимают много времени и ресурсоемки. Для улучшения процесса дерепликации мы разработали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP). ARP представляет собой библиотеку из примерно 100 генов устойчивости к антибиотикам, которые были индивидуально клонированы в кишечную палочку. Эта коллекция штаммов имеет много применений, в том числе экономически эффективный и поверхностный метод для антибиотиков dereplication. Этот процесс включает в себя брожение антибиотикопроизводящих микробов на поверхности прямоугольных блюд Петри, содержащих твердую среду, тем самым позволяя секрецию и диффузию вторичных метаболитов через среду. После 6-дневного периода брожения микробная биомасса удаляется, а в блюдо Петри добавляется тонкая агар-накладка, чтобы создать гладкую поверхность и обеспечить рост штаммов индикатора кишечной палочки. Наша коллекция штаммов ARP затем прикрепляется на поверхность антибиотикосодержащей чашки Петри. Пластина следующий инкубируется на ночь, чтобы обеспечить рост кишечной палочки на поверхности наложения. Только штаммы, содержащие устойчивость к конкретному антибиотику (или классу), растут на этой поверхности, что позволяет быстро идентифицировать произведенное соединение. Этот метод успешно используется для выявления производителей известных антибиотиков и в качестве средства для выявления лиц, производящих новые соединения.
Introduction
С момента открытия пенициллина в 1928 году натуральные продукты, полученные из экологических микроорганизмов, оказались богатым источником противомикробных соединений1. Приблизительно 80% антибиотиков натурального продукта получены из бактерий рода Streptomyces и других актиномицетов, в то время как остальные 20% производится грибковых видов1. Некоторые из наиболее распространенных антибиотиков леса, используемые в клинике, такие как к-лактамы, тетрациклины, рифамицины, и аминогликозиды, были первоначально изолированы от микробов2. Однако, в связи с ростом бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наша текущая панель антибиотиков стала менее эффективной в лечении3,4. К ним относятся патогенные микроорганизмы "ESKAPE" (т.е. ванкомицин-устойчивые энтерококки и лактам-резистентный золотистый стафилококк, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter sp.), которые являются подмножеством бактерий, которые считаются связанными с самым высоким риском ряда крупных органов общественного здравоохранения, таких как Всемирная организация здравоохранения3,4,5. Появление и глобальное распространение этих патогенов МЛУ приводит к постоянной потребности в новых антибиотиках3,4,5. К сожалению, последние два десятилетия показали, что открытие новых антибиотиков из микробных источников становится все труднее6. Текущие подходы к открытию наркотиков включают высокопроизводительный скрининг биологически активных соединений, включая библиотеки экстракта природного продукта, что позволяет проверить тысячи экстрактов в данный момент2. Однако, как только антимикробная активность обнаружена, следующим шагом является анализ содержимого сырого экстракта для выявления активного компонента и устранения тех, которые содержат известные или избыточные соединения7,8. Этот процесс, называемый дерепликцией, имеет жизненно важное значение для предотвращения и / или значительно сократить время, затрачиваемые на повторное открытие известных антибиотиков7,9. Хотя необходимый шаг в открытии натуральных продуктов наркотиков, dereplication, как известно, трудоемким и ресурсоемким10.
С тех пор как Beutler et al. впервые придумалтермин "дерепликация", были предприняты активные усилия по разработке инновационных стратегий для быстрого выявления известных антибиотиков11,12. Сегодня наиболее распространенными инструментами, используемыми для дерепликации, являются аналитические хроматографические системы, такие как высокопроизводительная жидкая хроматография, масс-спектрометрия и методы обнаружения ядерного магнитного резонанса11,13. К сожалению, каждый из этих методов требует использования дорогостоящего аналитического оборудования и сложной интерпретации данных.
В попытке разработать метод дерепликации, который может быть быстро выполнен без специализированного оборудования, мы создали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP)10. ARP может быть использован для открытия антибиотиков адъювантов, профилирование новых соединений антибиотиков против известных механизмов устойчивости, и dereplication известных антибиотиков в экстрактах, полученных из актинобактерий и других микробов. Здесь мы сосредоточимся на его применении в антибиотико-дерепликации. ARP использует библиотеку изогенных штаммов Escherichia coli, выражающих индивидуальные гены резистентности, которые эффективны против наиболее часто открываемых антибиотиков14,15. Когда библиотека кишечной палочки выращивается в присутствии вторичного метаболита-производящего организма, идентичность соединения может быть выведена ростом штаммов кишечной палочки, которые выражают связанный с ним ген резистентности10. Когда ARP впервые было сообщено, библиотека состояла из генов, придающих устойчивость к 16 классам антибиотиков. Оригинальный шаблон дерепликации был разработан, чтобы охватить подмножество генов устойчивости в классе антибиотиков, чтобы предоставить информацию о подклассе антибиотиков в процессе дерепликации. Сегодня, ARP состоит из генов, которые дают устойчивость к 18 классам антибиотиков. Используя нашу обширную коллекцию генов резистентности, был разработан вторичный шаблон дерепликации, который известен как платформа минимальной устойчивости к антибиотикам (MARP). Этот шаблон был создан для устранения избыточности генов и просто предоставить информацию об общем классе антибиотиков, с которым связан дереплицированный метаболит. Кроме того, шаблон MARP обладает как диким типом, так и гиперпроницаемым/дефицитным штаммом E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ,bamB использует гиперпроницаемый штамм. Этот уникальный аспект создает дополнительные фенотипы во время дерепликации, указывая на способность соединений пересекать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий. Здесь мы описываем надежный протокол, которым следует следовать при дерепликации либо с ARP и/или MARP, очерчив наиболее важные шаги, которым следует следовать, и обсудим различные возможные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка E. coli Библиотека Глицерол запасов (от Агар Сланц)
- Полоса ARP / MARP E. coli штаммов из лисогенного бульона (LB) агар наклоняется на Петри блюда, содержащие LB агар и соответствующий выбираемый маркер (Таблица 1).
- Подготовка культур для каждого из штаммов кишечной палочки путем прививки 3 мл LB, содержащий соответствующий выбираемый маркер с одной колонией. Выращивайте на ночь при 37 градусах Цельсия с аэрацией (250 об/мин).
- Смешайте 800 л культуры и 200 л стерильного 80% глицерола в кривиальной 1,8 мл. Смешайте, инвертируя трубки 3-4 раза, и храните при -80 градусов по Цельсию.
2. ARP/MARP Замороженные фондовые библиотеки плиты Подготовка
- Полоса штаммов ARP/MARP из запасов глицерола, приготовленного в разделе 1, на новый набор блюд Петри, содержащих агар LB и соответствующий выбираемый маркер. Расти на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Используя асептический метод, пипетка 500 кл. катиона отрегулировала бульон Мюллера Хинтона (MHB) из стерильного резервуара в каждую скважину стерильной пластины 96 глубоких колодцев.
- С пластинами, подготовленными в шаге 2.1, используйте приклеить прививать 96 глубоких скважин пластины в соответствии с картой ARP / MARP (Дополнительная рисунок 1 и дополнительная рисунок 2). Убедитесь, что к каждой скважине добавляется соответствующий выбираемый маркер. Поместите дышащей уплотнительной мембраны над поверхностью глубокой пластины скважины и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию (250 об/мин).
- Убедитесь, что загрязненных скважин нет, ссылаясь на карту ARP/MARP. Повторите, если загрязнены. Используя многоканальный пипетктор, перенесите 100 л из каждой скважины глубокой пластины скважины в стерильную 96-хорошую круглую нижнюю пластину. Повторите этот шаг, чтобы создать несколько замороженных пластин библиотеки акций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего готовить не менее 5 библиотечных пластин одновременно, чтобы не повторять шаги 2.1-2.4 в случае загрязнения замороженными столами фондовой библиотеки. - Закончите сделать ARP/MARP замороженные пластины фондовой библиотеки путем pipetting 100 злител стерильных 50% глицерола в каждый колодец и смешивать, мягко пипетки вверх и вниз.
- Накройте пластины стерильными алюминиевыми уплотнениями и убедитесь, что каждая скважина индивидуально запечатана.
- Номер пластин и посвятить только один замороженный фондовый библиотека пластины для прививки новых шаблонов в данный момент времени. Храните остаток в качестве резервных в случае загрязнения замороженных пластин библиотеки.
- Поместите крышку пластины на верхней части алюминиевой уплотнения и хранить при -80 градусах Цельсия.
3. Культура семян и подготовка плиты dereplication
- Использование аппликатора палку, прививать 3 мл streptomyces антибиотика среды (SAM) (или другой подходящей среды для организма тестируется) в пробирке, содержащей один стерильный стеклянный бусинка (для распада мицелия) с производством штамма, который должен быть дереплицируется. Для Streptomyces, аккуратно соскребать споры с поверхности колонии.
- Используя ту же деревянную палку аппликатора, полоса стерильности контроля на чашку Петри, содержащую агар Беннетта.
- Инкубировать семенную культуру при 30 градусах Цельсия с аэрацией в течение 6 дней (250 об/мин) и инкубировать плиту управления стерильностью при 30 градусах По Цельсию в течение 6 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице 2 для SAM и Беннетт СМИ рецепты. Вышеуказанные инструкции подходят для большинства актиномицетов. Изменяйте средства роста по мере необходимости для других бактерий и грибков. - Подготовка дерепликации пластин, задавая 23 мл теплого агара Беннетта в серологический пипетка и распределять 20 мл равномерно по всей поверхности прямоугольной чашке Петри (Таблица материалов), оставляя остаток среды в пипетке, чтобы предотвратить образование воздушного пузыря.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что поверхность, используемая для заливки пластин, является ровной и выполните этот шаг до того, как агар остынет слишком сильно; плоская поверхность необходима для закрепления библиотеки на следующих этапах. - Аккуратно поверните тарелку до тех пор, пока среда не покроет все участки пластины и не потревожьтесь ею до тех пор, пока агар не установит полностью.
- Подготовка нитроцеллюлозы мембранных листов (Таблица материалов) с помощью прямоугольной крышкой чашки Петри в качестве шаблона трассировки, так что листы соответствуют поверхности дерепликации пластины. Вырезать листы и автоклав их в стерильной сумке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта мембрана позволяет организмам sporulate на своей поверхности, в то время как вторичные метаболиты могут быть выделены в среду ниже. После того, как выросли, мембрана удаляется, чтобы обеспечить чистую поверхность для дерепликации. Чем ближе мембранная бумага на поверхности агара Беннетта, тем чище результат дерепликации. - Проверьте пластину контроля стерильности, чтобы убедиться, что никаких загрязняющих веществ не присутствуют после 6 дней инкубации. Если не заразиться, снимите крышку прямоугольной чашки Петри и пипетку 200 л культуры семян на поверхность агара Беннетта.
- Равномерно распределите культуру по всей пластине с помощью стерильного ватного тампона.
- Поместите мембрану нитроцеллюлозы, приготовленную в шаге 3.6 поверх культуры, на поверхность блюда Петри. Начните с выравнивания нижнего края мембраны к нижней кромке чашки Петри, и медленно нанесите мембрану от нижнего края к верхнему краю пластины.
- Используйте стерильный ватный тампон, чтобы сгладить любые пузырьки воздуха, которые могут образовываться между мембранно-агаринтерфейс, гарантируя, что мембрана заподлицо в агар.
- Положите крышку обратно на прямоугольную чашку Петри и поместите его вверх дном в запечатанный полиэтиленовый пакет. Инкубировать при 30 градусах По цельсию в течение 6 дней.
4. Dereplication плита MHB Наложение и ARP / MARP Библиотека плита Подготовка
- Через 6 дней снимите пластину дерепликации из инкубатора 30 градусов по Цельсию. Используя стерильные пинцеты (автоматически ежектизированные или тщательно распыляемые с 70% этанолом), тщательно удалите мембрану нитроцеллюлозы с поверхности агара Беннетта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволит удалить гидрофобные споры и мицелии, выращенные на поверхности мембраны, чтобы обеспечить чистую поверхность для дерепликации, облегчая шаг 4.2. - Как описано для шага 3.4, убедитесь, что рабочая поверхность является ровной и использовать серологический пипетка, чтобы аспирировать 23 мл теплого катиона скорректированного агара MHB. Создайте наложение, равномерно распределяя 20 мл по всей поверхности пластины дерепликации, оставляя остаток среды в пипетке, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
- Аккуратно поверните пластину до тех пор, пока среда не покроет все области и не потревожите ее до тех пор, пока агар не установит полностью. После охлаждения и затвердевания, вернуть дерепликционную пластину в запечатанный полиэтиленовый пакет и хранить его вверх по цене 4 градусов по Цельсию на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет диффузии вторичных метаболитов из ферментированной среды Беннетта в НАкладку агара MHB. Если мембрана нитроцеллюлозы не была подготовлена должным образом будет спор роста по краям пластины, которые имеют гидрофобные свойства, которые отталкивают агар MHB. Не залить наложение на верхней части этих спор, поскольку это может привести к загрязнению наложения. - В тот же день, когда накладывается накладка, привить свежий шаблон ARP/MARP путем пайпетации 100 зл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить вероятность распространения загрязнения во время дерепликации, используйте одну библиотечную пластину ARP/MARP, чтобы девоцитировать только пластины дерепликации 2х3. Таким образом, привить достаточно 96-хорошо ARP / MARP пластин на основе количества штаммов, которые будут дереплицированы. - Возьмите замороженные акции ARP / MARP библиотечной пластины из -80 qC морозильник. Удалите алюминиевую уплотнение до того, как конденсация начнет формироваться на его нижней стороне, тем самым уменьшая вероятность загрязнения соседних колодцев в библиотечной плите.
- Используя стерильные 96-колодство инструменты (или другие формы прививочного оборудования), тщательно прикрепите с замороженной пластины библиотеки ARP/MARP и прививите свежие пластины, содержащие MHB 96-колотые пластины. Чтобы свести к минимуму загрязнение во время дерепликации, подготовьте как можно больше библиотечных пластин ARP или MARP, чтобы девоцитировать только 2-3 пластины дерепликации на библиотечную пластину. Стерилизовать инструменты прикрепления между прививки каждой пластины.
- Положите новый стерильный алюминиевый уплотнение на замороженный шаблон после завершения и вернуть его в морозильную камеру -80 градусов. Поместите привитые 96-колодчатые пластины внутри запечатанного полиэтиленового пакета и инкубировать при 37 градусах Цельсия с аэрацией (250 об/мин) на 18 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Новые замороженные пластины фондовой библиотеки могут быть подготовлены с этого шага после обеспечения того, чтобы отсутствие загрязнения присутствует. Добавьте глицерол в тарелку перед хранением при -80 градусов по Цельсию, как описано в шаге 2.5.
5. Дерепликация с использованием ARP/MARP
- Удалите шаблон ARP/MARP из инкубатора и убедитесь, что загрязняющих веществ нет. Всегда dereplicate использованием шаблона, который недавно подготовлен, а не непосредственно из замороженных запасов.
- Удалите пластины дерепликации от 4 кв и дайте уравновесить до комнатной температуры. Если есть конденсация, откройте крышки и дайте высохнуть в стерильной среде.
- Используя стерильные инструменты крепления (или другое прививольное оборудование), прикрепите библиотечную пластину ARP/MARP на поверхность агара MHB, наложенную на пластины дерепликации. Будьте осторожны, чтобы не пробить агар. Стерилизовать прикрепляющие инструменты между прививками каждой пластины дерепликации.
- После прикрепления шаблона на поверхности пластин дерепликации, дайте шаблону инокулум высохнуть в течение 3-5 мин. Поместите привитые пластины дерепликации вверх дном в запечатанный полиэтиленовый пакет и инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Проанализируйте результаты дерепликации на следующий день, сравнив рост на пластине дерепликации с скважинами, которые соответствуют карте ARP/MARP(таблица 3 и таблица 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следующие результаты были получены, когда коллекция антибиотикообразующих штаммов, представляющих интерес, была дереплицирована с помощью ARP и/или MARP.
Диаграмма рабочего процесса dereplication ARP/MARP изображена на рисунке 1,а библиотечные карты пластины показаны на дополнительной рисунке 1 и дополнительной рисунке 2. Рисунок 2 демонстрирует положительный результат дерепликации, в котором экологический экстракт WAC 8921 идентифицируется как производитель хлорамфеникол. На рисунке 3 показан недостаток роста ARP полностью, что указывает на наличие либо неизвестного антибиотика, либо менее часто встречающегося антибиотика, который не учитывается в библиотечной пластине ARP/MARP. Рисунок 4 демонстрирует модель роста, которая является уникальной для MARP из-за его использования как дикий тип E. coli BW25113, так и гиперпроницаемого и эффлюксского недостаточного мутанта E. coli BW25113 иbamBstolC. Этот результат свидетельствует о наличии соединения с антимикробной активностью, которое не в состоянии превзойти нетронутую внешнюю мембрану. На рисунке 5 показана модель роста кишечной палочки, которая предполагает ненадлежащую стерилизацию инструментов прикрепления, а на рисунке 6 показан пример загрязнения замороженных пластин ARP/MARP. Рисунок 7 демонстрирует, что происходит, если агар наложение пронзили во время dereplication. Наконец, на рисунке 8 показано наложение MHB, связанное с загрязнением, которое может произойти в процессе дерепликации.
Рисунок 1: Схема процесса дерепликации. Производящ напряжение, котор нужно dereplicated streaked на прямоугольном тарелке Petri по мере того как лужайка и мембрана nitrocellulose помещена на верхней части. Пластина затем инкубируется в течение 6 дней, в котором производство-напряжение связанных биомассы растет на поверхности мембраны в то время как и вторичные метаболиты производятся выделяются в Петри блюдо средств массовой информации. После 6-дневного периода брожения мембрана удаляется и наложение MHB добавляется на поверхность антибиотикосодержащих носителей, чтобы обеспечить гладкую поверхность для закрепления. Библиотека ARP/MARP E. coli, которая расположена в 96-колодцном формате в соответствии с картами ARP/MARP, затем прикрепляется к поверхности наложения. После инкубации лотка на ночь при 37 градусах Цельсия, рост штаммов кишечной палочки, выражающих специфические гены сопротивления, указывает на идентичность производимого соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Дерепликация известного антибиотика. Производитель штамма WAC 8921 был дереплицирован с помощью шаблона ARP. Рост E. coli BW25113- bamB-tolC pGDP1:CAT на поверхности накладки агара MHB указывает на то, что WAC 8921 является производителем хлорамфеникол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дерепликация неизвестного антибиотика. Производитель штамма WAC 9941 был дереплицирован с помощью шаблона ARP. Отсутствие e. coli роста библиотеки было замечено на поверхности прямоугольной чашке Петри, что свидетельствует о том, что либо WAC 9441 производит неизвестное противомикробное соединение или редкий антибиотик, который не учитывается в ARP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Идентификация противомикробного соединения, которое не может пройти нетронутую внешнюю мембрану. Производитель штамма WAC 4178 был дереплицирован с помощью шаблона MARP. Штаммы E. coli BW25113 способны расти на поверхности вторичных метаболитсодержащих носителей, в то время как все штаммы E. coli BW25113 иbamBиtolC не могут расти. Это говорит о том, что WAC 4178 производит противомикробное соединение, которое не может пройти нетронутую внешнюю мембрану. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Загрязнение из-за нестерильных инструментов прикрепления. Производитель штамма WAC 7094 был дереплицирован с помощью шаблона ARP. Присутствие E. coli библиотеки роста в районах, которые не имеют назначенного штамма кишечной палочки свидетельствует о том, что прижимая инструменты, используемые для прививок MHB агар наложения прямоугольной чашке Петри не были должным образом стерилизованы. Это приводит к передаче неизвестных штаммов кишечной палочки через наложение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Загрязнение из-за загрязненного замороженного склада шаблона ARP/MARP. Производитель штамма WAC 3683 был дереплицирован с помощью шаблона ARP. Три различные колонии кишечной палочки выросли на прямоугольной поверхности блюда Петри: двесоответствуют E. coli BW25113 BW25113 -бамБитолк, выражающий VIM-2ss, фермент сопротивления в лактаме. Из-за отсутствия репликации блаVIM2ss колонии роста, в дополнение к отсутствию перекрестной резистентности, как известно, происходят между этими двумя классами антибиотиков, можно предположить, что штамм, кроме E. coli иbamB tolC pGDP1: blaVIM2ss растет в соответствующей замороженной библиотечной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Проколотая накладка агара MHB. Производитель штамма WAC 5106 был дереплицирован с помощью шаблона ARP. Этот штамм был признан производителем стрептомицина, о чем свидетельствует рост E. coli BW25113 иbamB-tolC pGDP3:aph (6)-Ia. Отверстия прокола можно увидеть на поверхности MHB агар наложения по периметру пластины. Хотя это не влияет на результаты дерепликции, это может сделать данные трудно интерпретировать на первый взгляд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Загрязнение накладки агара MHB. Загрязненный агар MHB создает нерегулярную модель роста на поверхности накладки, которая становится видимой после инкубации пластины на ночь при 37 градусах Цельсия. Хотя рост кишечной палочки все еще может быть виден через загрязнение, рекомендуется повторить эксперимент до экстраполирования данных из пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Плазмидные | Выбираемый маркер |
| pGDP1 | Канамицин 50 мкг/мл |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ампициллин 100 мкг/мл |
| pGDP4 | |
| Ни один | - |
Таблица 1: Выбираемые маркеры, используемые в серии плазмид pGDP. Полоса ARP / MARP E. coli штаммов на LB агар Петри блюда, содержащие соответствующий выбираемый маркер в нужной концентрации для каждого плазмиды.
| Носителя | Ингредиент | Сумма |
| Сэм | Глюкозы | 15 г |
| Соевый пептон | 15 г | |
| Nacl | 5 г | |
| Дрожжевой экстракт | 1 г | |
| Како3 | 1 г | |
| Глицерин | 2,5 мл л. | |
| ddH2O | До 1 л | |
| Беннетта | Картофельный крахмал | 10 г |
| Казамино кислоты | 2 г | |
| Дрожжевой экстракт | 1,8 г | |
| Цепек минеральная смесь | 2 мл | |
| Агар (по желанию) | 15 г | |
| ddH2O | До 1 л | |
| Цепек минеральная смесь | Kcl | 10 г |
| MgSO4No7H2O | 10 г | |
| NaNO3 | 12 г | |
| FeSO4No7H2O | 0,2 г | |
| Концентрированный HCl | 200 зл. | |
| ddH2O | До 100 мл |
Таблица 2: Рецепты для SAM и Беннетт СМИ, и Czapek минеральной смеси. Отрегулируйте SAM и Bennett до pH 6.8 перед autoclaving, и фильтр стерилизовать смесь минеральной смеси Czapek.
| Класс антибиотиков | Антибиотик | Ген сопротивления | Штамм кишечной палочки | Ну Позиция |
| Аминогликозиды | Стрептомицина | aph (3'')-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | B3, G10 |
| 2- Деоксистрептамин | rmtB | «БамБ»Толк BW25113 | F3, C10 | |
| Апрамицин | apmA | «БамБ»Толк BW25113 | C5, F8 | |
| Спектриномицин | aph (9)-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | B5, G8 | |
| к-лактам | Пенициллин | NDM-1 | «БамБ»Толк BW25113 | B4, G9 |
| Цефалоспорин | ||||
| Карбапенам | ||||
| Линкосамидес | Линкосамидес | ermC | «БамБ»Толк BW25113 | D4, E9 |
| Макролидов | Макролидов | ermC | ||
| Тип B Стрептограммы | Тип B Стрептограммы | ermC | ||
| Тип Стрептограммины типа А | Тип Стрептограммины типа А | vatD | «БамБ»Толк BW25113 | C3, F10 |
| Стрептотрицин | Стрептотрицин | Стат | «БамБ»Толк BW25113 | D3, E10 |
| Тетрациклины | Тетрациклин | tet (A) | «БамБ»Толк BW25113 | D5, E8 |
| Хлорамфениколы | Хлорамфениколы | Кошка | «БамБ»Толк BW25113 | E4, D9 |
| Фосфомицины | Фосфомицины | fosA | «БамБ»Толк BW25113 | F6, C7 |
| Рифамицины | Рифамицины | Arr | «БамБ»Толк BW25113 | E3, D10 |
| Полимиксины | Полимиксины | MCR-1 | дикого типа BW25113 | C6, F7 |
| Эхиномицины | Эхиномицины | uvrA | «БамБ»Толк BW25113 | F4, C9 |
| Сидромицины | Альбомицин | fhuB мутант | «БамБ»Толк BW25113 | C4, F9 |
| Тубератциномицины | Виомицин | Vph | «БамБ»Толк BW25113 | F5, C8 |
| N/A | N/A | N/A | дикого типа BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/A | N/A | N/A | «БамБ»Толк BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Таблица 3: Хорошо обозначение таблицы для минимальных штаммов ARP. Эта таблица показывает, какой колодец из 96-хорошо пластины, что каждый из минимальных штаммов ARP можно найти в соответствии с минимальной картой пластины библиотеки ARP. В таблице также перечислены, какие антибиотики класса каждого гена дает устойчивость. Обратите внимание, что некоторые гены могут давать устойчивость к более чем одному антибиотику в рамках данного класса антибиотиков.
| Класс антибиотиков | Антибиотик | Ген сопротивления | Штамм кишечной палочки | Ну Позиция |
| Аминогликозиды | Стрептомицина | aph (3'')-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | B2, G11 |
| aph (6)-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | C6,F7 | ||
| Спектриномицин | aph (9)-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | A2, H11 | |
| Гентамицин | aac (3)-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | A3,H10 | |
| муравей (2')-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | A5, H8 | ||
| aph (2'')-Id | «БамБ»Толк BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | «БамБ»Толк BW25113 | A6, H7 | ||
| aac (6')-aph (2'')-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | B5,G8 | ||
| Канамыцин | aph (3')-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | B4, G9 | |
| аф (3')-Илья | «БамБ»Толк BW25113 | B3, G10 | ||
| Гигромицин | aph (4)-Ia | «БамБ»Толк BW25113 | B6,G7 | |
| к-лактам | Амоксициллин | TEM-1 | «БамБ»Толк BW25113 | F6, C7 |
| Цефтазидим | CTX-M-15 | «БамБ»Толк BW25113 | F5, C8 | |
| Оксациллин | OXA-10 | «БамБ»Толк BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | «БамБ»Толк BW25113 | H5, A8 | ||
| Меропенем | IMP-7ss | «БамБ»Толк BW25113 | G4, B9 | |
| КЗК-2 | «БамБ»Толк BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | «БамБ»Толк BW25113 | H6, A7 | ||
| Имипенем | ВИМ-2 | «БамБ»Толк BW25113 | F4, C9 | |
| Линкосамидес | Линкосамидес | ermC | «БамБ»Толк BW25113 | C4, F9 |
| lnu (A) | «БамБ»Толк BW25113 | C5, F8 | ||
| Макролидов | Макролидов | ermC | «БамБ»Толк BW25113 | C4, F9 |
| mphA | «БамБ»Толк BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | «БамБ»Толк BW25113 | C2, F11 | ||
| Тип B Стрептограммы | Тип B Стрептограммы | ermC | «БамБ»Толк BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | «БамБ»Толк BW25113 | D4, E9 | ||
| Тип Стрептограммины типа А | Тип Стрептограммины типа А | vatD | «БамБ»Толк BW25113 | D5, E8 |
| Стрептотрицин | Стрептотрицин | Стат | «БамБ»Толк BW25113 | D3, E10 |
| Тетрациклины | Тетрациклин | тет (М) | «БамБ»Толк BW25113 | E5, D8 |
| Хлорамфениколы | Хлорамфениколы | Кошка | «БамБ»Толк BW25113 | E4, D9 |
| Фосфомицины | Фосфомицины | fosA | «БамБ»Толк BW25113 | H4, A9 |
| Рифамицины | Рифамицины | Arr | «БамБ»Толк BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | «БамБ»Толк BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Таблица 4: Хорошо обозначение таблицы для штаммов ARP. В этой таблице указывается, в какой скважине из 96 колодцей, в которой каждый из штаммов ARP можно найти в соответствии с картой библиотечных пластин ARP. В таблице также перечислены, какие антибиотики класса каждого гена дает устойчивость. Обратите внимание, что некоторые гены могут давать устойчивость к более чем одному антибиотику в рамках данного класса антибиотиков.
Дополнительная диаграмма 1: Библиотечная карта пластин, используемая для оригинального шаблона платформы устойчивости к антибиотикам (ARP). Организуйте соответствующие штаммы кишечной палочки в 96-хорошую пластину, используя этот формат, чтобы гарантировать, что все необходимые элементы управления и дубликаты включены. Эта цифра была изменена с Cox и др.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная диаграмма 2: Библиотечная карта пластин, используемая для шаблона платформы минимальной устойчивости к антибиотикам (MARP). Организуйте соответствующие штаммы кишечной палочки в 96-хорошую пластину, используя этот формат, чтобы гарантировать, что все необходимые элементы управления и дубликаты включены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный выше протокол может применяться как к открытию новых противомикробных соединений, так и к адъювантам, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками для спасения их деятельности. Платформа использует высокую специфичность субстрата механизмов резистентности и их cognate антибиотики, чтобы дереплицировать соединения в сырых экстрактов природного продукта. Несмотря на то, что время, необходимое для подготовки пластин дерепликации, является длительным (2 недели), сам процесс дерепликации завершается после одного ночного инкубационного периода, который является быстрым по сравнению с временем, которое может потребоваться для изоляции и характеристики соединения из сырого экстракта. Кроме того, не требуется дорогостоящее или узкоспециализированное оборудование, что делает эту платформу доступной и рентабельной.
Другим важным преимуществом этой платформы является ее гибкость. ARP может быть расширен, чтобы содержать гены резистентности, которые охватывают больше классов антибиотиков. Это достигается путем мониторинга литературы для появления новых ферментов сопротивления и с использованием основных методов молекулярного клонирования, чтобы добавить гены в библиотеку кишечной палочки. Кроме того, шаблон dereplication настраивается на основе желаемого уровня обширной или узкой специфичности субстрата диапазона, который человек хочет использовать при дерепликации. Любое сочетание генов в библиотеке кишечной палочки может быть использовано для изготовления новых библиотечных пластин с возможностью обнаружения соединений с различными профилями. Например, можно было бы разработать шаблон E. coli, выражающий e. coli, с тем чтобы обеспечить весьма специфическую дерепликцию лактамов и их различных подклассов.
Хотя эта платформа была первоначально разработана для дереплицитных соединений на твердых носителях, она также была работана в жидкостных носителях. Это полезно при работе с соединениями, которые уже были очищены в котором только ограниченное количество доступно для тестирования, или при работе с соединениями, которые не рассеиваются легко или последовательно в твердых носителях. Наконец, в то время как этот протокол был описан с использованием штаммов E. coli BW25113 и BW25113 фенотипы могут варьироваться). В конечном счете, Платформа устойчивости к антибиотикам является гибкой, имеет много применений и выгодна по сравнению с другими методами дерепликации.
Для обеспечения получения воспроизводимых и незагрязненных результатов крайне важно следовать соответствующим методам стерилизации и асептиков. Невыполнение этого требования приведет к загрязнению инструментов крепления, библиотечной пластины или самой пластины дерепликации. В то время как выбираемые маркеры присутствуют в библиотеке кишечной палочки, которые могут помочь предотвратить загрязнение, вызванное бактериями, отсутствующими маркером, это не предотвращает перекрестное загрязнение штаммов с помощью того же маркера. Чтобы уменьшить риск этого происходит важно тщательно стерилизовать бактериальные инструменты прикрепления перед закреплением из библиотечной пластины. Каждая библиотечная пластина должна быть закреплена только от 3-4 раз максимум, прежде чем отбрасывать для нового шаблона. Это предотвращает распространение загрязнения по всем пластинам дерепликации, если библиотечная пластина загрязнена в процессе закрепления. Кроме того, при прививке пластины дерепликации не используются антибиотики, и поэтому необходимо проявлять большую осторожность, чтобы предотвратить загрязнение, прежде чем его оставляют на брожение в течение шести дней. Другим возможным источником загрязнения является накладка агара MHB на пластину дерепликации. Если накладные носители загрязнены, рост будет появляться только после ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию после фиксации. Загрязнение наложением может чрезвычайно затруднить анализ роста библиотеки кишечной палочки на поверхности наложения. Чтобы уменьшить вероятность наложения загрязнения, подготовить MHB агар свежие перед заливкой наложения. Рекомендуется, чтобы до тех пор, пока человек не будет удовлетворен этим методом, пластины дерепликации всегда должны быть подготовлены в дублировать или тройную часть, чтобы в случае загрязнения одной пластины, данные все еще могут быть извлечены из мы надеемся незагрязненные пластины.
Наконец, важно отметить, что ARP/MARP имеет ограничения. Этот протокол не подходит для дерепликации производимых штаммов, которые производят более одного биоактивного соединения. Каждый штамм в библиотеке кишечной палочки был разработан, чтобы выразить один ген сопротивления. Если два антибиотика производятся организмом, ни один из генов устойчивости не придаст резистентности второму антибиотику, что приводит к гибели клеток обоих штаммов. Таким образом, эта возможность должна быть рассмотрена, когда результаты дерепликации свидетельствуют о наличии нового антибиотика, поскольку производство нескольких антибиотиков не может быть обнаружено в настоящее время одной библиотеки кишечной палочки. Один из подходов, которые могут быть приняты для борьбы с проблемой дерепликации штаммов, которые производят более одного антибиотика включает в себя использование агар-подключаемых процедур, описанных в оригинальной работе ARP Кокс и др.10. В этом методе часть ферментированной твердой среды удаляется из антибиотико-производителя, содержащего тарелку, и помещается на газон штамма Индикатора ARP. Штамм индикатора может быть любым из устойчивых штаммов кишечной палочки в библиотеке ARP. Зоны ингибирования затем используются для сравнения биоактивности производства штамма против штаммов АРП и штамма дикого типа. Штаммы ARP, которые образуют ингибирующую зону уменьшенного размера по сравнению с штаммом дикого типа, могут противостоять производимому составу. Этот метод доказал свою эффективность при выявлении штаммов, способных производить несколько антибиотиков10.
Таким образом, для получения наилучших результатов при дерепликации с ARP/MARP рекомендуется, чтобы пластины дерепликации были подготовлены в дубликате или тройном. Другие критические шаги в протоколе включают закрепление из свежей библиотечной пластины (никогда не замороженной) и удаление как можно больше биомассы из производства-напряжения на этапе удаления мембраны. Если все необходимые шаги будут выполнены, то в течение двух недель необходимо добиться успешных результатов дерепликации для получения нагрузки на интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Райта, относящиеся к ARP/MARP, были поддержаны Исследовательским фондом Онтарио и канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FRN-148463). Мы хотели бы поблагодарить Соммера Чоу за содействие в расширении и организации библиотеки ARP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
