Summary
Vi beskriver en plattform som använder ett bibliotek av isogena antibiotikaresistenta Escherichia coli för dereplication av antibiotika. Identiteten hos ett antibiotikum som produceras av bakterier eller svampar kan härledas genom tillväxten av E. coli som uttrycker dess respektive motstånds gen. Denna plattform är ekonomiskt effektiv och tidseffektiv.
Abstract
En av de största utmaningarna i sökandet efter nya antibiotika från naturliga produkt extrakt är återupptäckten av gemensamma föreningar. För att lösa denna utmaning, dereplication, som är processen för att identifiera kända föreningar, utförs på prover av intresse. Metoder för dereplication såsom analytisk separation följt av masspektrometri är tidskrävande och resurskrävande. För att förbättra dereplication processen har vi utvecklat antibiotikaresistens plattform (ARP). ARP är ett bibliotek med cirka 100 antibiotikaresistens gener som har varit individuellt klonade till Escherichia coli. Denna stam samling har många tillämpningar, inklusive en kostnadseffektiv och facile metod för antibiotika dereplication. Processen innebär jäsning av antibiotika-producerande mikrober på ytan av rektangulära petriskålar som innehåller fast medium, vilket möjliggör utsöndring och diffusion av sekundära metaboliter genom mediet. Efter en 6 dagars fermenterings period, den mikrobiella biomassan avlägsnas, och en tunn agar-overlay läggs till petriskål för att skapa en slät yta och möjliggöra tillväxt av E. coli indikatorn stammar. Vår samling av ARP stammar fästs sedan på ytan av antibiotikum som innehåller petriskål. Plattan är nästa inkuberas över natten för att möjliggöra E. coli tillväxt på ytan av överlägget. Endast stammar som innehåller resistens mot ett specifikt antibiotikum (eller klass) växer på denna yta vilket möjliggör snabb identifiering av den producerade substansen. Denna metod har använts med framgång för att identifiera tillverkare av kända antibiotika och som ett sätt att fastställa vilka som producerar nya föreningar.
Introduction
Sedan upptäckten av penicillin i 1928, naturliga produkter som härrör från miljömikroorganismer har visat sig vara en rik källa av antimikrobiella föreningar1. Cirka 80% av naturliga produkt antibiotika härrör från bakterier av släktet Streptomyces och andra actinomycetes, medan resterande 20% produceras av svamparter1. Några av de vanligaste antibiotiska ställningar som används på kliniken som β-lactams, tetracykliner, Rifamycins och aminoglykosider, var ursprungligen isolerade från mikrober2. Men på grund av uppkomsten av Multidrug resistenta (Mdr) bakterier, vår nuvarande panel av antibiotika har blivit mindre effektiv i behandling3,4. Dessa inkluderar "ESKAPE"-patogener (dvs. vankomycinresistenta enterokocker och β-laktamresistenta Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniioch Enterobacter SP.), som är en delmängd av bakterier som bedöms vara förknippade med den högsta risken av ett antal stora folkhälsomyndigheter som Världshälsoorganisationen3,4,5. Uppkomsten och den globala spridningen av dessa Mdr patogener resulterar i ett konstant behov av nya antibiotika3,4,5. Beklagligt nog har de senaste två decennierna visat att upptäckten av nya antibiotika från mikrobiella källor blir allt svårare6. Aktuella metoder för läkemedels upptäckt omfattar hög genomströmning screening av bioaktiva föreningar, inklusive naturliga produkter extrahera bibliotek, vilket gör att tusentals utdrag som ska testas vid en given tidpunkt2. Men när antimikrobiell aktivitet upptäcks, är nästa steg att analysera innehållet i rå extrakt för att identifiera den aktiva komponenten och eliminera de som innehåller kända eller överflödiga föreningar7,8. Denna process, kallad dereplication, är avgörande för att förhindra och/eller avsevärt minska den tid som ägnas åt återupptäckten av kända antibiotika7,9. Även om ett nödvändigt steg i naturliga produkt Drug discovery, dereplication är notoriskt mödosam och resurskrävande10.
Ända sedan Beutler et al. först myntade termen "dereplication", omfattande ansträngningar har gjorts för att utveckla innovativa strategier för snabb identifiering av kända antibiotika11,12. I dag omfattar de vanligaste verktygen för dereplication analytiska kromatografiska system såsom högpresterande vätskekromatografi, masspektrometri och nukleära magnetresonans-baserade detektionsmetoder11,13. Tyvärr, var och en av dessa metoder kräver användning av dyr analytisk utrustning och sofistikerad data tolkning.
I ett försök att utveckla en dereplication metod som snabbt kan utföras utan specialiserad utrustning, etablerade vi antibiotikaresistens plattform (ARP)10. ARP kan användas för upptäckten av antibiotika adjuvans, profilering av nya antibiotika föreningar mot kända resistensmekanismer, och dereplication av kända antibiotika i extrakt som härrör från Actinobacteria och andra mikrober. Här fokuserar vi på dess tillämpning i antibiotika dereplication. ARP använder ett bibliotek av isogena Escherichia coli -stammar som uttrycker individuella motstånds gener som är effektiva mot de vanligast återupptäckta antibiotika14,15. När e. coli biblioteket odlas i närvaro av en sekundär metabolitproducerande organism, identiteten hos föreningen kan härledas genom tillväxten av e. coli stammar som uttrycker dess associerade resistens gen10. När ARP rapporterades första gången bestod biblioteket av > 40 gener som ger resistens mot 16 antibiotika klasser. Den ursprungliga dereplication mallen utformades för att omfatta en delmängd av resistens gener per antibiotika klass för att ge information om antibiotika underklass under dereplication processen. Idag består ARP av > 90 gener som ger resistens mot 18 antibiotika klasser. Med hjälp av vår omfattande samling av resistensgener, en sekundär dereplication mall har utvecklats och är känd som den minimala antibiotikaresistens plattform (MARP). Denna mall skapades för att eliminera genredundans och att helt enkelt ge information om den allmänna antibiotika klass som en dereplicated metabolit är relaterat till. Dessutom, den MARP mallen besitter både vildtyp och en hyperpermeable/efflux bristfällig stam av e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δbambδTolc), jämfört med den ursprungliga inkarnationen av ARP, som endast utnyttjar den hyperpermeabla stammen. Denna unika aspekt skapar ytterligare fenotyper under dereplication, indikerar en föreningar förmåga att korsa det yttre membranet av gramnegativa bakterier. Här beskriver vi ett robust protokoll som ska följas vid borttagande av antingen ARP och/eller MARP, belysa de mest kritiska steg som ska följas, och diskutera de olika möjliga resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av E. coli bibliotek glycerol lager (från agar slants)
- Strimma ARP/MARP E. coli stammar från lysogeny buljong (lb) agar lutar på petriskålar som innehåller lb agar och lämplig valbar markör (tabell 1).
- Förbered kulturer för var och en av E. coli -stammar genom att vaccinera 3 ml lb som innehåller lämplig valbar markör med en enda koloni. Växa över natten vid 37 ° c med luftning (250 rpm).
- Kombinera 800 μL kultur och 200 μL steril 80% glycerol i en 1,8 mL cryovial. Blanda genom att invertera rören 3 − 4 gånger och förvara vid-80 ° c.
2. ARP/MARP fryst lager bibliotek tallrik förberedelse
- Strimma ARP/MARP stammar från glycerol lagren bereds i avsnitt 1 på en ny uppsättning petriskålar som innehåller LB agar och lämplig valbar markör. Växa över natten vid 37 ° c.
- Med aseptisk teknik, Pipettera 500 μL av cation justerade Mueller Hinton buljong (MHB) från en steril reservoar i varje brunn av en steril 96 djup brunn plattan.
- Med plattorna som bereds i steg 2,1, Använd en applikatorpinne för att Inokulera den 96 djupa brunnen plattan i enlighet med ARP/MARP kartan (kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2). Se till att lämplig valbar markör läggs till varje brunn. Placera ett tätnings membran som andas över ytan på den djupa brunnen plattan och inkubera över natten vid 37 ° c (250 rpm).
- Se till att det inte finns några förorenade brunnar genom att hänvisa till ARP/MARP-kartan. Upprepa vid nedsmutsad. Använd en multikanalpipettor och överför 100 μL från varje brunn på den djupa brunnen plattan till en steril 96-brunn rund bottenplatta. Upprepa det här steget för att skapa flera frysta lager biblioteks skyltar.
Anmärkning: Det är bäst att förbereda minst 5 biblioteks plattor åt gången för att hålla sig från att upprepa steg 2.1 − 2.4 i händelse av fryst lager bibliotek plåt förorening. - Avsluta tillverkningen av ARP/MARP frysta lager biblioteks plåtar genom att Pipettera 100 μL steril 50% glycerol i varje brunn och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ner.
- Täck plattorna med sterila aluminium tätningar och se till att varje brunn är individuellt förseglad.
- Numrera plattorna och ägna endast en fryst lager biblioteks skylt för att vaccinera nya mallar vid en given tidpunkt. Behåll återstoden som back-ups i händelse av fryst lager bibliotek plåt förorening.
- Placera plåt locket ovanpå aluminium tätningen och förvara vid-80 ° c.
3. UTSÄDESODLING och förberedelse av Dereplicationsplattan
- Använd en applikatorpinne och Inokulera 3 mL Streptomyces ANTIBIOTIKUM (SAM) (eller annat lämpligt medium för den organism som testas) i ett provrör som innehåller en steril glaspärla (för att bryta upp mycel) med den producerande stam som ska dereplicated. För Streptomyces, försiktigt skrapa sporer från ytan av en koloni.
- Med samma trä applikator pinne, strimma en sterilitet kontroll på en petriskål som innehåller Bennetts agar.
- Inkubera frö kulturen vid 30 ° c med luftning i 6 dagar (250 rpm) och inkubera den sterilitet kontrollplattan vid 30 ° c i 6 dagar.
Anmärkning: Se tabell 2 för Sam och Bennetts medie recept. Ovanstående instruktioner är lämpliga för de flesta aktinomyceter. Förändra tillväxtmedia som behövs för andra bakterier och svampar. - Förbered dereplication plattor av aspirera 23 mL varm Bennett ' s agar i en serologisk pipett och fördela 20 mL jämnt över ytan av en rektangulär petriskål (tabell över material), lämnar resten av mediet i pipetten för att förhindra luftbubbla bildas.
Anmärkning: Se till att ytan som används för att hälla plattorna är nivå och utföra detta steg innan agar har svalnat för mycket; en plan yta är absolut nödvändig för biblioteks låsning i nästa steg. - Rotera plattan försiktigt tills mediet täcker alla delar av plattan och stör den inte förrän agarsetet har ställts in helt.
- Förbered nitrocellulosa membran ark (tabell över material) med hjälp av en rektangulär petriskål som en spårningsmall så att arken passar ytan av dereplication plattan. Skär arken och autoklav dem i en steril påse.
Anmärkning: Detta membran gör det möjligt för organismer att sporulera på dess yta, medan sekundära metaboliter kan utsöndras i mediet nedan. En gång vuxit, membranet avlägsnas för att ge en ren yta för dereplication. Den närmare passform som membran papperet har på ytan av Bennett ' s agar, renare dereplication resultatet. - Kontrollera steriliteten kontrollplattan för att säkerställa att inga föroreningar är närvarande efter 6 dagar av inkubering. Om den är föroreningsfri, ta bort locket på den rektangulära petriskål och Pipettera 200 μL frö kultur på ytan av Bennetts agar.
- Jämnt sprida kulturen över ytan av hela plattan med hjälp av en steril bomullstuss.
- Placera nitrocellulosa membranet beredd i steg 3,6 över toppen av kulturen på ytan av petriskål. Börja med att rikta in den undre kanten av membranet till den nedre kanten av petriskål, och långsamt tillämpa membranet från nederkanten till den övre kanten av plattan.
- Använd en steril bomullspinne för att jämna ut eventuella luftbubblor som kan ha bildats mellan membran-agar-gränssnittet, vilket säkerställer att membranet är jäms med agar.
- Sätt tillbaka locket på den rektangulära petriskål och placera den upp och ner i en förseglad plastpåse. Inkubera vid 30 ° c i 6 dagar.
4. dereplication plattan MHB overlay och ARP/MARP bibliotek plåt förberedelse
- Efter 6 dagar, ta bort dereplication plattan från 30 ° c inkubator. Använd steril pincett (autoklaverat eller sprayat grundligt med 70% etanol), ta försiktigt bort nitrocellulosa membranet från ytan av Bennetts agar.
Anmärkning: Detta steg kommer att ta bort hydrofoba sporer och mycelia odlas på ytan av membranet för att ge en ren yta för dereplication, vilket underlättar steg 4,2. - Som beskrivits för steg 3,4, se till att arbetsytan är jämn och Använd en serologisk pipett för att aspirera 23 mL varm katjonjusterad MHB-agar. Skapa en överlagring genom att fördela 20 mL jämnt över ytan på dereplicationsplattan och lämna återstoden av mediet i pipetten för att förhindra luftbubbla bildning.
- Vrid försiktigt plattan tills mediet täcker alla områden och stör den inte förrän agarsetet har ställts in helt. När kyls och stelnat, returnera dereplication plattan till den förseglade plastpåsen och förvara den upp och upp vid 4 ° c över natten.
Anmärkning: Detta steg gör det möjligt för diffusion av sekundära metaboliter från den fermenterade Bennetts medium i MHB agar overlay. Om nitrocellulosa membranet inte var förberett på rätt sätt kommer det att finnas spor tillväxt runt kanterna på plattan, som har hydrofoba egenskaper som stöter bort MHB-agar. Häll inte överlagringen ovanpå dessa sporer eftersom det kan resultera i kontaminering av överlägget. - På samma dag som överlagringen hälls, Inokulera en ny ARP/MARP-mall genom att Pipettera 100 μL av katjonjusterade MHB i varje brunn på en 96-brunn-platta.
Anmärkning: För att minska risken för att smitta sprids under dereplication, Använd en enda ARP/MARP-biblioteksplattan till endast dereplicate 2 − 3 dereplication Plates. Därför, Inokulera tillräckligt 96-väl ARP/MARP plattor baserat på antalet stammar som kommer att vara dereplicated. - Ta den frusna lager ARP/MARP biblioteks plattan ur-80 ° c frysen. Ta bort aluminium tätningen innan kondensation börjar bildas på undersidan, vilket minskar risken för att kontaminera angränsande brunnar i biblioteks plattan.
- Använda sterila 96-väl fästa verktyg (eller andra former av inympning utrustning), försiktigt stift från den frusna beståndet ARP/MARP bibliotek plattan och Inokulera färska MHB-innehållande 96-well plattor. För att minimera kontaminering under dereplication, förbereda så många ARP eller MARP bibliotek plattor behövs för att endast dereplicate 2 − 3 dereplication tallrikar per biblioteks skylt. Sterilisera fästverktyg mellan vaccinera varje tallrik.
- Sätt en ny steril aluminium tätning på den frysta mallen när du är klar och returnera den till-80 ° c frys. Placera de inokulerade 96-brunnen plattorna inuti en förseglad plastpåse och inkubera vid 37 ° c med luftning (250 rpm) för 18 h.
Anmärkning: Nya frysta lager bibliotek plattor kan förberedas från detta steg efter att se till att ingen kontaminering är närvarande. Tillsätt glycerol till plattan före förvaring vid-80 ° c enligt beskrivningen i steg 2,5.
5. dereplicating med hjälp av ARP/MARP
- Ta bort ARP/MARP-mallen från inkubatorn och säkerställ att inga föroreningar finns. Alltid dereplicate med hjälp av en mall som är nyberedd och inte direkt från fryst lager.
- Ta bort dereplicationplattorna från 4 ° c och låt den jämbrera till rumstemperatur. Om det finns kondens, öppna locken och låt torka i en steril miljö.
- Med hjälp av sterila fästverktyg (eller annan inympnings utrustning), stift från ARP/MARP-biblioteksplattan på ytan av MHB-agar överlagring av dereplication plattorna. Var noga med att inte tränga igenom agar. Sterilisera fästverktyg i mellan vaccinera varje dereplication plattan.
- Efter att fästa mallen på ytan av dereplication plattorna, låt mallen inokulum torka i 3 − 5 min. Placera inokulerade dereplication plattorna upp och ner i en förseglad plastpåse och inkubera över natten vid 37 ° c.
- Analysera resultat av dereplication följande dag genom att jämföra tillväxten på dereplicationsplattan med brunnar som motsvarar ARP/MARP-kartan (tabell 3 och tabell 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande resultat erhölls när en samling av antibiotika-producerande stammar av intresse dereplicated med hjälp av ARP och/eller MARP.
Ett diagram över arbetsflödet för ARP/MARP-dereplication avbildas i figur 1, och biblioteks plattans kartor visas i kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2. Figur 2 visar ett positivt resultat av resultatet vari miljö extraktet wac 8921 identifieras som en kloramfenikol-producent. Figur 3 visar en brist på ARP-tillväxt helt, vilket indikerar närvaron av antingen en okänd antibiotika eller en mindre vanligt förekommande antibiotikum som inte redovisas i ARP/marp bibliotek plattan. Figur 4 visar ett tillväxtmönster som är unikt för marp på grund av dess utnyttjande av både vildtyp E. coli BW25113 och en hyperpermeabel och efflux bristfällig Mutant E. coli BW25113 δbambδTolc. Detta resultat tyder på närvaron av en förening med antimikrobiell aktivitet som inte kan överträffa ett intakt yttre membran. Figur 5 visar en E. coli tillväxtmönster som tyder på felaktig sterilisering av fästverktyg och figur 6 visar ett exempel på ARP/marp fryst lager bibliotek plåt förorening. Figur 7 visar vad som händer om agaröverlägget genomborras under dereplication. Slutligen visar figur 8 MHB overlay-relaterad kontaminering som kan inträffa under dereplicationsprocessen.
Figur 1: en schematisk process. Den producerande stam som skall dereplicated är Strimmig på en rektangulär petriskål som en gräsmatta och ett nitrocellulosa membran placeras ovanpå. Plattan är sedan inkuberas i 6 dagar där producera-stam relaterad biomassa växer på ytan av membranet medan och sekundära metaboliter som produceras utsöndras i petriskål. Efter en 6-dagars fermenterings period avlägsnas membranet och en MHB-överlagring läggs till på ytan av de antibiotikahaltiga medierna för att ge en slät yta för att fästa. ARP/MARP E. coli -biblioteket, som är ordnat i en 96-well plåtformat enligt ARP/Marp kartor, fästs sedan på ytan av överlägget. Efter inkuberande brickan över natten vid 37 ° c, tillväxten av E. coli stammar uttrycker specifika resistensgener indikerar identiteten hos den sammansatta produceras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dereplication av ett känt antibiotikum. Den producerande stammen WAC 8921 var dereplicated användande den ARP mallen. Tillväxt av E. coli BW25113 δbambδTolc PGDP1:Cat på ytan av mhb agar overlay indikerar att WAC 8921 är en kloramfenikol producent. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dereplication av ett okänt antibiotikum. Den producerande stammen WAC 9941 var dereplicated användande den ARP mallen. En brist på E. coli biblioteket tillväxt sågs på ytan av den rektangulära petriskål, vilket indikerar att antingen wac 9441 producerar en okänd antimikrobiell förening eller en sällsynt antibiotika som inte redovisas i ARP. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: identifiering av en antimikrobiell substans som inte kan passera ett intakt yttre membran. Den producerande stammen WAC 4178 var dereplicated användande den MARP mallen. Stammar av e. coli BW25113 är kapabla att växa på ytan av den sekundära metaboliten-innehållande media, medan alla stammar av e. coli BW25113 δbambδTolc inte kan växa. Detta tyder på att WAC 4178 producerar en antimikrobiell förening som inte kan passera ett intakt yttre membran. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kontaminering på grund av icke-sterila fästverktyg. Den producerande stammen WAC 7094 var dereplicated användande den ARP mallen. Närvaron av e. coli Library tillväxt i områden som inte hade en tilldelad e. coli -stam tyder på att de fästverktyg som används för att Inokulera MHB agar overlay av den rektangulära petriskål inte var korrekt steriliseras. Detta resulterar i överföring av okända E. coli stammar över överlägget. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: förorening på grund av ett förorenat fryst lager ARP/MARP mall. Den producerande stammen WAC 3683 var dereplicated användande den ARP mallen. Tre distinkta E. coli kolonier växte på den rektangulära petriskål skålen: två motsvarar e. coli BW25113 δbambδTolc uttrycker stat, ett streptothricin resistens enzym, och den andra motsvarar e. coli BW25113 δbambδTolc uttrycker vim-2SS, ett β-laktamresistens enzym. På grund av bristande replikering av blaVIM2ss Colony Growth, förutom bristen på korsresistens som förekommer mellan dessa två antibiotika klasser, kan man anta att en annan stam än E. coli δbambδ tolC pGDP1: blaVIM2ss växer i respektive frysta biblioteks plattan väl. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: överlagrad MHB-agar. Den producerande stammen WAC 5106 var dereplicated användande den ARP mallen. Denna stam befanns vara en streptomycin producent, vilket indikeras av tillväxten av E. coli BW25113 δbambδTolc pGDP3:APH (6)-IA. Punkteringshål kan ses på ytan av MHB agar overlay längs omkretsen av plattan. Även om detta inte påverkar resultatet av dereplication, kan det göra data svåra att tolka vid första anblicken. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: förorening av MHB-agar överlagring. Förorenad MHB-agar ger ett ojämnt tillväxtmönster på ytan av överlagringen som blir synlig efter inkuberande plattan över natten vid 37 ° c. Även om E. coli tillväxt kan fortfarande vara synlig genom kontaminering, det rekommenderas att upprepa experimentet innan extrapolering av data från plattan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Plasmiden | Valbar markör |
| pGDP1 | Kanamycin 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicillin 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| Ingen | - |
Tabell 1: valbara markörer som används i pGDP-plasmid-serien. Strimma ARP/MARP E. coli stammar på lb agar petriskålar som innehåller lämplig valbar markör vid rätt koncentration för varje plasmid.
| Media | Ingrediens | Belopp |
| Sam | Glukos | 15 g |
| Soja pepton | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| Jästextrakt | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glycerol | 2,5 mL | |
| ddH2O | Till 1 L | |
| Bennetts | Potatisstärkelse | 10 g |
| Casamino syror | 2 g | |
| Jästextrakt | 1,8 g | |
| Czapek mineral mix | 2 mL | |
| Agar (tillval) | 15 g | |
| ddH2O | Till 1 L | |
| Czapek mineral mix | KCl | 10 g |
| MgSO4∙ 7h2O | 10 g | |
| NaNO3 | 12 g | |
| FeSO4∙ 7h2O | 0,2 g | |
| Koncentrerad HCl | 200 μL | |
| ddH2O | Till 100 mL |
Tabell 2: recept för Sam och Bennetts media, och Czapek mineral mix. Justera SAM och Bennetts till pH 6,8 före autoklavering, och filter sterilisera Czapek mineral mix.
| Antibiotika klass | Antibiotika | Motstånds gen | E. coli-stam | Bra läge |
| Aminoglykosider | Streptomycin | APH (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-deoxystreptamin | rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycin | Förteckning | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | |
| Spektinomycin | APH (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | |
| β-lactams | Penicillin | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| Cefalosporin | ||||
| Karbapenam | ||||
| Linkosamider | Linkosamider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| Makrolider | Makrolider | ermC | ||
| Typ B Streptogramins | Typ B Streptogramins | ermC | ||
| Typ A Streptogramins | Typ A Streptogramins | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracykliner | Tetracyklin | tet (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Kloramfenikoler | Kloramfenikoler | Katt | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| Polymyxiner | Polymyxiner | MCR-1 | Wild-Type BW25113 | C6, F7 |
| Echinomycins | Echinomycins | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 |
| Sideromycins | Albomycin | fhuB Mutant | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Tuberactinomycins | Viomycin | VPH | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 |
| N/A | N/A | N/A | Wild-Type BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabell 3: väl betecknings tabell för de minimala ARP-stammarna. Denna tabell visar vilken brunn av en 96-brunn tallrik så pass var om minimal ARP stammar kanna bli grunda i Alt efter den minimal ARP bibliotek tallrik karta. Tabellen listar också vilken antibiotika klass varje gen ger resistens mot. Observera att vissa gener kan ge resistens mot mer än ett antibiotikum inom den givna antibiotika klassen.
| Antibiotika klass | Antibiotika | Motstånds gen | E. coli-stam | Bra läge |
| Aminoglykosider | Streptomycin | APH (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2, G11 |
| APH (6)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6, F7 | ||
| Spektinomycin | APH (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicin | AAC (3)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| Ant (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, H8 | ||
| APH (2 ' ')-ID | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6, H7 | ||
| AAC (6 ')-APH (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | ||
| Kanamycin | APH (3 ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| APH (3 ')-illa | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycin | APH (4)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6, G7 | |
| β-lactams | Amoxicillin | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidim | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacillin | OXA-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 | |
| Linkosamider | Linkosamider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| LNU (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Makrolider | Makrolider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| mphA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2, F11 | ||
| Typ B Streptogramins | Typ B Streptogramins | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| VGB | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| Typ A Streptogramins | Typ A Streptogramins | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracykliner | Tetracyklin | tet (M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5, D8 |
| Kloramfenikoler | Kloramfenikoler | Katt | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabell 4: väl beteckning tabell för ARP-stammar. Denna tabell visar vilken brunn av en 96-brunn tallrik så pass var om ARP stammar kanna bli grunda i Alt efter den ARP bibliotek tallrik karta. Tabellen listar också vilken antibiotika klass varje gen ger resistens mot. Observera att vissa gener kan ge resistens mot mer än ett antibiotikum inom den givna antibiotika klassen.
Kompletterande figur 1: biblioteks skylt karta används för den ursprungliga mallen för antibiotikaresistens plattform (ARP). Organisera respektive E. coli stammar i en 96-brunn plattan med hjälp av detta format för att säkerställa att alla nödvändiga kontroller och dubbletter ingår. Denna siffra har modifierats från Cox et al.10. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: biblioteks skylt karta som används för mallen minimal antibiotikaresistens plattform (MARP). Organisera respektive E. coli stammar i en 96-brunn plattan med hjälp av detta format för att säkerställa att alla nödvändiga kontroller och dubbletter ingår. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs ovan kan tillämpas på både upptäckten av nya antimikrobiella substanser och adjuvans som kan användas tillsammans med befintliga antibiotika för att rädda sin verksamhet. Plattformen utnyttjar den höga substrat specificiteten hos resistensmekanismer och deras besläktat antibiotika, för att dereplicate föreningar inom rå naturliga produkt extrakt. Även om den tid som krävs för dereplication plattor som skall förberedas är lång (~ 2 veckor), den dereplication processen i sig är klar efter en enda övernattning inkubationstid, som är snabb i jämförelse med den tid det kan ta att isolera och karakterisera en substans från råextrakt. Dessutom krävs ingen dyr eller högspecialiserad utrustning, vilket gör denna plattform tillgänglig och kostnadseffektiv.
En annan stor fördel med denna plattform är dess flexibilitet. ARP kan utökas till att innehålla resistensgener som omfattar fler antibiotika klasser. Detta uppnås genom att övervaka litteraturen för uppkomsten av nya resistensenzymer och använda grundläggande molekylära kloningstekniker för att lägga till generna i E. coli -biblioteket. Vidare, den dereplication mallen är anpassningsbar baserat på önskad nivå av breda eller smala intervall substrat specificitet som en individ vill använda när dereplicating. Varje kombination av gener i E. coli biblioteket kan användas för att göra nya biblioteks plattor med förmågan att upptäcka föreningar med olika profiler. Till exempel, en β-lactamas uttrycker E. coli mall kan utvecklas för att möjliggöra den mycket specifika dereplication av β-lactams och deras olika underklasser.
Även denna plattform var ursprungligen avsedd att dereplicate föreningar på fasta medier, det var också fungerar i flytande media. Detta är användbart när man arbetar med föreningar som redan har renats där endast en begränsad mängd är tillgänglig för testning, eller när man arbetar med föreningar som inte diffus lätt eller konsekvent i fasta medier. Slutligen, medan detta protokoll beskrevs med hjälp av e. coli -stammarna BW25113 och BW25113 δbambδTolc, kan plattformen användas med motstånds gen biblioteket uttryckt i olika stammar av E. coli (dereplication fenotyper kan variera). Ytterst, antibiotikaresistens plattformen är flexibel, har många tillämpningar, och är fördelaktigt framför andra dereplication metoder.
För att säkerställa att reproducerbara och icke-kontaminerade resultat erhålls, är det viktigt att följa lämpliga steriliserings-och aseptiska tekniker. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i kontaminering av fastlåsning verktyg, bibliotek plattan, eller dereplication plattan själv. Även valbara markörer finns i E. coli biblioteket, som kan bidra till att förhindra kontaminering orsakad av bakterier saknas markören, det hindrar inte korskontaminering av stammar som använder samma markör. För att minska risken för att detta händer är det viktigt att noggrant sterilisera de bakteriella fästverktygen innan du fäster från biblioteks plattan. Varje biblioteks skylt bör endast fästas från 3 − 4 gånger så mycket innan en ny mall kastas överbord. Detta förhindrar spridning av kontaminering över alla dereplication plattor om en biblioteks skylt blir förorenad under fastlåsning processen. Dessutom, ingen antibiotika används när vaccinera den dereplication plattan och så stor försiktighet måste iakttas för att förhindra kontaminering innan det lämnas att jäsa i sex dagar. En annan möjlig föroreningskälla finns i MHB-agaröverlagringen av dereplicationsplattan. Om Överlagrings mediet är förorenat kommer tillväxten endast att dyka upp efter nattininkuberingen vid 37 ° c efter fastlåsning. Overlay förorening kan göra det extremt svårt att analysera tillväxten av E. coli biblioteket på overlay ytan. För att minska risken för kontaminering av överlagringen, Förbered MHB-agar färska innan du häller överlagringen. Det rekommenderas att tills en individ är bekväm med denna metod, bör dereplication plattor alltid beredas i två eller tre exemplar så att i händelse av förorening av en tallrik, data kan fortfarande extraheras från den förhoppningsvis icke-kontaminerade plåtar.
Slutligen är det viktigt att notera att ARP/MARP har begränsningar. Detta protokoll lämpar sig inte för avduplicering av producerande stammar som producerar mer än en bioaktiv substans. Varje stam i E. coli -biblioteket har utformats för att uttrycka en enda motstånds gen. Om två antibiotika produceras av en organism, ingen motstånds gen kommer att ge resistens mot den andra antibiotikum, vilket resulterar i celldöd av båda stammarna. Sålunda, denna möjlighet måste övervägas när dereplication resultat tyder på förekomst av ett nytt antibiotikum eftersom produktionen av flera antibiotika inte kan upptäckas av den nuvarande enda konstruera E. coli bibliotek. En metod som kan vidtas för att bekämpa utmaningen att avleda stammar som producerar mer än ett antibiotikum innebär att använda agar-plugg förfarande som beskrivs i den ursprungliga ARP-papper av Cox et al.10. I denna metod avlägsnas en del av ett jästa fast medium från en antibiotikaproducent som innehåller platta och placeras på en gräsmatta med indikator ARP-stam. Indikatorn stammen kan vara någon av de resistenta E. coli stammar i ARP-biblioteket. Zoner för hämning används sedan för att jämföra bioaktiviteten hos en producerande-stam mot ARP-stammar och en vild-typ stam. ARP-stammar som bildar en hämmande zon av minskad storlek jämfört med vildtyp stammen kan motstå den förening som produceras. Denna metod har visat sig vara effektiva på att identifiera stammar som kan producera flera antibiotika10.
Sammanfattnings, för att uppnå bästa resultat när dereplicating med ARP/MARP rekommenderas att dereplication plattorna bereds i två eller tre exemplar. Andra kritiska steg i protokollet är att fästa från en ny biblioteks skylt (aldrig fryst) och ta bort så mycket biomassa som möjligt från den producerande stammen under membran borttagnings stadiet. Om alla nödvändiga åtgärder följs, bör man ha framgångsrika resultat av borttagande av en producerande stam av intresse inom en två veckors tidsram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning i Wright Lab som hänför sig till ARP/MARP stöddes av Ontarios forskningsfond och kanadensiska institut of Health Research Grant (FRN-148463). Vi skulle vilja erkänna Sommer Chou för att bistå i utbyggnaden och organisationen av ARP-biblioteket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
