Summary
Vi beskriver en platform, der udnytter et bibliotek af isogene antibiotikaresistente Escherichia coli til dereplication af antibiotika. Identiteten af et antibiotikum produceret af bakterier eller svampe kan udledes af væksten af E. coli udtrykker sin respektive resistens gen. Denne platform er økonomisk effektiv og tidsbesparende.
Abstract
En af de største udfordringer i søgningen efter nye antibiotika fra naturlige produkt ekstrakter er genopdagelsen af fælles forbindelser. For at imødegå denne udfordring udføres dereplication, som er processen med at identificere kendte forbindelser, på prøver af interesse. Metoder til dereplication såsom analytisk adskillelse efterfulgt af massespektrometri er tidskrævende og ressourcekrævende. For at forbedre dereplication proces, har vi udviklet antibiotikaresistens platform (ARP). ARP er et bibliotek med ca. 100 antibiotikaresistensgener, der er blevet individuelt klonet til Escherichia coli. Denne stamme samling har mange applikationer, herunder en omkostningseffektiv og facile metode til antibiotika dereplication. Processen involverer gæring af antibiotika-producerende mikrober på overfladen af rektangulære Petri skåle, der indeholder fast medium, hvilket giver mulighed for sekretion og diffusion af sekundære metabolitter gennem mediet. Efter en 6 dages fermenterings periode fjernes den mikrobielle biomasse, og der tilsættes en tynd agar-overlay til Petri skålen for at skabe en glat overflade og muliggøre væksten af E. coli -indikator stammerne. Vores samling af ARP stammer derefter fastgjort på overfladen af antibiotika-holdige Petri skål. Pladen er næste inkuberet natten for at tillade E. coli vækst på overfladen af overlay. Kun stammer, der indeholder resistens over for et bestemt antibiotikum (eller klasse), vokser på denne overflade, hvilket muliggør hurtig identifikation af det producerede stof. Denne metode er med held blevet anvendt til identifikation af producenter af kendte antibiotika og som et middel til at identificere dem, der producerer nye forbindelser.
Introduction
Siden opdagelsen af penicillin i 1928, naturlige produkter afledt af miljømæssige mikroorganismer har vist sig at være en rig kilde til antimikrobielle forbindelser1. Ca. 80% af natur produktets antibiotika stammer fra bakterier af slægten Streptomyces og andre actinomycetes, mens de resterende 20% produceres af svampearter1. Nogle af de mest almindelige antibiotika stilladser, der anvendes i klinikken, såsom β-lactams, tetracyclines, rifamyciner, og aminoglykosider, blev oprindeligt isoleret fra mikrober2. Men på grund af stigningen af multiresistente (mdr) bakterier, vores nuværende panel af antibiotika er blevet mindre effektiv i behandling3,4. Disse omfatter "ESKAPE"-patogener (dvs. vancomycin-resistente enterokokker og β-lactam-resistent Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniiog Enterobacter Sp.), som er en delmængde af bakterier, der anses for at være forbundet med den højeste risiko af en række store offentlige sundhedsmyndigheder som Verdenssundhedsorganisationen3,4,5. Fremkomsten og den globale udbredelse af disse mdr-patogener resulterer i et konstant behov for nye antibiotika3,4,5. Desværre har de sidste to årtier vist, at opdagelsen af nye antibiotika fra mikrobielle kilder bliver stadig vanskeligere6. De nuværende tilgange til Drug Discovery omfatter høj gennemløb screening af bioaktive forbindelser, herunder naturlige produkt ekstrakt biblioteker, giver mulighed for tusindvis af ekstrakter, der skal testes på et givet tidspunkt2. Men, når antimikrobiel aktivitet opdages, det næste skridt er at analysere indholdet af den rå ekstrakt til at identificere den aktive komponent og eliminere dem, der indeholder kendte eller overflødige forbindelser7,8. Denne proces, benævnt dereplication, er afgørende for at forebygge og/eller væsentligt reducere den tid, der bruges på re-opdagelse af kendte antibiotika7,9. Selv om et nødvendigt skridt i naturlige produkt Drug opdagelse, dereplication er notorisk omstændelig og ressourcekrævende10.
Lige siden Beutler et al. først opfundet udtrykket "dereplication", er der gjort en stor indsats for at udvikle innovative strategier for hurtig identifikation af kendte antibiotika11,12. I dag omfatter de mest almindeligt anvendte værktøjer til dereplication analytiske kromatografiske systemer såsom højtydende væskekromatografi, massespektrometri og nukleare magnet resonans baserede detekteringsmetoder11,13. Desværre, hver af disse metoder kræver brug af dyrt analytisk udstyr og sofistikeret data fortolkning.
I et forsøg på at udvikle en dereplication metode, der kan hurtigt udføres uden specialiseret udstyr, vi etablerede antibiotikaresistens platform (ARP)10. ARP kan bruges til opdagelsen af antibiotika adjuvanter, profilering af nye antibiotika forbindelser mod kendte resistensmekanismer, og dereplication af kendte antibiotika i ekstrakter afledt af aktinobakterier og andre mikrober. Her fokuserer vi på dets anvendelse i antibiotika-dereplication. ARP udnytter et bibliotek af isogene Escherichia coli stammer udtrykker individuelle resistensgener, der er effektive mod de mest almindeligt genfundne antibiotika14,15. Når e. coli -biblioteket dyrkes i nærværelse af en sekundær metabolit-producerende organisme, kan identiteten af forbindelsen udledes af væksten af e. coli -stammer, der udtrykker dens associerede resistens gen10. Da ARP først blev indberettet, bestod biblioteket af > 40 gener, som giver resistens over for 16 antibiotika klasser. Den oprindelige dereplication skabelon var designet til at omfatte en delmængde af resistensgener per antibiotika klasse til at give oplysninger om antibiotika under klasse under dereplication proces. I dag består ARP af > 90 gener, der giver resistens over for 18 antibiotika klasser. Ved hjælp af vores omfattende samling af resistensgener er der udviklet en sekundær dereplication-skabelon, som er kendt som den minimale antibiotikaresistens platform (MARP). Denne skabelon blev oprettet for at eliminere genredundans og blot give oplysninger om den generelle antibiotika klasse, som en dereplicated metabolit er relateret til. Derudover besidder marp-skabelonen både dværg og en hyperpermeabel/efflux mangelfuld stamme af e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δbambδTolc), sammenlignet med den oprindelige inkarnation af ARP, som kun udnytter den hyperpermeable stamme. Dette unikke aspekt skaber yderligere fænotyper under dereplication, hvilket indikerer en forbindelser evne til at krydse den ydre membran af gram-negative bakterier. Her beskriver vi en robust protokol, der skal følges, når dereplicating med enten ARP og/eller MARP, fremhæve de mest kritiske skridt, der skal følges, og diskutere de forskellige mulige resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af E. coli -bibliotekets glycerol bestande (fra agar-slants)
- Stribe ARP/marp E. coli stammer fra lysogeny bouillon (lb) agar skrå på Petri skåle, der indeholder lb agar og den passende valgbar markør (tabel 1).
- Forbered kulturer for hver af E. coli -stammerne ved at inokulere 3 ml lb indeholdende den passende valgbare markør med en enkelt koloni. Vokse natten over ved 37 °C med beluftning (250 rpm).
- Kombiner 800 μL kultur og 200 μL steril 80% glycerol i en 1,8 mL cryovial. Bland ved at invertere rørene 3 − 4 gange, og opbevar ved-80 °C.
2. ARP/MARP frosne Stock Library plade forberedelse
- Række ARP/MARP-stammerne fra glycerolbestandene, der er fremstillet i punkt 1, på et nyt sæt Petri skåle indeholdende LB-agar og den passende selektable markør. Vokse natten over ved 37 °C.
- Ved hjælp af aseptisk teknik, pipette 500 μL kation justeret Mueller Hinton bouillon (MHB) fra et sterilt reservoir i hver brønd af en steril 96 dyb brønd plade.
- Med pladerne fremstillet i trin 2,1 skal du bruge en applikator stick til at inokulere 96 Deep Well Plate i overensstemmelse med ARP/MARP-kortet (supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Sørg for, at den passende valgbare markør tilføjes til hver brønd. Anbring en åndbar tætnings membran over overfladen af den dybe brønd plade, og Inkuber om natten ved 37 °C (250 rpm).
- Sørg for, at der ikke er forurenede brønde ved at referere til ARP/MARP-kortet. Gentag hvis forurenet. Brug en multi-kanal pipettor, Overfør 100 μL fra hver brønd af den dybe brønd plade til en steril 96-godt rundt bundplade. Gentag dette trin for at oprette flere frosne Stock Library plader.
Bemærk: Det er bedst at forberede mindst 5 Biblioteks plader ad gangen for at holde sig fra at gentage trin 2.1 − 2.4 i tilfælde af frosset bestand Biblioteks plade forurening. - Færdiggøre ARP/MARP frosne Stock Library plader ved pipettering 100 μL steril 50% glycerol i hver brønd og bland ved forsigtigt pipettering op og ned.
- Dæk pladerne med sterile aluminiums tætninger og sørg for, at hver brønd er individuelt forseglet.
- Nummerpladerne og dedikere kun én frosset bestand Biblioteks plade til pode nye skabeloner på et givet tidspunkt. Opbevar resten som back-ups i tilfælde af frosset bestand bibliotek plade forurening.
- Anbring plade låget oven på aluminiums tætningen og opbevar ved-80 °C.
3. frøkultur og Dereplication plade forberedelse
- Ved hjælp af en applikator stick, inokulere 3 mL Streptomyces antibiotikum medium (Sam) (eller andet passende medium for den organisme, der testes) i et reagensglas indeholdende en steril glasperle (til at nedbryde mycelium) med den producerende stamme, der skal dereplicated. For Streptomyces, forsigtigt skrabe sporer fra overfladen af en koloni.
- Brug den samme træ applikator stick, streak en sterilitet kontrol på en Petri skål indeholdende Bennetts agar.
- Frøkulturen inkubates ved 30 °C med luftning i 6 dage (250 rpm), og sterilitetskontrol pladen inkubates ved 30 °C i 6 dage.
Bemærk: Se tabel 2 for Sam og Bennetts medie opskrifter. Ovenstående anvisninger er velegnede til de fleste actinomycetes. Ændre vækstmedier som nødvendigt for andre bakterier og svampe. - Der fremstilles dereplications plader ved at aspirere 23 mL varm Bennetts agar til en serologisk pipette og dispensere 20 mL jævnt over overfladen af en rektangulær Petri skål (tabel over materialer), hvorved resten af mediet i pipetten undgås luftboble dannelse.
Bemærk: Sørg for, at overfladen anvendes til at hælde plader er niveau og udføre dette trin, før agar har afkølet for meget; en flad overflade er bydende nødvendigt for bibliotek fastgørelse i de næste etaper. - Drej forsigtigt pladen, indtil mediet dækker alle dele af pladen, og forstyr det ikke, før agar er helt indstillet.
- Forbered nitrocellulose membran plader (tabel over materialer) ved hjælp af en rektangulær Petri skål låg som en Tracing skabelon, således at arkene passer til overfladen af dereplication pladen. Skær arkene og autoklave dem i en steril pose.
Bemærk: Denne membran giver mulighed for organismer at sporulere på sin overflade, mens sekundære metabolitter kan udskilles i mediet nedenfor. Når den er vokset, er membranen fjernet for at give en ren overflade til dereplication. Den tættere pasform, som membranen papiret har på overfladen af Bennetts agar, renere dereplication resultat. - Kontroller, at sterilitetskontrol pladen ikke er til stede efter 6 dages inkubation. Hvis kontamineringen er fri, fjernes låget på den rektangulære Petri skål, og 200 μL af frøkulturen afpipetteres på overfladen af Bennetts agar.
- Jævnt sprede kulturen på tværs af hele pladens overflade ved hjælp af en steril vatpind.
- Læg nitrocellulose membranen, som er fremstillet i trin 3,6 over toppen af kulturen på overfladen af Petri skålen. Begynd med at justere membranens nederste kant til den nederste kant af Petri skålen, og Anvend langsomt membranen fra den nederste kant til pladens øverste kant.
- Brug en steril vatpind til at udglatte eventuelle luftbobler, der kan være dannet mellem membran-agar-grænsefladen, og som sikrer, at membranen flugter med agar.
- Sæt låget tilbage på den rektangulære Petri skål og Placer det på hovedet i en forseglet plastikpose. Inkuber ved 30 °C i 6 dage.
4. dereplication Plate MHB overlay og ARP/MARP bibliotek plade forberedelse
- Efter 6 dage fjernes dereplicationpladen fra 30 °C-inkubator. Brug steril pincet (autoklave eller sprøjtet grundigt med 70% ethanol), Fjern forsigtigt nitrocellulose membranen fra overfladen af Bennetts agar.
Bemærk: Dette trin vil fjerne hydrofobe sporer og mycelier dyrket på overfladen af membranen for at give en ren overflade til dereplication, lette trin 4,2. - Som beskrevet i trin 3,4 skal du sikre, at arbejdsoverfladen er i niveau, og bruge en serologisk pipette til at indsugning 23 mL varm kation justeret MHB-agar. Opret en overlejring ved at dispensere 20 mL jævnt hen over overfladen af dereplicationpladen, og Efterlad resten af mediet i pipetten for at forhindre luftbobler dannelse.
- Drej forsigtigt pladen, indtil mediet dækker alle områder, og forstyr det ikke, før agar er helt indstillet. Når den er afkølet og størnet, skal du returnere dereplicationpladen til den forseglede plastikpose og opbevare den på hovedet ved 4 °C natten over.
Bemærk: Dette trin gør det muligt at udbrede sekundære metabolitter fra det fermenterede Bennets medium til MHB-agar-overlejringen. Hvis nitrocellulose membranen ikke var forberedt ordentligt, vil der være spore vækst omkring kanterne af pladen, som har hydrofobe egenskaber, der fraviser MHB agar. Hæld ikke overlay oven på disse sporer, fordi det kan resultere i kontaminering af overlay. - På samme dag som overlejringen hældes, inokulere en frisk ARP/MARP skabelon ved pipettering 100 μL kation justeret MHB i hver brønd af en 96-brønd plade.
Bemærk: For at reducere risikoen for spredning af kontaminering under dereplication, brug en enkelt ARP/MARP Biblioteks plade til kun at dereplicate 2 − 3 dereplications plader. Derfor podes nok 96-brønd ARP/marp plader baseret på antallet af stammer, der vil blive dereplicated. - Tag den frosne bestand ARP/MARP Library Plate ud af-80 °C fryser. Fjern aluminiums forseglingen, før kondenseringen begynder at danne på dens underside, hvorved risikoen for at forurenes nabo brønde i Biblioteks pladen mindskes.
- Ved hjælp af sterile 96-brønd klemning værktøjer (eller andre former for inokulering udstyr), forsigtigt PIN fra den frosne bestand ARP/MARP bibliotek plade og inokulere de friske MHB-holdige 96-brønd plader. For at minimere kontaminering under dereplication skal du forberede så mange ARP-eller MARP-Biblioteks plader, der er nødvendige for kun at dereplicate 2 − 3 dereplications plader pr. Biblioteks plade. Sterilisere fastgørelse værktøjer mellem pode hver plade.
- Sæt en ny steril aluminiumsforsegling på den frosne skabelon, når den er færdig, og returner den til-80 °C fryser. Placer de inokulerede 96-brønd plader indvendigt i en forseglet plastikpose, og Inkuber ved 37 °C med beluftning (250 rpm) i 18 timer.
Bemærk: Nye frosne Stock Library plader kan fremstilles fra dette trin efter at sikre, at ingen forurening er til stede. Tilsæt glycerol til pladen før opbevaring ved-80 °C som beskrevet i trin 2,5.
5. dereplicating ved hjælp af ARP/MARP
- Fjern ARP/MARP-skabelonen fra inkubator og sørg for, at der ikke er nogen forurenende stoffer til stede. Altid dereplicate ved hjælp af en skabelon, der er frisk tilberedt og ikke direkte fra den frosne bestand.
- Fjern dereplications pladerne fra 4 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur. Hvis der er kondens, skal du åbne lågene og lade tørre i et sterilt miljø.
- Ved hjælp af sterile fastgørelse værktøjer (eller andet inokulations udstyr), fastgør fra ARP/MARP Biblioteks pladen på overfladen af MHB agar overlay af dereplication plader. Vær omhyggelig med ikke at gennembore agar. Sterilisere fastgørelse af værktøjer i mellem pode hver dereplication plade.
- Når du har fastgjort skabelonen på overfladen af dereplications pladerne, skal du tillade, at skabelonens inokulum tørrer i 3 − 5 minutter. Anbring de i en forseglet plasticpose på hovedet i en lukket plastik taske, og Inkuber natten over ved 37 °C.
- Analysér dereplication-resultater den følgende dag ved at sammenligne væksten på dereplicationpladen med brønde, der svarer til ARP/MARP-kortet (tabel 3 og tabel 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende resultater blev opnået, når en samling af antibiotika-producerende stammer af interesse var dereplicated ved hjælp af ARP og/eller MARP.
Et diagram over arbejdsprocessen ARP/MARP-dereplication er afbildet i figur 1, og Biblioteks plade kort vises i supplerende figur 1 og supplerende figur 2. Figur 2 viser et positivt dereplication resultat, hvor den miljømæssige ekstrakt wac 8921 er identificeret som en chloramphenicol producent. Figur 3 viser en mangel på ARP-vækst helt, hvilket indikerer tilstedeværelsen af enten et ukendt antibiotikum eller et mindre hyppigt forekommende antibiotikum, der ikke er taget højde for i ARP/marp Biblioteks pladen. Figur 4 viser et vækstmønster, der er unikt for marp på grund af dets udnyttelse af både dværg E. coli BW25113 og en hyperpermeabel og effluks mangelfuld mutant E. coli BW25113 δbambΔTolc. Dette resultat antyder tilstedeværelsen af en forbindelse med antimikrobiel aktivitet, der ikke er i stand til at overgå en intakt ydre membran. Figur 5 viser et E. coli -vækstmønster, der antyder ukorrekt sterilisering af fastgørelse af-værktøjer, og figur 6 viser et eksempel på ARP/marp-frosset Stock Library-plade forurening. Figur 7 viser, hvad der sker, hvis agar-overlay er gennemboret under dereplication. Endelig viser figur 8 MHB-overlay-relateret kontaminering, der kan opstå under dereplications processen.
Figur 1: en skematisk afderepliceringsproces. Den producerende stamme, der skal dereplicated er stribede på en rektangulær Petri skål som en græsplæne og en nitrocellulose membran er placeret på toppen. Pladen inkuberet derefter i 6 dage, hvor den producerende-stamme-relaterede biomasse vokser på overfladen af membranen, mens sekundære metabolitter, der produceres, udskilles i de Petri parabol medier. Efter en 6-dages fermenterings periode fjernes membranen, og der tilsættes en MHB-overlay til overfladen af de antibiotika-holdige medier for at give en glat overflade til fastgørelse. ARP/MARP E. coli -biblioteket, som er arrangeret i et 96-brønd plade format i henhold til ARP/marp-kortene, fastgøres derefter på overfladen af overlejringen. Efter inkuberet bakken natten over ved 37 °C, væksten af E. coli stammer udtrykker specifikke resistensgener indikerer identiteten af den producerede stof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dereplication af et kendt antibiotikum. Den producerende stamme WAC 8921 blev dereplicated ved hjælp af ARP-skabelonen. Vækst af E. coli BW25113 δbambδTolc pGDP1:kat på overfladen af MHB agar overlay indikerer, at WAC 8921 er en chloramphenicol producent. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dereplication af et ukendt antibiotikum. Den producerende stamme WAC 9941 blev dereplicated ved hjælp af ARP-skabelonen. En mangel på E. coli bibliotek vækst blev set på overfladen af den rektangulære Petri skål, hvilket indikerer, at enten wac 9441 producerer en ukendt antimikrobiel forbindelse eller en sjælden antibiotikum, der ikke er MEDREGNET i ARP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: identifikation af en antimikrobiel forbindelse, der ikke kan krydse en intakt ydre membran. Den producerende stamme WAC 4178 blev dereplicated ved hjælp af MARP-skabelonen. Stammer af e. coli BW25113 er i stand til at vokse på overfladen af de sekundære metabolit-holdige medier, mens alle stammer af e. coli BW25113 δbambΔTolc ikke kan vokse. Dette antyder, at WAC 4178 producerer en antimikrobiel forbindelse, der ikke kan krydse en intakt ydre membran. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kontaminering på grund af ikke-sterile fastgørelse af-værktøjer. Den producerende stamme WAC 7094 blev dereplicated ved hjælp af ARP-skabelonen. Tilstedeværelsen af e. coli Biblioteks vækst i områder, der ikke havde en tildelt e. coli stamme tyder på, at fastgørelse af værktøjer, der anvendes til at inokulere MHB agar overlay af den rektangulære Petri skål ikke var korrekt steriliseret. Dette resulterer i overførsel af ukendte E. coli stammer på tværs af overlay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: kontaminering på grund af en kontamineret fastfrosset bestand ARP/MARP skabelon. Den producerende stamme WAC 3683 blev dereplicated ved hjælp af ARP-skabelonen. Tre særskilte e. coli kolonier voksede på den rektangulære Petri skål overflade: to svarer til e. coli BW25113 δbambδTolc udtrykker stat, et streptothricin resistens enzym, og den anden svarer til e. coli BW25113 δbambδTolc , der udtrykker Vim-2SS, et β-lactam-resistens enzym. På grund af manglende repliklerende blaVIM2ss koloni vækst, ud over den manglende krydsresistens vides at forekomme mellem disse to antibiotika klasser, kan det antages, at en anden stamme end E. coli δbambδ tolC pGDP1: blaVIM2ss vokser i den respektive frosne Biblioteks plade godt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: gennemboret MHB agar overlay. Den producerende stamme WAC 5106 blev dereplicated ved hjælp af ARP-skabelonen. Denne stamme blev fundet at være en streptomycin producent, som indikeret af væksten af E. coli BW25113 δbambδTolc pGDP3:APH (6)-IA. Punkterings hullerne kan ses på overfladen af MHB agar-overlejringen langs pladens omkreds. Selvom dette ikke påvirker dereplication-resultaterne, kan det gøre dataene svære at fortolke ved første øjekast. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: kontaminering af MHB-agar-overlejringen. Kontamineret MHB-agar giver et uregelmæssigt vækstmønster på overfladen af overlejringen, der bliver synlig efter inkubering af pladen natten over ved 37 °C. Selv om E. coli -væksten stadig kan være synlig gennem kontamineringen, tilrådes det at gentage eksperimentet, før data fra pladen ekstrapoleres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plasmid | Valgbart mærke |
| pGDP1 | Kanamycin 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicillin 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| Ingen | - |
Tabel 1: valgbare markører, der anvendes i pGDP plasmid-serien. Række ARP/MARP E. coli -stammerne over på lb agar Petri skåle, der indeholder den passende valgbare markør i den rigtige koncentration for hvert plasmid.
| Medier | Ingrediens | Beløb |
| Sam | Glukose | 15 g |
| Soja pepton | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| Gær ekstrakt | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glycerol | 2,5 mL | |
| ddH2O | Til 1 L | |
| Bennetts | Kartoffelstivelse | 10 g |
| Casamino syrer | 2 g | |
| Gær ekstrakt | 1,8 g | |
| Czapek mineral mix | 2 mL | |
| Agar (ekstraudstyr) | 15 g | |
| ddH2O | Til 1 L | |
| Czapek mineral mix | KCl | 10 g |
| MgSO4∙ 7h2O | 10 g | |
| NaNO3 | 12 g | |
| FeSO4∙ 7h2O | 0,2 g | |
| Koncentreret HCl | 200 μL | |
| ddH2O | Til 100 mL |
Tabel 2: opskrifter til Sam og Bennetts medier og Czapek mineral mix. Justér SAM og Bennetts til pH 6,8 før autoklavering, og Filtrer sterilisering af Czapek mineral blandingen.
| Antibiotika klasse | Antibiotika | Modstands-gen | E. coli-stamme | Godt position |
| Aminoglycosider | Streptomycin | APH (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-deoxystreptamin | rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycin | apmA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | |
| Spectinomycin | APH (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | |
| β-lactams | Penicillin | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| Cefalosporin | ||||
| Carbapenam | ||||
| Lincosamider | Lincosamider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| Makrolider | Makrolider | ermC | ||
| Type B streptograminer | Type B streptograminer | ermC | ||
| Type A Streptogramins | Type A Streptogramins | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracykliner | Tetracyklin | tet (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Chloramphenicols | Chloramphenicols | Kat | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| Polymyxiner | Polymyxiner | MCR-1 | vild-type BW25113 | C6, F7 |
| Echinomycins | Echinomycins | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 |
| Sideromycins | Albomycin | fhuB mutant | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Tuberactinomyciner | Viomycin | vph | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 |
| Nielsen | Nielsen | Nielsen | vild-type BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| Nielsen | Nielsen | Nielsen | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabel 3: godt udpegelses tabel for de minimale ARP-stammer. Denne tabel viser, hvilken brønd af en 96-brønd plade, at hver af de minimale ARP stammer kan findes i henhold til den minimale ARP bibliotek plade kort. Tabellen viser også, hvilke antibiotika klasse hvert gen giver resistens over for. Bemærk venligst, at nogle gener kan give resistens over for mere end ét antibiotikum inden for den givne antibiotika klasse.
| Antibiotika klasse | Antibiotika | Modstands-gen | E. coli-stamme | Godt position |
| Aminoglycosider | Streptomycin | APH (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2, G11 |
| APH (6)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6, F7 | ||
| Spectinomycin | APH (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicin | AAC (3)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| ant (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, H8 | ||
| APH (2 ' ')-id | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6, H7 | ||
| AAC (6 ')-APH (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | ||
| Kanamycin | APH (3 ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| APH (3 ')-Illa | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycin | APH (4)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6, G7 | |
| β-lactams | Amoxicillin | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidim | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacillin | OXA-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 | |
| Lincosamider | Lincosamider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| LNU (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Makrolider | Makrolider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| mphA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2, F11 | ||
| Type B streptograminer | Type B streptograminer | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| VGB | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| Type A Streptogramins | Type A Streptogramins | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracykliner | Tetracyklin | tet (M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5, D8 |
| Chloramphenicols | Chloramphenicols | Kat | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| Nielsen | Nielsen | Nielsen | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabel 4: brønd udpegelses tabel for ARP-stammerne. Denne tabel viser, hvilken brønd af en 96-brønd plade, at hver af ARP stammer kan findes i henhold til ARP bibliotek plade kort. Tabellen viser også, hvilke antibiotika klasse hvert gen giver resistens over for. Bemærk venligst, at nogle gener kan give resistens over for mere end ét antibiotikum inden for den givne antibiotika klasse.
Supplerende figur 1: Biblioteks plade kort, der bruges til den oprindelige ARP-skabelon (antibiotika Resistance platform). Organiser de respektive E. coli -stammer i en 96-brønd plade ved hjælp af dette format for at sikre, at alle nødvendige kontroller og dubletter er inkluderet. Dette tal er blevet modificeret fra Cox et al.10. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Biblioteks plade kort, der anvendes til skabelonen minimal antibiotikaresistens platform (MARP). Organiser de respektive E. coli -stammer i en 96-brønd plade ved hjælp af dette format for at sikre, at alle nødvendige kontroller og dubletter er inkluderet. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne protokol kan anvendes på både opdagelsen af nye antimikrobielle forbindelser og adjuvanter, der kan anvendes sammen med eksisterende antibiotika for at redde deres aktivitet. Platformen udnytter de høje substratspecificitet af resistensmekanismer og deres cognate antibiotika, at dereplicate forbindelser inden for rå naturlige produkt ekstrakter. Selv om den tid, der kræves for afkalknings plader, der skal forberedes, er langvarig (~ 2 uger), er selve dereplications processen afsluttet efter en enkelt dag med inkubationstiden, hvilket er hurtigt i forhold til den tid, det kan tage at isolere og karakterisere en sammensat af rå ekstrakter. Derudover er der ikke behov for dyrt eller højt specialiseret udstyr, hvilket gør denne platform tilgængelig og omkostningseffektiv.
En anden stor fordel ved denne platform er dens fleksibilitet. ARP kan udvides til at indeholde resistensgener, der omfatter flere antibiotika klasser. Dette opnås ved at overvåge litteratur for fremkomsten af nye resistens enzymer og ved hjælp af grundlæggende molekylære kloning teknikker til at tilføje gener til E. coli bibliotek. Endvidere, den dereplication skabelon er tilpasselig baseret på det ønskede niveau af bred eller smal rækkevidde substratspecificitet, som en person ønsker at bruge, når dereplicating. Enhver kombination af gener i E. coli -biblioteket kan bruges til at lave nye Biblioteks plader med mulighed for at detektere forbindelser med forskellige profiler. F. eks. kan der udvikles en β-lactamase, der udtrykker E. coli -skabelonen, for at muliggøre en meget specifik dereplication af β-lactamer og deres forskellige underklasser.
Mens denne platform oprindeligt var designet til at dereplicate forbindelser på solide medier, det også været arbejder i flydende medier. Dette er nyttigt, når du arbejder med forbindelser, der allerede er blevet renset, hvor kun en begrænset mængde er tilgængelig for testning, eller når du arbejder med forbindelser, der ikke diffus let eller konsekvent i solide medier. Endelig, mens denne protokol blev beskrevet ved hjælp af E. coli stammer BW25113 og BW25113 δbambΔTolc, platformen kan anvendes med resistens gen bibliotek udtrykt i forskellige stammer af e. coli (dereplication phenotyper kan variere). I sidste ende, antibiotikaresistens platform er fleksibel, har mange applikationer, og er fordelagtig i forhold til andre dereplication metoder.
For at sikre, at der opnås reproducerbare og ikke-kontaminerede resultater, er det afgørende at følge passende steriliserings-og aseptiske teknikker. Hvis dette ikke sker, vil det medføre kontaminering af fastgørelse af værktøjerne, biblioteks pladen eller selve dereplications pladen. Mens selektable markører er til stede i E. coli biblioteket, som kan hjælpe med at forhindre forurening forårsaget af bakterier mangler markør, det forhindrer ikke krydskontaminering af stammer ved hjælp af samme markør. For at reducere risikoen for dette sker er det vigtigt omhyggeligt at sterilisere de bakterielle fastgørelse af værktøjer, før fastgørelse fra Biblioteks pladen. Hver Biblioteks plade bør kun være fastgjort fra 3 − 4 gange maksimum, før der kasseres for en ny skabelon. Dette forhindrer spredning af kontaminering på tværs af alle dereplications plader, hvis en Biblioteks plade bliver forurenet under fastgørelse af processen. Derudover anvendes der ingen antibiotika ved inokulering af dereplicationpladen, og der skal udvises så stor omhu for at undgå kontaminering, før det er overladt til at fermentere i seks dage. En anden mulig forureningskilde findes i MHB-agar-overlejringen på dereplicationpladen. Hvis over lejrings mediet er forurenet, vil væksten først dukke op efter natten inkubation ved 37 °C post-fastgørelse. Overlay-kontaminering kan gøre det yderst vanskeligt at analysere væksten i E. coli -biblioteket på overlay-overfladen. For at reducere risikoen for overlay-kontaminering skal du tilberede MHB agar frisk, før du hælder overlejringen. Det anbefales, at indtil en person er fortrolig med denne metode, bør dereplication plader altid være forberedt i duplikat eller tre eksemplarer sådan, at i tilfælde af kontaminering af en plade, data kan stadig udvindes fra den forhåbentlig ikke-forurenede plader.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at ARP/MARP har begrænsninger. Denne protokol er ikke egnet til de-replikation af producerende-stammer, der producerer mere end én bioaktive stof. Hver stamme i E. coli -biblioteket er designet til at udtrykke et enkelt modstands-gen. Hvis to antibiotika produceres af en organisme, vil hverken resistens genet give resistens over for det andet antibiotikum, hvilket resulterer i celledød af begge stammer. Derfor skal denne mulighed tages i betragtning, når dereplication resultater tyder på tilstedeværelsen af en ny antibiotikum, fordi produktionen af flere antibiotika ikke kan påvises ved den nuværende enkelt konstruere E. coli bibliotek. En fremgangsmåde, der kan tages for at bekæmpe udfordringen med at afstikke stammer, der producerer mere end ét antibiotikum, involverer brug af agar-stik-proceduren beskrevet i det originale ARP-papir af Cox et al.10. Ved denne metode fjernes en del af et fermenteret fast medium fra en antibiotika-producent, der indeholder pladen, og anbringes på en græsplæne med indikator ARP-stamme. Indikator stammen kan være en hvilken som helst af de resistente E. coli -stammer i ARP-biblioteket. Hæmningszoner anvendes derefter til at sammenligne bioaktiviteten af en producerende stamme mod ARP-stammerne og en vildtype stamme. ARP stammer, der danner en hæmmende zone af nedsat størrelse i forhold til den vilde type stamme kan modstå den forbindelse, der produceres. Denne metode har vist sig at være effektiv til at identificere stammer i stand til at producere flere antibiotika10.
Kort sagt, for at opnå de bedste resultater, når dereplicating med ARP/MARP det anbefales, at dereplication plader er tilberedt i duplikat eller triplicate. Andre kritiske trin i protokollen omfatter fastgørelse fra en frisk Biblioteks plade (aldrig frosset) og fjernelse af så meget biomasse som muligt fra den producerende stamme under membran fjernelses stadiet. Hvis alle nødvendige skridt følges, bør man have succesfulde dereplication resultater for en producerende-stamme af interesse inden for en to-ugers tidsramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning i Wright Lab vedrørende ARP/MARP blev støttet af Ontario Research fund og canadiske institutter for sundhedsforskning Grant (FRN-148463). Vi vil gerne anerkende sommer Chou for at hjælpe med udvidelse og organisering af ARP-biblioteket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
