Summary
Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.
Abstract
Os neutrófilos são um dos principais membros do sistema imunológico inata e desempenham papéis fundamentais na defesa hospedeira contra patógenos e reações inflamatórias patológicas. Os neutrófilos podem ser recrutados para locais de inflamação através da orientação de citocinas e quiminas. A infiltração esmagadora de neutrófilos pode levar a danos teciduais indiscriminados, como na artrite reumatoide (RA). Os nêtrófilos isolados da exoneração peritoneal respondem a um quimioatrativo definido, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro em ensaios de câmara Transwell ou Zigmond. O experimento da bolsa de ar pode ser usado para avaliar a quimiotáxi dos neutrófilos em direção ao lipopolissacarídeo (LPS) in vivo. O modelo de camundongo seduvante induzido por adjuvante (AA) é frequentemente usado em pesquisas de RA, e a coloração imunohistoquímica de seções articulares com anti-mieloperoxidase (MPO) ou anticorpos elastase anti-nêutrons (NE) é um método bem estabelecido para medir infiltração de neutrófilo. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapias promissoras que visam a migração de neutrófilos.
Introduction
Os neutrófilos são os glóbulos brancos mais abundantes e representam 50-70% de toda a população de glóbulos brancos em humanos1. Os neutrófilos são um dos principais respondentes durante a inflamação aguda. Os neutrófilos podem ser recrutados para locais de inflamação através da orientação de citocinas e quimokinas liberadas pelas células residentes em tecido2,3,4, que é mediada pelas interações entre moléculas de adesão celular na superfície de neutrófilos e células de endotelo vascular5. Os neutrófilos são fundamentais para hospedar a defesa e desempenham um papel nas reações inflamatórias patológicas devido à sua poderosa capacidade de danificar o tecido através da liberação de espécies de oxigênio reativa (ROS) e outras moléculas prejudiciais ao tecido3,6.
Estudos anteriores descreveram vários protocolos de isolamento de neutrófilos de camundongos ou humanos. Oh et al. demonstrou um método de separação de gradiente de densidade para isolar neutrófilos humanos de sangue humanointeiro 7. No entanto, o isolamento de neutrófilos suficientes do sangue do rato é difícil devido ao pequeno volume sanguíneo. Alternativamente, um grande número de neutrófilos de rato puro e viável pode ser obtido a partir de fluido peritoneal de camundongos, e esses neutrófilos purificados podem ser usados ex vivo para examinar vários aspectos das funções celulares ex vivo, incluindo infiltração de neutrófilos, migração, quimiotaxe, explosão oxidativa, citocina e armadilha extracelular de nêutrons (NET) produção8. Ensaios transwell9 ou câmara zigmond10,11 podem ser usados para avaliar a migração de neutrófiloino in vitro. O modelo de bolsa de ar é usado para avaliar a migração e infiltração de neutrófilos in vivo. O modelo subcutâneo da bolsa de ar é conveniente no modelo animal vivo para estudar a migração de células inflamatórias.
Tradicionalmente, os neutrófilos eram considerados como eliminadores de patógenos em fases agudas de inflamação. No entanto, descobertas recentes mostraram que os neutrófilos são células complicadas que executam uma variedade significativa de funções especializadas. Os neutrófilos podem regular muitos processos como lesão aguda e reparo, tumorigênese, resposta autoimune e inflamação crônica12,13. Os neutrófilos também modulam as respostas imunes adaptativas e podem regular células B e células T14,15. A escassez substancial de neutrófilos leva à mortalidade ou à imunodeficiência grave em humanos e à esgotamento de neutrófilos em camundongos leva à fatalidade, enquanto a ativação excessiva ou recrutamento de neutrófilos em órgãos causa várias doenças imunológicas, como artrite reumatoide (RA) e lúpus eritematosus sistêmico (SLE)6. Os neutrófilos são as células mais abundantes no fluido sinovial dos pacientes com RA. Os neutrófilos produzem quantidades excessivas de mieloperoxidase (MPO) e elastase de neutrófilo (NE) via degradação, o que agrava a erosão da cartilagem. MPO é uma enzima peroxidase expressa principalmente nos grânulos de neutrófilos16. O NE está associado à destruição articular da cartilagem17. MpO e NE poderiam ser usados para avaliar o status de migração de neutrófilos e infiltração no tecido de pacientes de RA.
Este artigo fornece três métodos convencionais para avaliar a migração de neutrófilos normais induzidos tanto in vivo quanto in vitro, bem como a infiltração de neutrófilos patológicos em um modelo de inflamação específico da articulação do camundongo.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade chinesa de Pequim.
NOTA: Foram utilizados camundongos C57BL/6 (7 a 8 semanas de idade).
1. Isolamento de neutrófilo
- Aquisição de células exudadas peritoneais
- Prepare uma solução de peptona de proteosa fresca de 10% no ddH2O. Calcule o volume necessário de acordo com o número de camundongos.
NOTA: Definir o número de camundongos como N, (2N+1) mL de solução deve ser dissolvido e filtrado com antecedência. - Pulverizar o espaço de trabalho com 70% de etanol. Use um injetor de insulina para desenhar 1 mL de solução peptone e bolhas de descarga.
- Realizar a primeira injeção intraperitoneal de 1 mL de solução peptone por mouse.
- Pegue o mouse em uma posição de cabeça para baixo com uma mão. Desinfete o ponto de injeção com bolas de algodão encharcadas de álcool.
NOTA: A posição de injeção preferida está no aspecto lateral do quadrante inferior esquerdo ou direito do abdômen. - Infunda os reagentes rapidamente. Injete 1 mL na cavidade peritoneal de cada rato com o injetor de insulina.
NOTA: O ângulo entre a agulha e a pele deve ser de aproximadamente 15-30° para evitar ferir o intestino ou outros órgãos.
- Pegue o mouse em uma posição de cabeça para baixo com uma mão. Desinfete o ponto de injeção com bolas de algodão encharcadas de álcool.
- Permitir que a resposta inflamatória se desenvolva da noite para o dia. Depois das 12h, conduza a segunda injeção da mesma forma que a primeira injeção.
- Três horas após a segunda injeção, anestesiar totalmente os camundongos com 5% de isoflurano por 5 min em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min. Remova os ratos anestesiados da câmara e os sacrifice por luxação cervical.
NOTA: Profundidade suficiente de anestesia é garantida beliscando os dedos antes de mover ratos da câmara para a única unidade de respiração. As pernas não devem se mover quando os dedos são beliscados.
NOTA: Todas as seguintes etapas devem ser processadas em uma capa de cultura tecidual. - Pulverizar o mouse com 70% de etanol. Coloque o rato em uma almofada de plástico estéril e conserte os membros com agulhas.
- Use um conjunto estéril de ferramentas cirúrgicas para fazer uma incisão horizontal (~1 cm) no meio do abdômen inferior. Levante a pele do abdômen superior com fórceps e corte ao longo da linha média do abdômen e exponha a parede peritoneal intacta.
- Injete 5 mL de RPMI-1640 completo estéril na cavidade abdominal com uma agulha de 30 G x 1/2". Insira a agulha através da parede peritoneal com a borda chanfrada da agulha virada para cima e injete todo o volume.
- Agite a almofada horizontalmente por 5 minutos. Massageie o abdômen suavemente várias vezes.
- Injete uma agulha de 23 G x 1 1/4" no espaço lateral do abdômen. Extrair o líquido abdominal (~5 mL) e recolhê-lo em um tubo de centrífuga de 50 mL.
NOTA: Coloque os tubos no gelo o mais rápido possível em caso de ativação de neutrófilo. - Injete mais 5 mL de meio completo e repita o procedimento para remover as células restantes do peritôono. Pool o fluido peritoneal no tubo centrífuga de 50 mL.
- Centrífuga o fluido peritoneal agrupado a 400 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT).
- Descarte o supernatante. Resuspender as células em 1 mL de RPMI-1640 completo.
NOTA: Não vórtice para evitar ativação de neutrófilos.
- Prepare uma solução de peptona de proteosa fresca de 10% no ddH2O. Calcule o volume necessário de acordo com o número de camundongos.
- Isolamento de neutrófilos
- Adicione 4 mL de meio gradiente de densidade recém-preparado de 70,2% (por exemplo, Percoll) em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Sobreponha cuidadosamente 4 mL de um gradiente de densidade recém-preparado de 54,8% no meio gradiente de densidade de 70,2% lentamente ao longo da borda do tubo com pontas de pipeta afiadas no tubo centrífuga de 15 mL.
NOTA: Tenha cuidado para evitar perturbar a interface entre o médio gradiente de densidade de 54,8% e o meio gradiente de densidade de 70,2%. - Sobreponha cuidadosamente a suspensão da célula peritoneal de 1 mL em cima da camada média gradiente de densidade de 54,8% lentamente com pontas de pipeta afiada(Figura 1A).
NOTA: Tenha cuidado para evitar perturbar a interface entre a suspensão celular e o meio gradiente de densidade de 54,8%. - Centrífuga a 1.500 x g por 30 min a 22 °C sem frear.
- Colete os neutrófilos na interface do médio gradiente de densidade de 54,8% e 70,2% de camadas médias de gradiente de densidade(Figura 1B) para um novo tubo.
- Adicione 1 mL de RPMI-1640 completo ao meio completo às células coletadas e resuspenda cuidadosamente as células, canalizando suavemente várias vezes. Centrífuga a 100 x g por 10 min na RT e remova cuidadosamente o supernatante.
- Repita a etapa de lavagem (passo 1.2.6) uma vez.
- Adicione 0,5 mL de cultura média à pelota e resuspenda as células, canalizando suavemente várias vezes. Tome uma alíquota de 50 μL para contar as células usando um analisador automático de hematologia.
2. Ensaio de migração de nêutrons
- Medir a migração de neutrófilos pela Transwell como say9 ou o ensaio da câmara de Zigmond como descrito anteriormente10,11.
3. Ensaio de bolsa de ar
- Primeira injeção de ar
- No dia 0, anestesiam totalmente os camundongos com 5% de isoflurano por 3 min em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min, e mantêm a anestesia de cada rato em uma única unidade respiratória com 2% de isoflurano a uma velocidade de 0,5 L/min.
NOTA: Profundidade suficiente de anestesia é garantida beliscando os dedos antes de mover ratos da câmara para a única unidade de respiração. As pernas não devem se mover quando os dedos são beliscados. - Use um filtro de 0,22 μm anexado a uma seringa de 5 mL para obter um volume de 3 mL de ar esterilizado.
- Levante a pele traseira do mouse anestesiado com pinças e injete subcutâneamente 3 mL de ar esterilizado usando uma agulha de 26 G x 3/8".
- Após o tratamento, remova os camundongos da unidade de respiração. Monitore os ratos para garantir que eles estejam vivos até que comecem a se mover.
- No dia 0, anestesiam totalmente os camundongos com 5% de isoflurano por 3 min em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min, e mantêm a anestesia de cada rato em uma única unidade respiratória com 2% de isoflurano a uma velocidade de 0,5 L/min.
- Segunda injeção de ar
- No dia 3, injete mais 3 mL de ar esterilizado no bolso de ar previamente estabelecido para sustentar a bolsa de ar conforme descrito na seção 3.1.
- Tratamento
- No dia 6, 6 h antes do sacrifício, injete diferentes tratamentos na bolsa de ar. Injetar 1 mL de salino tampão de fosfato (PBS) como um controle negativo. Injete 1 mL de 1 μg/mL LPS como o controle positivo para induzir inflamação local.
- Anestesia total camundongos com 5% de isoflurano por 3 minutos em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min, e manter a anestesia de cada rato em uma única unidade respiratória com 2% isoflurane a uma velocidade de 0,5 L/min. Prepare tampão de lavagem de acordo com tabela de materiais.
NOTA: Profundidade suficiente de anestesia é garantida beliscando os dedos antes de mover ratos da câmara para a única unidade de respiração. As pernas não devem se mover quando os dedos são beliscados. - Para cada bolsa de ar, lave a bolsa de ar com 1 mL de tampão de lavagem e colete o exudata inflamatório em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave a bolsa de ar com 2 mL de tampão de lavagem 2x e colete a exudação inflamatória no mesmo tubo de centrífuga.
- Centrífuga a 100 x g por 10 min na RT. Descarte as células supernatantes e resuspenda em 1 mL de tampão de lavagem. Conte as células para quantificar a razão de neutrófilo usando o analisador automático de hematologia.
NOTA: Veja os resultados representativos na Figura 2.
4. Indução do modelo de camundongo seduvante induzido por adjuvante (AA)
- Suspenda o adjuvante completo da Freund (CFA) vórtices de pelo menos 5 s e, em seguida, desenhe 100 μL de suspensão em um injetor de insulina.
NOTA: Recomendamos o uso completamente novo CFA em experimentos para garantir a esterilidade. - Ratos anestesiados como descrito na etapa 3.1.1.
- Marque a pata escolhida e injete 20 μL de CFA no espaço articular do tornozelo. Injete 20 μL de suspensão em quatro pontos periarticulares na pata escolhida (80 μL no total).
- Remova os ratos da unidade de respiração e coloque os ratos processados em uma nova câmara. Monitore os camundongos para garantir que eles estejam respirando até recuperarem a capacidade de se mover.
- A cada 3 dias, avalie o diâmetro da articulação medindo o diâmetro da articulação do tornozelo usando um medidor de espessura do bolso (Figura 3A).
- A cada 3 dias, avalie a gravidade da artrite por critério de pontuação da artrite (Figura 3C): 0, normal, nenhuma evidência de eritema e inchaço; 1, a artrite mais leve, eritema e inchaço leve confinado às lonas ou articulação do tornozelo; 2, artrite moderada, eritema e inchaço leve que se estende do tornozelo até as tarsals; 3, artrite grave, eritema e inchaço moderado que se estende do tornozelo às articulações metatarsas; 4, a artrite mais grave, eritemthema e inchaço severo abrangem o tornozelo, pé e dígitos, ou anquilose do membro.
5. Coloração imunohistoquímica de seções articulares
- Isolamento conjunto
- Sacrifique o rato na seção 4 usando luxação cervical após anestesia com isoflurano. Pulverizar o mouse com 70% de etanol.
- Retire a pele e parte do músculo da perna traseira com pinças e tesouras. Pulverize a articulação com 70% de etanol e remova o resto dos músculos usando uma toalha de papel.
- Fixar a articulação do tornozelo em 4% paraformaldeído por 2 dias na RT. Decalcifique a articulação em 10% EDTA por 1 mês na RT e mude o médio semanal.
- Incorpore o tecido em parafina e prepare seções de tecido de 4 μm de espessura.
- Coloque o tecido em um molde marcado com certo volume de parafina líquida. Esfrie brevemente.
- Coloque a espessura em 4 μm e corte fatias em um microtome. Seções flutuantes em um banho de água de 43 °C.
- Monte as seções em slides e coloque os slides no forno a 70 °C por 2 h. Para uso futuro, conservar os slides a -20 °C.
- Safranino O e mancha verde rápida de seções articulares
NOTA: As seguintes etapas de coloração são realizadas na RT.- Coloque os slides da etapa 5.1.4.3 em um rack e realize as seguintes lavhes para reidratar na RT: xileno por 5 min (3x), 100% de etanol por 2 min (2x), 95% de etanol por 2 min (2x), 70% de etanol por 2 min e 50% de etanol por 15 min. Lave água de torneira por 3 min.
- Mancha em solução verde rápida de 0,1% para 5 min. Enxágue em 1% de ácido acético para 10 s.
- Mancha em 0,1% solução de coloração O por 20 min. Mergulhe os slides nas seguintes lavais: 95% de etanol por 2 min (2x), 100% etanol por 2 min (2x) e xileno por 2 min (2x).
- Monte as seções teciduais e observe os tecidos um microscópio.
NOTA: Veja imagens representativas na Figura 4A.
- Coloração imunohistoquímica para visualizar neutrófilos
- Asse as seções de parafina por 2 h a 78 °C. Coloque os slides em um rack e realize as seguintes lavas para reidratar na RT: xileno por 15 min (2x), 100% de etanol por 5 min (2x), 95% de etanol por 5 min, 80% de etanol por 5 min, H2O por 3 min e PBS por 3 min.
NOTA: Não deixe os slides secarem a qualquer momento durante esta etapa. - Adicione uma gota de tampão de permeabilização para cobrir o tecido. Seções incubadas em uma bandeja controlada pela umidade a 37 °C.
- Enxágüe desliza na PBS por 3 min (3x). Evite enxaguar o tecido diretamente.
- Realize a recuperação de epitope de antígeno induzida pelo calor usando uma caldeira de pressão.
- Disponha slides em um rack. Mergulhe na caldeira de pressão cheia de tampão de recuperação.
- Coloque a caldeira de pressão em um forno de micro-ondas. Coloque o forno de micro-ondas a 600 W e aqueça os slides por 10 min.
- Depois de ferver, mantenha os slides na caldeira para esfriar até 90 °C. Tire os slides e enxágue-os na PBS por 3 min (3x).
- Aprática de atividade peroxidase endógena em recém-preparada 3% H2O2 na RT por 15 min. Enxágue desliza na PBS por 3 min (3x).
- Esboce um grande círculo ao redor da amostra com uma caneta hidrofóbica, evite tocar na amostra. Bloqueie com 3% de albumina de soro bovino (BSA) em uma câmara controlada pela umidade a 37 °C por 60 min.
- Remova a solução de bloqueio. Adicione 50 μL de anticorpo primário diluído por PBS a cada seção rapidamente. Em seguida, incubar os slides em uma bandeja controlada pela umidade a 4 °C durante a noite.
NOTA: Diferentes índices de diluição são usados para diferentes anticorpos (1:25 para MPO e 1:20 para NE). - No segundo dia, tire a bandeja e deixe-a ficar na RT por 30 min. Em seguida, enxágue os slides na PBS por 3 min (3x).
- Adicione 50 μL de anticorpos secundários diluídos por PBS ao tecido.
NOTA: Foram aplicadas diferentes razões de diluição: 1:1.000 para MPO e 1:1.500 para NE. - Incubar slides em uma bandeja controlada pela umidade a 37 °C por 30 min. Em seguida, enxágue os slides na PBS por 3 min (3x).
- Desenvolva-se em solução diluída 3,3'-diaminobenzidina (DAB) por 5 min. Fique de olho na reação em caso de desenvolvimento de uma cor escura. Enxágüe os slides em água destilada.
- Contralforme os slides em hematoxilina por 10 s. Enxágue os slides na água da torneira por 5 min.
- Enxágüe em solução de diferenciação super-rápida de álcool ácido para 3 s. Em seguida, enxágue na água da torneira por 10 min.
- Mergulhe os slides nas seguintes lavas na RT: 80% de etanol por 5 min, 95% de etanol por 5 min, 100% de etanol por 5 min e xileno por 15 min (2x). Corrija o deslizamento de cobertura com solução de montagem. Observe o tecido um microscópio.
NOTA: Veja imagens representativas na Figura 4B.
- Asse as seções de parafina por 2 h a 78 °C. Coloque os slides em um rack e realize as seguintes lavas para reidratar na RT: xileno por 15 min (2x), 100% de etanol por 5 min (2x), 95% de etanol por 5 min, 80% de etanol por 5 min, H2O por 3 min e PBS por 3 min.
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Representative Results
Células exacetadas peritoneal foram coletadas a partir de fluido de lavage de camundongos. As células foram resuspensas em 1 mL de RPMI-1640 completo, em camadas em duas etapas (54,8%/70,2%) Gradiente de densidade descontínua (Figura 1A) e centrífuga sem 1.500 x g por 30 min. Neutrófilos (≥95%, ~1 x 107 neutrófilos/mouse) foram recuperados da interface inferior (Figura 1B).
Foram realizados experimentos de bolsas de ar para investigar o recrutamento de neutrófilos estimulados pelo LPS in vivo (Figura 2A). Os subconjuntos leucócitos nos exudados da bolsa de ar foram medidos (Figura 2B).
A migração de neutrófilos em RA foi avaliada através do modelo de murina de artrite induzida pelo CFA. Em comparação com o grupo controle, o grupo AA mostrou edema significativo na pata. No grupo AA, o diâmetro da articulação do tornozelo aumentou(Figura 3B) e o escore de artrite aumentou consistentemente (Figura 3D).
O dano na cartilagem é a síndrome representativa da RA, a coloração de cartilagem verde safranina O-fast foi realizada para avaliar os danos na cartilagem no camundongo AA. Como mostrado na Figura 4A,o desafio cfa induziu uma grande quantidade de infiltração leucócito, erosão significativa da cartilagem e hiperplasia sinovial. Os níveis de expressão MPO e NE são marcadores representativos da infiltração de neutrófilos. Ensaios imunohistoquímicos foram realizados para observar infiltração de neutrófilos nas articulações. MpO e EXPRESSÃO NE foram significativamente reguladas na seção conjunta (Figura 4B).
Figura 1: Isolamento neutrófilo. (A) As células exudata peritoneal resuspensas em 1 mL de RPMI-1640 médio completo foram colocadas em camadas em duas etapas (54,8%/70,2%) gradiente de densidade descontínua. (B) Após centrífuga em 1.500 x g por 30 min, os neutrófilos (≥95%, ~1 x 107 neutrófilos/mouse) foram recuperados da interface inferior. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Resultados representativos do ensaio da bolsa de ar. (A)Ilustração do ensaio da bolsa de ar. (B)Resultados representativos da infiltração do subconjunto leucócito no ensaio da bolsa de ar. PBS: controle; LPS: 1 μg/mL LPS. Os dados são apresentados como a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Resultados representativos do modelo de camundongos induzidos por adjuvante (AA). (A)O diâmetro da articulação do tornozelo foi medido usando um medidor de espessura do bolso. (B)O inchaço articular foi avaliado com base no diâmetro da articulação do tornozelo (n = 7). (C)Imagens de cada escore de artrite. (D) A gravidade da artrite foi classificada em uma escala de 0-4 pontos (n = 7). Os dados são apresentados como a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Resultados representativos da coloração de cartilagem verde safranina O-fast e ensaio imunohistoquímico de seções articulares de controle e camundongos AA. (A) Resultados representativos da safranina O-fast cartilagem verde de seções articulares. (B)O representante resulta do nível de expressão do MPO e do NE nas articulações do tornozelo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Protocolos detalhados de neutrófilos altamente purificados do sangue periférico7,medula óssea e tecidos18 estão disponíveis há muito tempo. Aqui adotamos um método de isolar neutrófilos do fluido peritoneal19 no qual os neutrófilos maduros permanecem inativados para estudos anti-inflamatórios e antioxidantes.
Usamos o experimento da bolsa de ar para explorar a infiltração induzida pelo LPS de neutrófilos in vivo. Este método tem sido proposto como um método potencial para medir diretamente a infiltração celular no ambiente inflamatório geral in vivo.
Vale ressaltar que o ensaio da bolsa de ar só demonstra a função do neutrófilo de forma não específica de órgãos e remove várias etapas da cascata de recrutamento de leucócitos. Uma vez que o recrutamento de neutrófilos para órgãos específicos pode contar com diferentes propriedades de órgãos, moléculas de adesão e quimiofinas, explorar o estado funcional neutrófilo em condições específicas de órgãos é de grande importância para estudar o papel que os neutrófilos potencialmente desempenham em certas doenças3. Foi sugerido que modelos de ponto final são necessários para investigar a infiltração de neutrófilos. Portanto, a realização de manchas imunohistoquímicas nas seções articulares de camundongos no modelo AA pode fornecer uma perspectiva perspicaz sobre os neutrófilos no espaço conjunto. De acordo com nossos dados, um grande número de neutrófilos são recrutados para o tecido articular e servem como evidência fundamental para novas pesquisas sobre a interrupção da infiltração de neutrófilos para tratar a RA. Além disso, ensaios abrangentes, por exemplo, safranina O-fast vegetação verde, são necessários para avaliar o modelo da doença para estudos posteriores.
Os neutrófilos são o principal subconjunto de infiltrar células inflamatórias e funcionam como a primeira linha de defesa contra patógenos invasores ou lesões teciduais20,21. Se os neutrófilos se infiltrarem em tecidos em grande número, altos níveis de citocinas e NETs são secretados, o que juntos podem sobrecarregar os mecanismos de proteção nos tecidos e levar a danos teciduais. A lesão tecidual estimula ainda mais a infiltração de neutrófilos, formando assim um ciclo vicioso22. Interferir na migração celular por meio da captura de células ativadas em órgãos linfoides tem sido proposta como uma abordagem terapêutica importante e tem sido aplicada em ensaios clínicos com vários efeitos colaterais23. Descobrir um novo tratamento para regular simultaneamente a migração de neutrófilos e a atividade inflamatória é uma estratégia promissora para o tratamento de doenças inflamatórias no futuro. Além disso, se os agentes reguladores de motilidade forem combinados, a entrega de drogas mediadas por neutrófilos24 pode aumentar a especificidade da droga, diminuindo assim os efeitos colaterais.
No entanto, outras modificações podem ser combinadas para ampliar a aplicação dos ensaios acima mencionados. Por exemplo, no modelo de camundongo AA, para obter a impressão geral de infiltração de células inflamatórias na articulação, os pesquisadores são encorajados a digerir articulações enzimáticas para liberar as populações de leucócitos residentes e, em seguida, aplicar citometria de fluxo para contar as populações.
Os protocolos aqui incluem três maneiras de avaliar a migração e a infiltração de neutrófilos. A aplicação desses protocolos é útil para descobrir tratamentos potenciais para RA e outras doenças inflamatórias envolvendo neutrófilos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (os números de subvenção 81430099 e 31500704), Projetos internacionais de Cooperação e Intercâmbio (número de subvenção 2014DFA32950) e o programa de pesquisa da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim ( números de subvenção BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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