Summary
Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.
Abstract
I neutrofili sono un membro importante del sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella difesa dell'ospite contro agenti patogeni e reazioni infiammatorie patologiche. Neutrophils possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine. L'infiltrazione schiacciante dei neutrofili può portare a danni indiscriminati ai tessuti, come l'artrite reumatoide (RA). Neutrophils isolato dall'estuoper peritoneale rispondono a un chemioattraente definito, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro nei saggi della camera Transwell o zigzag. L'esperimento della sacca d'aria può essere utilizzato per valutare la chemiotassi dei neutrofili verso il lipopolissaccharide (LPS) in vivo. Il modello murino dell'artrite adiuvante (AA) è spesso usato nella ricerca RA, e la colorazione immunostochimica di sezioni congiunte con anticorpi anti-mieloperossia (MMP) o elagasi anti-neutrofili (NE) è un metodo ben consolidato per misurare infiltrazione neutrofila. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire terapie promettenti che prendono di mira la migrazione dei neutrofili.
Introduction
I neutrofili sono i globuli bianchi più abbondanti e rappresentano il 50-70% dell'intera popolazione di globuli bianchi negli esseri umani1. I neutrofili sono uno dei principali soccorritori durante l'infiammazione acuta. I neutrofili possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine rilasciate dalle cellule residenti nei tessuti2,3,4, che è mediata dalle interazioni tra molecole di adesione cellulare sulla superficie di neutrofili e cellule endotelio vascolare 5. I neutrofili sono fondamentali per la difesa dell'ospite e svolgono un ruolo nelle reazioni infiammatorie patologiche a causa della loro potente capacità di danneggiare i tessuti attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e altre molecole dannose per i tessuti3,6.
Studi precedenti hanno descritto diversi protocolli di isolamento dei neutrofili da topi o esseri umani. Oh e t. ha dimostrato un metodo di separazione del gradiente di densità per isolare i neutrofili umani dal sangue umano intero7. Tuttavia, l'isolamento di neutrofili sufficienti dal sangue di topo è difficile a causa del piccolo volume di sangue. In alternativa, un gran numero di neutrofili di topo puro e vitale può essere suscitato dal liquido peritoneale del topo, e questi neutrofili purificati possono essere utilizzati ex vivo per esaminare diversi aspetti delle funzioni cellulari ex vivo, tra cui l'infiltrazione dei neutrofili, la migrazione, il chemiotaxi, l'esplosione ossidativa, la citochina e la produzione di trapextra extrafilaretiche neutrofila (NET)8. Transwell saggi9 o saggi della camera di zigmond10,11 possono essere utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili in vitro. Il modello della sacca d'aria viene utilizzato per valutare la migrazione e l'infiltrazione di neutrofili in vivo. Il modello sottocutaneo della sacca d'aria è un comodo modello animale in vivo per studiare la migrazione delle cellule infiammatorie.
Tradizionalmente, i neutrofili erano considerati eliminatori patogeni nelle fasi acute dell'infiammazione. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che i neutrofili sono cellule complicate che svolgono una notevole varietà di funzioni specializzate. I neutrofili possono regolare molti processi come lesioni e riparazioni acute, tumorigenesi, risposta autoimmune e infiammazione cronica12,13. Neutrophils anche modulare le risposte immunitarie adattative e può regolare le cellule B e le cellule T14,15. La sostanziale carenza di neutrofili porta alla mortalità o alla grave immunodeficienza nell'uomo e l'esaurimento dei neutrofili nei topi porta alla fatalità, mentre l'attivazione o il reclutamento eccessivo di neutrofili negli organi causa diverse malattie immunitarie, come l'artrite reumatoide (RA) e lupus erythematosus (SLE)6. I neutrofili sono le cellule più abbondanti nel fluido sinoviale dei pazienti affetti da RA. Neutrophils producono quantità eccessive di mieloperossia (MPO) e elastasi neutrofili (NE) attraverso la degradazione, che esacerba l'erosione della cartilagine. MPO è un enzima perossidasi espresso principalmente nei granuli dei neutrofili16. NE è associato alla distruzione della cartilagine articolare17. MPO e NE potrebbero essere utilizzati per valutare lo stato della migrazione dei neutrofili e dell'infiltrazione nel tessuto dei pazienti affetti da RA.
Questo articolo fornisce tre metodi convenzionali per valutare la migrazione di neutrofili normali indotti sia in vivo che in vitro, così come l'infiltrazione di neutrofili patologici in un modello di infiammazione specifico dell'articolazione del topo.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state riviste e approvate dall'Università di Pechino di Medicina Cinese Animal Care and Use Committee.
NOTA: sono stati utilizzati topi C57BL/6 (7-8 settimane).
1. Isolamento neutrofilo
- Acquisizione di cellule essudati peritoneali
- Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi.
NOTA: Impostare il numero di mouse come N, (2N- 1) mL di soluzione deve essere dissolto e filtrato in anticipo. - Spruzzare lo spazio di lavoro con 70% di etanolo. Utilizzare un iniettore di insulina per disegnare 1 mL di soluzione peptone e scaricare bolle.
- Condurre la prima iniezione intraperitoneale di 1 mL di soluzione peptone per mouse.
- Afferra il mouse in una posizione head-down con una mano. Disinfettare il punto di iniezione con batuffoli di cotone imbevuti di alcool.
NOTA: La posizione di iniezione preferita si trova nell'aspetto laterale del quadrante inferiore sinistro o destro dell'addome. - Infondere rapidamente i reagenti. Iniettare 1 mL nella cavità peritoneale di ogni topo con l'iniettore di insulina.
NOTA: L'angolo tra l'ago e la pelle dovrebbe essere di circa 15-30 gradi per evitare di ferire l'intestino o altri organi.
- Afferra il mouse in una posizione head-down con una mano. Disinfettare il punto di iniezione con batuffoli di cotone imbevuti di alcool.
- Consentire alla risposta infiammatoria di svilupparsi durante la notte. Dopo 12 h, condurre la seconda iniezione nello stesso modo della prima iniezione.
- Tre ore dopo la seconda iniezione, i topi completamente anestesi con 5% di isoflurane per 5 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min. Rimuovere i topi anestesi dalla camera e sacrificarli con la lussazione cervicale.
NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate.
NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere elaborati in una cappa di coltura tissutale. - Spruzzare il mouse con 70% di etanolo. Posare il mouse su un tampone di plastica sterile e fissare gli arti con gli aghi.
- Utilizzare una serie sterile di strumenti chirurgici per fare un'incisione orizzontale (1 cm) al centro dell'addome inferiore. Sollevare la pelle dell'addome superiore con pinze e tagliare lungo la linea mediana dell'addome ed esporre la parete peritoneale intatta.
- Iniettare 5 mL di RPMI-1640 sterile mezzo completo nella cavità addominale con un ago 30 G x 1/2.Injectato Inserire l'ago attraverso la parete peritoneale con il bordo smussato dell'ago rivolto verso l'alto e iniettare l'intero volume.
- Agitare il pad orizzontalmente per 5 min. Massaggiare delicatamente l'addome più volte.
- Iniettare un ago da 23 G x 1 1/4" nello spazio laterale dell'addome. Estrarre il liquido addominale (5 mL) e raccoglierlo in un tubo di centrifuga di 50 mL.
NOTA: Posizionare i tubi sul ghiaccio il prima possibile in caso di attivazione di neutrofili. - Iniettare altri 5 mL di mezzo completo e ripetere la procedura per rimuovere le cellule rimanenti dal peritoneo. Mettere in comune il liquido peritoneale nel tubo di centrifugazione da 50 mL.
- Centrifugare il fluido peritoneale in pool a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Scartare il super-attardato. Risospendere le celle in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo.
NOTA: Non vortice per evitare l'attivazione dei neutrofili.
- Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi.
- Isolamento dei neutrofili
- Aggiungere 4 mL di mezzo sfumato di 70,2% di densità appena preparato (ad esempio, Percoll) in un tubo di centrifuga da 15 mL.
- Sovrappone con attenzione 4 mL di mezzo sfumato appena preparato al 54,8% di densità sul mezzo di pendenza densità 70,2% lentamente lungo il bordo del tubo con punte di pipetta affilate nel tubo di centrifuga di 15 mL.
NOTA: Prestare attenzione per evitare di disturbare l'interfaccia tra il mezzo gradiente di densità del 54,8% e il mezzo di sfumatura di densità 70,2%. - Sovrapponete con cura la sospensione cellulare peritoneale da 1 mL sopra lo strato medio di pendenza a densità 54,8% lentamente con punte pipette affilate (Figura 1A).
NOTA: Prestare attenzione per evitare di disturbare l'interfaccia tra la sospensione cellulare e il mezzo di gradiente di densità del 54,8%. - Centrifuga a 1.500 x g per 30 min a 22 gradi centigradi senza frenata.
- Raccogliere i neutrofili nell'interfaccia del mezzo gradiente di densità del 54,8% e dei livelli medi del gradiente di densità del 70,2% (Figura 1B) in un nuovo tubo.
- Aggiungere 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo alle cellule raccolte e riutilizzare con attenzione le cellule pipettando delicatamente più volte. Centrifuga a 100 x g per 10 min a RT e rimuovere con attenzione il supernatante.
- Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 1.2.6) una volta.
- Aggiungere 0,5 mL di mezzo di coltura al pellet e rimettere in sospensione le cellule pipettando delicatamente più volte. Prendere un'aliquota 50 -L per contare le cellule utilizzando un analizzatore automatico di ematologia.
2. Analisi della migrazione neutrofilo
- Misurare la migrazione dei neutrofili da parte dell'analisi di Transwell9 o dell'analisi della camera di zigzogo come descritto in precedenza10,11.
3. Asdetto della sacca dell'aria
- Prima iniezione d'aria
- Il giorno 0, i topi completamente anantroposi con il 5% di isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantengono l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min.
NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate. - Per ottenere un volume di aria sterilizzata, utilizzare un filtro da 0,22 m collegato a una siringa da 5 mL.
- Sollevare la pelle posteriore del topo anetizzato con una pinzetta e iniettare sottocutaneamente 3 mL di aria sterilizzata utilizzando un ago da 26 G x 3/8.Lift the back skin of the anthetitized mouse with traweezers and subcutaneously inject 3 mL of sterilized air using a 26 G x 3/8" needle.
- Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità di respirazione. Monitorare i topi per assicurarsi che siano in vita fino a quando iniziano a muoversi.
- Il giorno 0, i topi completamente anantroposi con il 5% di isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantengono l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min.
- Seconda iniezione d'aria
- Il giorno 3, iniettare altri 3 mL di aria sterilizzata nella tasca dell'aria precedentemente stabilita per sostenere la sacca d'aria come descritto nella sezione 3.1.
- Trattamento
- Il giorno 6, 6 h prima del sacrificio, iniettare diversi trattamenti nella sacca dell'aria. Iniettare 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) come controllo negativo. Iniettare 1 mL di 1 G/mL LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale.
- Topi completamente anestesizzare con 5% isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantenere l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% di isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min. Preparare il buffer di lavaggio secondo il tavolo dei materiali.
NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate. - Per ogni sacca d'aria, lavare la sacca dell'aria con 1 mL di tampone di lavaggio e raccogliere l'essenza infiammatoria in un tubo di centrifuga di 15 mL. Lavare la sacca dell'aria con 2 mL di lavaggio tampone 2x e raccogliere l'estuoso infiammatorio nello stesso tubo di centrifuga.
- Centrifuga a 100 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio. Contare le cellule per quantificare il rapporto neutrofilo utilizzando l'analizzatore automatico di ematologia.
NOTA: Vedere risultati rappresentativi nella figura 2.
4. Induzione del modello murino di artrite adiuvante (AA)
- Sospendere l'adiuvante di Freund (CFA) completa vorticendo almeno 5 s, quindi disegnare 100 - L di sospensione in un iniettore di insulina.
NOTA: Si consiglia di utilizzare un CFA completamente nuovo negli esperimenti per garantire la sterilità. - Anestesizzare i topi come descritto nel passaggio 3.1.1.
- Contrassegnare la zampa prescelta e iniettare 20 L di CFA nello spazio dell'articolazione della caviglia. Iniettare 20 - L di sospensione in quattro punti periarticolari sulla zampa prescelta (80 - L in totale).
- Rimuovere i topi dall'unità di respirazione e mettere i topi trasformati in una nuova camera. Monitorare i topi per assicurarsi che stiano respirando fino a quando non riacquistano la capacità di muoversi.
- Ogni 3 giorni, valutare il diametro articolare misurando il diametro dell'articolazione della caviglia utilizzando un indicatore di spessore della tasca (Figura 3A).
- Ogni 3 giorni, valutare la gravità dell'artrite in base al criterio di punteggio dell'artrite (Figura 3C): 0, normale, nessuna prova di erestesia e gonfiore; 1, l'artrite mipiù, l'eritema e il lieve gonfiore confinati al tarsals o all'articolazione della caviglia; 2, artrite moderata, eritthema e gonfiore lieve che si estende dalla caviglia ai tarsali; 3, grave artrite, eritema e gonfiore moderato che si estende dalla caviglia alle articolazioni metatarsche; 4, l'artrite più grave, l'eritema e il grave gonfiore comprendono la caviglia, il piede e le cifre, o l'ankylosi dell'arto.
5. Colorazione immunostochimica delle sezioni articolari
- Isolamento congiunto
- Sacrificare il topo nella sezione 4 utilizzando la lussazione cervicale dopo l'anestesia con isoflurane. Spruzzare il mouse con 70% di etanolo.
- Rimuovere la pelle e parte del muscolo dalla gamba posteriore con pinzette e forbici. Spruzzare l'articolazione con il 70% di etanolo e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta.
- Fissare l'articolazione della caviglia in 4% paraformaldeide per 2 giorni a RT. Decalcify l'articolazione in 10% EDTA per 1 mese a RT e cambiare il medio settimanale.
- Incorporare il tessuto in paraffina e preparare sezioni di tessuto spesso 4 m.
- Mettere il tessuto in uno stampo marcato con un certo volume di paraffina liquida. Raffreddare brevemente.
- Impostare lo spessore a 4 m e tagliare le fette su un microtoma. Galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua a 43 gradi centigradi.
- Montare le sezioni sugli scivoli e mettere i vetrini in forno a 70 gradi per 2 ore. Per un uso futuro, conservare i vetrini a -20 gradi centigradi.
- Safranin O e colorazione verde veloce delle sezioni articolari
NOTA: le seguenti fasi di colorazione vengono eseguite in RT.- Posizionare i vetrini dal passo 5.1.4.3 in un rack ed eseguire i seguenti lavaggi per reidratare a RT: xilene per 5 min (3x), 100% etanolo per 2 min (2x), 95% etanolo per 2 min (2x), 70% etanolo per 2 min, e 50% etanolo per 15 min.
- Macchie in soluzione verde veloce 0.1% per 5 min.
- Macchie nello 0,1% safranin O soluzione di colorazione per 20 min. Immergere i vetrini nei seguenti lavamenti: 95% etanolo per 2 min (2x), 100% etanolo per 2 min (2x) e xilene per 2 min (2x).
- Montare le sezioni di tessuto e osservare i tessuti al microscopio.
NOTA: Vedere immagini rappresentative nella Figura 4A.
- Colorazione immunoistochimica per visualizzare i neutrofili
- Cuocere le sezioni di paraffina per 2 h a 78 gradi centigradi. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti lavamenti per reidratarsi a RT: xilene per 15 min (2x), 100% etanolo per 5 min (2x), 95% etanolo per 5 min, 80% etanolo per 5 min, H2O per 3 min e PBS per 3 min.
NOTA: Non lasciare asciugare i vetrini in qualsiasi momento durante questo passaggio. - Aggiungere una goccia di buffer di permeabilizzazione per coprire il tessuto. Incubare le sezioni in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi centigradi.
- Risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x). Evitare di sciacquare il tessuto direttamente.
- Eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore utilizzando una caldaia a pressione.
- Disporre i vetrini in un rack. Immergere i vetrini nella caldaia a pressione riempita con buffer di recupero.
- Mettere la caldaia a pressione su un forno a microonde. Impostare il forno a microonde a 600 W e riscaldare i vetrini per 10 min.
- Dopo l'ebollizione, tenere gli spogli nella caldaia a raffreddare a 90 gradi centigradi. Estrarre i vetrini e sciacquarli in PBS per 3 min (3x).
- Quench endogena attività perossidasi in appena preparato 3% H2O2 a 15 min. Sciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).
- Delineare un grande cerchio intorno al campione con una penna idrofobica, evitare di toccare il campione. Blocco con 3% di albumina di siero bovino (BSA) in una camera controllata dall'umidità a 37 gradi centigradi per 60 min.
- Rimuovere la soluzione di blocco. Aggiungete rapidamente 50 -L di anticorpo primario diluito pbS ad ogni sezione. Quindi, incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 4 gradi durante la notte.
NOTA: per diversi anticorpi vengono utilizzati rapporti di diluizione diversi (1:25 per MPO e 1:20 per NE). - Il secondo giorno, estrarre il vassoio e lasciarlo riposare a RT per 30 min. Quindi, risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).
- Aggiungere al tessuto 50 - L di anticorpi secondari diluiti PBS.
NOTA: Sono stati applicati diversi rapporti di diluizione: 1:1,000 per MPO e 1:1.500 per NE. - Incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi centigradi per 30 min. Quindi, risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).
- Sviluppare in diluito 3,3'-diaminobenzidina (DAB) soluzione per 5 min. Tieni d'occhio la reazione in caso di sviluppo di un colore scuro. Sciacquare gli scivoli in acqua distillata.
- Controsta gli scivoli in ematossino per 10 s. Sinsegli s in acqua del rubinetto per 5 min.
- Risciacquare in alcool acido soluzione di differenziazione superveloce alcool per 3 s. Quindi risciacquare nell'acqua del rubinetto per 10 min.
- Immergere i vetrini nei seguenti lavamenti a RT: 80% etanolo per 5 min, 95% etanolo per 5 min, 100% etanolo per 5 min e xilene per 15 min (2x). Fissare il coperchio con la soluzione di montaggio. Osservare il tessuto al microscopio.
NOTA: Vedere immagini rappresentative nella figura 4B.
- Cuocere le sezioni di paraffina per 2 h a 78 gradi centigradi. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti lavamenti per reidratarsi a RT: xilene per 15 min (2x), 100% etanolo per 5 min (2x), 95% etanolo per 5 min, 80% etanolo per 5 min, H2O per 3 min e PBS per 3 min.
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Representative Results
Le cellule di essutazione peritoneale sono state raccolte dal liquido di lavaggio dei topi. Le celle sono state risospese in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo, sovrapposte a due fasi (54,8%/70,2%) sfumatura di densità discontinua (Figura 1A) e centrifugate a 1.500 x g per 30 min. Neutrophils (-95%, 1 x 107 neutrofili/topo) sono state recuperate dall'interfaccia inferiore (Figura 1B).
Sono stati effettuati esperimenti di air such per studiare il reclutamento di neutrofili stimolato da LPS in vivo (Figura 2A). I sottoinsiemi di leucociti nell'exudates della sacca dell'aria sono stati misurati (Figura 2B).
La migrazione dei neutrofili nell'AR è stata valutata tramite il modello murino dell'artrite indotta dall'OC. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo AA ha mostrato un edema significativo nella zampa. Nel gruppo AA, il diametro dell'articolazione della caviglia è aumentato (Figura 3B) e il punteggio di artrite è aumentato costantemente (Figura 3D).
Danno cartilaginele è la sindrome rappresentativa di RA, safranina O-veloce macchiatura della cartilagine verde è stato eseguito per valutare il danno cartilagineto nel topo AA. Come mostrato nella Figura 4A, Sfida CFA ha indotto una grande quantità di infiltrazione da leucocito, significativa erosione della cartilagine e iperplasia sinoviale. I livelli di espressione MPO e NE sono marcatori rappresentativi dell'infiltrazione dei neutrofili. I saggi immunohistochimici sono stati eseguiti per osservare l'infiltrazione dei neutrofili nelle articolazioni. L'espressione MPO e NE è stata notevolmente upregolata nella sezione congiunta (Figura 4B).
Figura 1: Isolamento dei Neutrophil. (A) Le cellule di esurdate peritoneali risospese in 1 mL di supporto completo RPMI-1640 sono state sovrapposte in due fasi (54,8%/70,2%) sfumatura di densità discontinua. (B) Dopo la centrifugazione a 1.500 g per 30 min, i neutrofili (95%, 1 x 107 neutrofili/topo) sono stati recuperati dall'interfaccia inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi del test dell'aria. (A) Illustrazione del saggio dell'aria. (B) Risultati rappresentativi dell'infiltrazione del sottoinsieme di leucocchi nel saggio dell'aria. PBS: controllo; LPS: 1 g/mL LPS. I dati sono presentati come la media - SD. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi del modello murino dell'artrite adiuvante (AA). (A) Il diametro dell'articolazione della caviglia è stato misurato utilizzando un indicatore di spessore della tasca. (B) Il gonfiore articolare è stato valutato in base al diametro del giunto della caviglia (n ) (C) Immagini di ogni colonna sonora dell'artrite. (D) La gravità dell'artrite è stata classificata su una scala di 0-4 punti (n - 7). I dati sono presentati come la media - SD. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi della colorazione della cartilagine verde safranina O-fast e analisi immunohistochimica di sezioni articolari dal controllo e topi AA. (A) Risultati rappresentativi della colorazione della cartilagine verde safrano O-fast delle sezioni articolari. (B) Risultati rappresentativi del livello di espressione di MPO e NE nelle articolazioni della caviglia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Protocolli dettagliati di neutrofili altamente purificati dal sangue periferico7, midollo osseo e tessuti18 sono stati disponibili per lungo tempo. Qui adottiamo un metodo per isolare i neutrofili dal liquido peritoneale19 in cui i neutrofili maturi rimangono inattivati per ulteriori studi anti-infiammatori e antiossidanti.
Abbiamo usato l'esperimento della sacca d'aria per esplorare l'infiltrazione indotta da LPS dei neutrofili in vivo. Questo metodo è stato proposto come un potenziale metodo per misurare direttamente l'infiltrazione cellulare nell'ambiente infiammatorio generale in vivo.
È interessante notare che il saggio della sacca d'aria dimostra solo la funzione del neutrofilo in modo non specifico e rimuove diversi passaggi della cascata di reclutamento del leucocito. Poiché il reclutamento di neutrori in organi specifici può contare su diverse proprietà degli organi, molecole di adesione e chemiochine, esplorare lo stato funzionale dei neutrofili in condizioni specifiche degli organi è di grande importanza per studiare il ruolo che i neutrofili potenzialmente svolgono in alcune malattie3. È stato suggerito che i modelli endpoint sono necessari per studiare l'infiltrazione dei neutrofili. Pertanto, l'esecuzione di macchie immunoistochimiche sulle sezioni articolari dei topi nel modello AA può fornire una prospettiva penetrante sui neutrofili nello spazio articolare. Secondo i nostri dati, un gran numero di neutrofili viene reclutato nel tessuto articolare e serve come prova fondamentale per ulteriori ricerche sull'interruzione dell'infiltrazione di neutrofili per il trattamento dell'AR. Inoltre, sono necessari saggi completi, ad esempio la colorazione verde safranina O-fast, per valutare il modello di malattia per ulteriori studi.
I neutrofili sono il principale sottoinsieme delle cellule infiammatorie infiltranti e fungono da prima linea di difesa contro l'invasione di patogeni o lesioni tissutali20,21. Se i neutrofili si infiltrano nei tessuti in gran numero, vengono secreti alti livelli di citochine e NET, che insieme possono sopraffare i meccanismi di protezione nei tessuti e portare a danni ai tessuti. La lesione dei tessuti stimola ulteriormente l'infiltrazione dei neutrofili, formando così un circolo vizioso22. Interferire con la migrazione cellulare per mezzo di intrappolare le cellule attivate negli organi linfoidi è stato proposto come un importante approccio terapeutico ed è stato applicato in studi clinici con vari effetti collaterali23. Scoprire un nuovo trattamento per regolare contemporaneamente la migrazione dei neutrofili e l'attività infiammatoria è una strategia promettente per il trattamento delle malattie infiammatorie in futuro. Inoltre, se gli agenti di regolazione della motilità sono combinati, la somministrazione di farmaci mediata da neutrofili24 può aumentare la specificità dei farmaci, diminuendo così gli effetti collaterali.
Tuttavia, ulteriori modifiche possono essere combinate per ampliare l'applicazione dei saggi di cui sopra. Ad esempio, nel modello di topo AA, per ottenere l'impressione generale di infiltrazione delle cellule infiammatorie nell'articolazione, i ricercatori sono incoraggiati a digerire envitically le articolazioni per rilasciare le popolazioni di leucociti residenti e quindi applicare la citometria di flusso per contare le popolazioni.
I protocolli qui riportati includono tre modi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili. L'applicazione di questi protocolli è utile per scoprire potenziali trattamenti per l'AR e altre malattie infiammatorie che coinvolgono neutrofili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 81430099 e 31500704), cooperazione internazionale e progetti di scambio (numero di sovvenzione 2014DFA32950), e il programma di ricerca dell'Università di Pechino di medicina cinese ( sovvenzione BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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